一種新疆出血熱病毒免疫層析快速檢測試紙的製作方法

2023-06-07 02:11:31 1

專利名稱：一種新疆出血熱病毒免疫層析快速檢測試紙的製作方法
技術領域：
本發明涉及免疫學檢測方法，特別涉及一種新疆出血熱病毒免g析快速檢測 試紙。
背景技術：
克裡米亞-剛果出血熱病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus ， CCHFV) 是經蜱傳播的蟲媒病毒，屬於布尼亞病毒科(Bunyaviridae)內羅病毒屬 (Nairovirus) 。 CCHFV的基因組為分節段、單股、負鏈RNA,由小(S)、中(M)、 大(L) 3個節,ii且成，分別編碼核蛋白(NP)、糖蛋白(GP)及RNA聚合酶(RNA-d印endent polymerase) 。 CCHFV引起的克裡米亞-剛果出血熱(CCHF)是一種流行於中國新疆 南部、俄國北部、中東、南部歐亞大陸及非洲撒哈拉地區的烈性傳染性疾病，其平 均病死率在IO %~50 %。中國的CCHF於1965年首次-珍斷於南部新疆，後在北疆 地區亦查出抗體，故稱新疆出血熱(XHF)。
CCHFV NP抗原位點亦呈線性分布且性質穩定，是病毒誘導機體產生早期體液 免疫和細胞免疫的主要抗原，這是利用NP進行抗^f企測的理論基5出。
CCHFV的檢測技術主要包括病毒的分離與鑑定、血清學檢查和分子生物學檯訓。
病毒分離要求的生物安全級別高，需在生物安全三級實驗室操作；血清學檢測主要
^Jf]反向間接血凝抑制^r驗(RPHI)、酶聯免疫法(ELISA)、免疫焚光(IFA)等技
^M企測CCHF患者的IgG和IgM抗體；分子生物學主要糹全測CCHFV的核酸，其才斜乍
需要專業的技術人員和PCR儀以及螢光定量PCR儀等儀器。
目前，臨床診斷技術的JL^向為簡便決捷，操作簡單，不需要特定儀器設備 輔助在短時間內即可4斜乍解讀。這些技術中目前應用較廣的A^^Jr析檢測試紙技術，該技術與其他方法比較，優勢在於檢測過程中樣品處理簡單，不需要專門儀 器和人員培訓，非專業技術人員按照說明書即可操作，並可iJki4觀察結果，易於在 中小型企業、基層普及與推廣應用，同時適於現場快速檢測。而目前還沒有將新疆 出血熱病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體應用於免疫層析試紙檢測新疆出血熱病毒的 報導。

發明內容
本發明提供了 一種新疆出血熱病毒免疫層析快速檢測試紙。 為實現本發明的目的，採用如下的技術方案
本發明的一種新疆出血熱病毒免^析快速檢測試紙，包括支撐固定粘村層， 在所述支撐固定粘襯層上依次交疊粘附有樣品吸附層、金標結合墊、纖維素膜層和 吸水材料層，在所述纖維素M^上印製新疆出血熱病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體作 為檢測印跡帶。
上述新疆出血熱病毒免疫層析快速檢測試紙，在所述纖維素膜層上印製羊抗鼠 IgG抗體溶液作為對照印跡帶。
上述新疆出血熱病毒免^析快速檢測試紙，在所述^r標結合墊上吸附有膠體 金標記的新疆出血熱病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體。
本發明的新疆出血熱病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體有中和新疆出血熱病毒的 特性，其效價大於1: 625000,其檢測核衣殼蛋白的線性範圍為lng 20ng,檢測 靈凝為lng。
上述新疆出血熱病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體的製備方法包括如下步驟 (1)構建表M粒將新疆出血熱病毒核衣殼蛋白基因克隆到表達載體上； (2 )重組核衣殼蛋白的誘導表M其純化；
(3)將步驟(2)得到的重組核衣殼蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾細胞與小 鼠骨髓瘤細胞SP2/0融合，間接ELISA篩選陽性孔雜交瘤細胞，取陽性孔雜交瘤細 胞，用有限稀釋法進行克隆化，得到雜交瘤細胞抹，用陽性的雜交瘤細胞注入小鼠劇空，獲小鼠腹水。
上述方法進一步包括如下步驟將得到的腹水佳月ProteinG柱純化，得到核 衣殼蛋白的單克隆抗體。
上述方法步驟(1)中的核衣殼蛋白基因為GenBank登錄號為NC—005302的核 苷酉錄列中的S基因。表達載體為pET30a (+)載體。
上述方法步驟(2)中的誘導表達採用IPTG誘導表達，純化採用Ni柱純化。
本發明建立了 一種新疆出血熱病毒免^析快速檢測試紙，與^y亍性出血熱無
交X^應，可檢測0. 07mg/ml的NP蛋白，有效快速檢測新疆出血熱病毒。


圖1為新疆出血熱NP蛋白在大腸桿菌BL21 (DE3)中的誘導表達的SDS-PAGE電
泳的一個優選實施例的結果圖2為重組NP蛋白的純化的SDS-PAGE電泳的一個優選實施例的結果圖3為單克隆抗體與重組NP蛋白的Western blot分析的一個優選實施例的結
果圖4為膠體金檢測卡的特異性試驗的一個優選實施例的結果圖； 圖5為膠體金檢測卡的靈壽tl"^險的一個優選實施例的結果圖； 圖6為媒介才對以樣品的免疫膠體金檢測的一個優選實施例的結果圖。
脅實施方式
為使本發明更加容易理解，下面結合務沐實施例，進一步闡述^^發明。應理解， 這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍，下列實施例中未^^及的 M實-瞼方法，通常4安照常^見實-瞼方法i^f亍。
實施例一新疆出血熱病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體的製備 (1)構建^#斤疆出血熱病毒核衣殼蛋白基因的重《贈粒
5根據CCHFV毒抹(GenBank登錄號NC—005302 )核芬酸序列合成全長的1458bp S 基因片^殳，基因的5'端和3'分別添加BamHl和XhoI酶切位點。將該片段克隆到 同樣酶切回收的pET30a (+)載體上，獲得重《ibt粒pENP。 (2 )重組核衣殼蛋白的誘導表ii^其純化
將重糹贈粒pENP轉化BL21 (DE3)感受態細i包，才4^單菌落於5ml的LB培養基 (25g/ml的卡那黴素抗性)，37。C培養到OD600約為0. 6左右，加入IPTG使終濃度 到lmmol/L， 25。C誘導培養3h,收集菌體，處理樣品經SDS-PAGE電泳分析，觀察 重組蛋白的表達情況。圖1中第一泳道至第三泳道分別為蛋白質分子量標準、誘導 前後的大腸桿菌和誘導後的大腸桿菌的電泳條帶，結果圖顯示重組E.coli BL21(pENP)誘導3h後出現一條大小約59kDa蛋白條帶，與預期大小一致，這表明 CCHFV的NP蛋白在BL21 (DE3)中獲得了較好表達。
對重組蛋白進行可溶l"生分析，取lml誘導液離心，沉澱重懸於500^ilPBS緩衝 液，並冰浴超聲波(功率為400W,超聲2s，間隔6s,共15個循環)裂解菌液。離 心，保留上清，沉澱重懸於500ji的ddH20。取等體積的上清和沉澱進行SDS-PAGE, 分析目的重組蛋白的可溶性情況。將含有可溶性目的蛋白的上清和含有不可溶蛋白 的沉澱進行SDS-PAGE分析，圖1中第四泳道和第五泳道分別為超聲波破碎後的上 清^J1聲波破碎後的沉澱電泳條帶，結果顯示重組蛋白在上清和沉澱中均有誘導條 帶，但主要以不可溶的包涵^在。
對重組NP蛋白的包涵體進行純化和復性。誘導表達的重組菌林離心收集菌體， 每7. 7g沉澱中加入77ml PBS重懸並置冰浴中超聲波裂解，離心，2. 5g沉澱用8M 尿素(50mMTris.Cl， 200mMNaCl， p朋.O)溶解，上Ni柱，25mM咪唑(50mMTris. Cl, 200mMNaCl， 8M尿素，pH8. 0)沖洗去除雜蛋白，250mM咪哇(50mM Tris. Cl， 200mM NaCl， 8M尿素，pH8. 0h規目的4元原蛋白。2mH艦液用2M尿素(50mM Tris. Cl, 200mM NaCl， pH8. O)透析,然後再用緩衝液(50mM Tris. Cl， 200mM NaCl， pH8. 0 ) 透析，得到重組蛋白的可溶產物。SDS-PAGE結^4明;艦液中的NP蛋白的純度較
6高，純化的蛋白濃度為0. 4mg/ml,見圖2,圖2是重組NP蛋白的純化的SDS-PAGE 的電泳圖，第一泳道為蛋白質分子量標準的電泳條帶，第二泳道為Ni-NTA純化的 NP蛋白的電泳條帶。
(3 )將步驟(2 )得到的重組核衣殼蛋白免疫BALB/c小鼠，將抗原注射免疫6 -8周齡的BALB/c小鼠小鼠10隻，初次為頸背部和戱空注射，其它為劇空注射免 疫，抗原(重組蛋白)劑量為50g/只，免疫3-5次，免疫間隔14天。取其脾細胞 與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0融合，對細胞上清採用間接ELISA進^^全測，測得陽性的 克隆採用有限稀釋法，進行3次亞克隆。篩選得到的陽性雜交瘤細胞免疫小鼠後， 製備腹水。
(4)將步驟(3)得到的腹水佳月ProteinG柱純化，得到核衣殼蛋白的單克 隆抗體。
實施例二新疆出血熱病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體的Western blot特性鑑
定
CCHFV重組NP蛋白經SDS-PAGE電泳後，轉印至硝纖膜上,分別以稀釋後的10B12 和3G5的腹水單克隆抗體為一抗，以HRP-羊抗鼠IgG為二抗進行Western blot鑑 定，同時設pET30a(+)空載體菌液作對照。圖3為3G5的單克隆抗體與重組NP蛋白 的Western blot分析結果圖，第一泳道到第三泳道分別為單克隆抗體1: 200稀釋、 單克隆抗體1: 1000稀釋及單克隆抗體1: 2000稀釋的Western blot的檢測條帶； 該結果顯示，10B12和3G5均能特異性地識別59kDa的NP重組蛋白。
實施例三新疆出血熱病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體的間接免疫螢光H瞼特性
鑑定
製備表達NP蛋白的重組杆狀病毒感染的昆蟲細胞抗原片，在檢測孔中分別加 入10B12和3G5的單克隆抗體作一抗(1: 50稀釋)，37。C反應30min, PBS洗3次,加入FITC標記的羊抗鼠IgG, 37。C^60min, PBS洗3次，焚M微鏡下觀察。 結果，10B12和3G5的單克隆抗體均與Ac-NP感染的細胞反應，出現明顯的綠色熒 光，陰'lt^照無綠色螢光。
實施例四新疆出血熱病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體的配對實驗 用雙抗體夾心ELISA法對篩選的單克隆抗體進行SWt。根據初期的K^"結果， 選擇最佳的一對抗體(10B12和3G5 )進行優化實驗。ELISA結果顯示，使用25 g/ml 的10B12作為一抗包被過夜，HRP標記的3G5作為二^i姿照1: 1000稀釋，4&則的 重組NP蛋白的線性範圍為lng-20ng,檢測靈敏度為lng的NP蛋白。
實施例五雜交瘤細月M朱的篩itA單克隆抗體效價的測定 用間接ELISA法篩選，得到10抹能分泌抗CCHFV的NP蛋白抗體的雜交瘤細胞 抹，免疫小鼠後採集腹水進行單克隆抗體的配對試驗。其中兩個細月&朱產生的單克 隆抗體酉W於結果較好，分別命名為10B12和3G5。用間接ELISA法測定小鼠腹7傳 克隆抗體效價，結果顯示，小鼠腹10B12和3G5的小鼠腹水單克隆抗體效價均大於 1: 625000。
實施例六膠體金才射己蛋白餅的優化
採用粒徑為25 - 30nm的膠體金溶液進行蛋白標記試驗。調節膠體金溶液的pH 值為7. 5,分裝成10管，每管lml。將待標記抗體以5ng/ml ~ 25pg/ml作系列稀 釋後，分別取lml加入l管膠體金溶液內。對照管加lml稀釋液。當加入的蛋白 量達到或超it^交體金的最^^l定量時，膠體金溶液保持紅色不變；若加入的蛋白 量少於膠體金的最^^t、定量時，膠體金溶液將出現由紅變藍的聚沉現象。則在所 有呈現紅色的管中，選擇蛋白含量最低的一管為含穩定lml膠體金所需的抗體量。 並將標記好的金標抗體(金子)分別按10cm2/1111、 20cmVml、 30cmVml、 40cm7ml、50cmVml均勻地鋪在玻璃纖維膜上，在溫度在30~35°C,溼度在10% ~30%條 件下恆溫乾燥。選擇質控品(陽性與陰性)顯色最好的情況下的金標物的制^ 件為使用參數。參數確定為膠體金粒徑為25~30nm;與蛋白質標記的量為10-15pg蛋白/ml膠體金；膠體金結合物(金標墊)稀釋參數為15 20cmVml。
實施例七膜工藝^H^f匕
膜工藝^f牛優化，包括對膜孔徑與材質的優化、緩衝系統的選擇優化、質控線 (C線)的選擇、金標記^f牛優化等方面。最後確定使用膜135和PBS緩衝液，羊 抗鼠血清作為質控(C線)。金標記^f牛優化結a明當包被6. 2mg/ml 10B12單抗， 3G5單抗標記膠體金作為金標結合物時的顯色^最佳。
實施例八製備膠體^f^測卡
以上述摸索的最佳^f牛ii行月交體^r才全測卡的製備。1. lmg/ml和2mg/ml的NP 純化蛋白作用10min內均有較強條帶產生，且前者產生的條帶顏色較深，見圖4。 圖4為膠體金檢測卡的特異性試驗。l為正常人的血清，2 4為流行性出血熱陽性 人血清，5為兔血清，6和7分別為2mg/ml和1. lmg/ml的NP純化蛋白檢測結果。 稀釋2倍、3倍和5倍的4企測蛋白(濃度分別0. 55mg/ml、 0. 37mg/ml和0. 22mg/ml) 均可顯現陽性條帶，見圖5,圖5為膠體金檢測卡的靈敏度試驗。1~3分別為 1. lmg/ml NP純化蛋白稀釋2倍、3倍和5倍的^^^吉果。該檢測卡與/ok清、流 行性出血熱陽性人血清、兔血清、生理鹽水、鼠血清等均無交叉反應。
實施例九媒介^^財示本的
3射某介用PBS研磨，加入純化的NP蛋白作為陽4封梨i^羊本。結果顯示，當模 擬樣本中含有0. 55mg/ml、 0. 28mg/ml和0. 14 mg/ml的NP蛋白時，可看到明顯的 陽性條帶。媒介中NP蛋白濃度為0. 07mg/ml時，10min後肉眼可觀察到弱檢測帶， 結果見圖6。圖6為媒介衝勤以樣品的免疫膠體金檢測結果圖，其中，各標號分別代
9表1，北京幼蜱研磨液；2,撫遠幼蜱研磨液；3和4，北京幼蜱研磨液+0. Mmg/ml NP蛋白；5和6,才極幼蜱研磨液+0. 55mg/ml NP蛋白；7,北京幼蜱研磨液十 0. 28mg/ml NP蛋白；8， ^1^幼蜱研磨液+ 0. 28mg/ml NP蛋白；9,北京幼蜱研磨 液+O. 14mg/ml NP蛋白；10,撫遠幼辨^11磨液+0. 14mg/ml NP蛋白；11，北京幼 蜱研磨液+ 0. 07mg/ml NP蛋白；12，撫遠幼蜱^1:磨液+0. 07mg/ml NP蛋白。
#所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本發明 保護範圍的限制，儘管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術 人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明 技術方案的實質和範圍。
權利要求
1. 一種新疆出血熱病毒免疫層析快速檢測試紙，包括支撐固定粘襯層，在所述支撐固定粘襯層上依次交疊粘附有樣品吸附層、金標結合墊、纖維素膜層和吸水材料層，其特徵在於在所述纖維素膜層上印製新疆出血熱病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體作為檢測印跡帶。
2. 才艮據權利要求1所述的一種新疆出血熱病毒免^^析快檢速測試紙，其特
3. 根據權利要求1所述的一種新疆出血熱病毒免^^析快速檢測試紙，其特 4球於在所述金標結合墊上吸附有膠體金標記的新疆出血熱病毒核衣殼蛋白的單 克隆抗體。
全文摘要
本發明提供了一種新疆出血熱病毒免疫層析快速檢測試紙。本發明的一種新疆出血熱病毒免疫層析快速檢測試紙包括支撐固定粘襯層，在所述支撐固定粘襯層上依次交疊粘附有樣品吸附層、金標結合墊、纖維素膜層和吸水材料層，在所述纖維素膜層上印製新疆出血熱病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體作為檢測印跡帶。該新疆出血熱病毒免疫層析快速檢測試紙的纖維素膜層上印製羊抗鼠IgG抗體溶液作為對照印跡帶。該檢測試紙的金標結合墊上吸附有膠體金標記的新疆出血熱病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體。本發明的一種新疆出血熱病毒免疫層析快速檢測試紙有效快速檢測新疆出血熱病毒。
文檔編號G01N33/577GK101498727SQ20091003718
公開日2009年8月5日 申請日期2009年2月13日 優先權日2009年2月13日
發明者師永霞, 幸蘆琴, 李小波, 燁 洪, 相大鵬, 夔 鄭, 郭波旋, 鍾玉清, 黃吉城 申請人:廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心