一種艱難梭菌a、b毒素膠體金檢測試紙條、其製備方法及其應用的製作方法

2023-06-04 06:10:41

專利名稱：一種艱難梭菌a、b毒素膠體金檢測試紙條、其製備方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物檢測領域，具體涉及一種艱難梭菌A、 B毒素膠 體金檢測試紙條、其製備方法及其應用。
背景技術：
艱難梭菌(Clostridium difficile)屬厭氧性細菌，是梭菌屬的 一個 成員。梭菌屬可分為幾個群，其中幾個對人具有致病性的，最著名的 有產氣莢膜梭菌、破傷風梭菌和肉毒梭菌。艱難梭菌是造成抗生素相 關腹瀉及偽膜性結腸炎的病原菌。
艱難梭菌芽孢菌的細菌平時寄生在人類腸道中。如果過量服用抗 生素致使菌群增長速度過快，就會引發嚴重的炎症。該菌能引起偽膜 性腸炎，90~95%的偽膜性腸炎患者糞便中能檢出本菌。塗片染色可 見粗大革蘭氏陽性桿菌，位於菌體近端至頸端可見呈卵圓形芽胞，可 結合臨床作出早期診斷。艱難梭菌的一種流行菌株產生高水平的A、 B毒素，毒素A有腸毒性，毒素B有細胞毒性。毒素A也有一定的細胞 毒性作用，但比毒素B小。毒素A和B是艱難梭菌的主要致病因子，可 幹擾腸道上皮細胞的肌動蛋白骨架，使細胞喪失功能。目前實驗室檢 驗可幫助診斷艱難梭菌相關性腹瀉(CDAD)。
由艱難梭菌引發的醫院內感染日益被人們重視，艱難梭菌產毒株 的快速診斷、鑑定對確定病源、防止及控制醫院內感染的傳播和有 效治療極其重要。組織培養的方法檢測艱難梭菌的產毒株，需要特 殊的組織培養條件，操作繁瑣複雜，且檢測周期長，用於院內感染的 監控難以普及。釆用免疫學方法檢測艱難梭菌毒素A&B則逐漸得以 應用。
艱難梭菌感染的臨床表現輕重不一，且無特異性，診斷主要依賴 於輔助檢查，方法很多，各自的敏感性和特異性相差較大。艱難梭菌
的分離培養一般用環絲氨酸-甲氧頭孢噻嗪-果糖-瓊脂(CCFA)選擇培 養基，其敏感性和特異性分別為97%和93%;細胞培養法測定細胞毒 素的敏感性和特異性分別為67%和99%。免疫學測定毒素的方法(如 放免、乳凝、ELISA等)敏感性和特異性在68。/。和95。/。左右。前兩種方 法費時，耗物，但準確可靠，後者簡便快速可用於篩選。近年有文獻 報導用基因探針方法檢測艱難梭菌感染，其敏感性和特異性有待進一 步評價。此外，對於重症病人及時行纖維腸鏡檢查，常可發現特異性 的偽膜，具有確診意義。
但通常認為艱難梭菌診斷以毒素檢測和培養細胞的毒素中和試 驗為"金標準"。產毒素培養是檢測艱難梭菌分離菌株的毒素產生情 況，並具有較高的敏感性和相當的特異性。通常腸毒素的檢測釆用瓊 脂雙擴散法、ELISA法、家兔腸管結紮試驗、反向間接血球凝集試驗、 小鼠致死試驗、豚鼠皮膚試驗等，而直接糞便標本毒素驗中和實驗， 在已確診的CDAD患者中，會有15~38%檢測不到毒素。但以上方法 均存在需專業人員在特定的實驗室，需要一定的設備和儀器，操作繁 瑣，時間長等缺點。
膠體金免疫層析法(Immunochromatography Assay)始於上世紀 90年代中期，是在免疫滲濾法的基礎上發展起來的。它是免疫親和技 術、印跡技術、免疫標記技術和層析技術的組合。將包被抗原、膠體 金標記抗體固相化，與樣本吸附材料等組合在一起，製備為免疫層析 診斷試條/板，使用時只需要把試紙條下插入樣本溶液，數分鐘就可 以判斷結果。與免疫滲濾法比較，穩定性好，操作更簡便、快速，且 由於為試條/試板形式，無需低溫保存，儲運方便。

發明內容
本發明的目的是提供一種使用方便、快捷，用於檢測艱難梭菌A、 B毒素的試紙條，檢測人類糞便中艱難梭菌A、 B毒素，用於艱難梭菌
感染的輔助診斷。
本發明的另一目的是提供一種艱難梭菌A、 B毒素膠體金檢測試
紙條的製備方法。
本發明的再一目的是提供一種艱難梭菌A、 B毒素膠體金檢測試
紙條的應用。
本發明提供了一種艱難梭菌A、 B毒素膠體金檢測試紙條，其包 含同時包被艱難梭菌A毒素的單克隆抗體或多克隆抗體、抗艱難 梭菌B毒素的單克隆抗體或多克隆抗體和二抗IgG三個條帶的硝酸 纖維膜；及含有膠體金標記的艱難梭菌A、 B毒素的單克隆抗體的玻 璃纖維膜。
其中，所述艱難梭菌A毒素的單克隆抗體的位點特異性的針對A 毒素羧基端320個胺基酸的功能區。
所述艱難梭菌B毒素單克隆抗體的位點特異性的針對B毒素羧基 端的615個胺基酸的抗原區CDB3。
艱難梭菌A、 B毒素的單克隆抗體或抗艱難梭菌A、 B毒素特異 性抗原的多克隆抗體是用原核表達的基因工程抗原免疫Bab/c純系小 鼠製備獲得。
所述的二抗IgG為抗鼠IgG抗體。
所述艱難梭菌A毒素的單克隆抗體或多克隆抗體的包被濃度為 1.2±0.2mg/ml,抗艱難梭菌B毒素的單克隆抗體或多克隆抗體的包被 濃度為1.5±0.1mg/ml。所述抗鼠IgG抗體的濃度為2±0.2mg/ml。
所述玻璃纖維膜中膠體標記的艱難梭菌A、 B毒素的單克隆抗體 的pH值為7.6~8.0，膠體金和抗體的配比為以18 24嗎/ml膠體金加 入艱難梭菌A、 B毒素的單克隆抗體。
本發明所述艱難梭菌A、 B毒素膠體金檢測試紙條，還包括反應 支持物、金標抗體保護膜和吸水墊，所述反應支持物上依次相互搭接
粘貼的金標抗體保護膜、玻璃纖維膜、硝酸纖維膜和吸水墊。
反應支持物優選PVC板；吸水墊優選濾油紙；金標抗體保護膜 同時具有吸水功能，優選用聚脂膜、玻璃纖維或濾紙纖維。
本發明所述的艱難梭菌A、B毒素膠體金檢測試紙條的製備方法，
包括如下步驟
1) 製備艱難梭菌A、 B毒素的單克隆抗體或抗艱難梭菌A、 B 毒素特異性抗原的多克隆抗體；
2) 硝酸纖維膜的製備艱難梭菌A毒素的單克隆抗體或多克隆抗 體的包被濃度為1.2士0.2mg/ml，抗艱難梭菌B毒素的單克隆抗體或多 克隆抗體的包被濃度為1.5±0.1mg/ml，抗鼠IgG抗體包被濃度為 2±0.2mg/ml,噴於硝酸纖維膜上，分別形成檢測線和對照線，且於37 r中乾燥2小時，備用；
3)玻璃纖維膜的製備艱難梭菌A、 B毒素的單克隆抗體標記 膠體金調整抗體pH值為7.6 8.0,以18 24ng/ml膠體金加入艱難梭菌 A、 B毒素的單克隆抗體，經穩定劑(含0.05。/。BSA， pH8.0， O.OlMTris 緩衝液)處理後，按每平方釐米65ul的量均勻吸附於玻璃纖維膜上， 冷凍乾燥，備用；
4)最後在反應支持物上依次相互搭接粘貼金標抗體保護膜、玻 璃纖維膜、硝酸纖維膜和吸水墊。
本發明所述艱難梭菌A、 B毒素膠體金檢測試紙條在檢測艱難梭 菌A、 B毒素中的應用。
本發明釆用純化的艱難梭菌A、 B毒素的單克隆抗體或抗艱難梭 菌A、B毒素的多克隆抗體和抗鼠IgG分別固相於硝酸纖維膜上(NC 膜)，結合膠體金標記的艱難梭菌A、 B毒素的單克隆抗體，應用膜 層析雙抗體夾心法的原理檢測標本中的艱難梭菌A、 B毒素。
本發明的試紙條利用膠體金標記技術和膜層析技術，用於快速定 性半定量檢測樣本中可能存在的艱難梭菌A、 B毒素，達到快速條檢
病人，及時控制疫情的目的。節省了大量人力物力，方便、快速、簡 捷，不需特殊儀器設備，不需專業培訓，結果清晰易辨，操作簡單， 易於推廣，適合基層，適合於現場檢測和流行病學調查，對艱難梭菌 的感染診斷起到輔助作用。


圖1A為本發明艱難梭菌A、 B毒素試紙條的正面示意圖； 圖1B為本發明艱難梭菌A、 B毒素試紙條的側面示意圖； 其中，1:吸水墊 2:硝酸纖維膜(T1:艱難梭菌A毒素的單克隆抗體或抗艱難梭 菌A毒素的多克隆抗體的條帶；T2:艱難梭菌B毒素的單克隆抗體 或抗艱難梭菌B毒素的多克隆抗體的條帶；C:包被抗鼠IgG的質控 條帶)
3:含有膠體金標記艱難梭菌A、 B毒素的單克隆抗體的玻璃纖
4:金標抗體保護膜 5:反應支持物
圖2為本發明試紙條檢測結果示意圖。
從左至右依次為Tl、 T2、 C兩條線陽性；C 一條線陰性；T、 C兩條線陰性，無效。
具體實施例方式
以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。 若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟 知的常規手段。
實施例l艱難梭菌A毒素基因工程抗原的製備 (1)目的基因的獲得
根據目的基因片段序列(GenBank登錄號為NC009012)及 pGEX-4T-1 (Pharmacia)表達載體的特點設計兩端含有限制性內協酶
￡coi l、 Wol酶切位點的引物
5 ' TCCGAATTGGGCCTCAACTGGTTATACAAGT 3' 5 ' GTGCTCGAGAGGGGCTTTTACTCCATCAAC3' 然後，從基因組中擴增出目的基因片斷，擴增條件95'C變性
5min; 95。Clmin， 49.8。Clmin， 70°C1 min，進行35個循環；最後70
。C延伸10min。
(2) 目的基因的克隆和陽性重組子的篩選 PCR擴增產物電泳後切膠回收，與PMD-18T克隆載體16t:過夜連
接後，轉化到DH5a感受態細胞中，挑取單克隆菌株，37'C過夜培養， 提取質粒後，以質粒為模板進行PCR鑑定陽性克隆菌株，測定序列。
(3) 融合表達載體的構建
用限制性內切酶五coi I、 ^al分別酶切陽性重組子和pGEX-4T-l, 1 %瓊脂糖電泳切膠回收目的片段和pGEX-4T- l雙酶切後的大片段，用 T4連接酶將兩者16。C過夜連接，連接產物轉入BL21感受態細胞，LB 固體培養基培養8 10小時，挑取單菌落培養過夜後提取質粒，用PCR 及限制性內切酶&oRI、 ^T2oI雙酶切分別鑑定，PCR產物和酶切產物 用1%瓊脂糖電泳進行分析，篩選陽性克隆，將重組的質粒測序。
(4) pGEX-A融合蛋白的誘導表達 篩選出的陽性克隆菌在LB培養基中搖菌培養過夜後，將過夜菌按
照l: 100的比例接種至1000mlLB液體培養基中，37。C搖床培養。基 因轉化菌在接種後2小時為最佳誘導時機(OD600nm0.5), IPTG濃'C 0.3mmol/L, 29'C誘導8小時，目的蛋白存在於細胞裂解液上清中。 (5 ) pGEX-A融合蛋白的純化、鑑定
將(4)中1000ml菌液12000r/m、 4。C離心，棄上清，將菌體用 細胞裂解液裂解，使用含有GST標籤的親和層析柱子純化融合蛋白， 用GST-融合蛋白純化試劑盒(B-PER細菌GST標籤融合蛋白柱式純 化Kit貨號78200賽默飛世爾科技)，按試劑盒推薦步驟和體系進
行純化，純化產物進行SDS-PAGE電泳以判斷純化效果，通過紫外 薄層測得產率在95%以上。
融合蛋白的Western-Blot鑑定
切取一半膠用BioRad公司生產的半乾電轉儀轉於硝酸纖維素膜 上，進行印跡試驗， 一抗為A毒素單抗(北京博奧森生物技術有限公 司)，TMB顯色後，結果有特異性蛋白條帶出現。 實施例2:艱難梭菌B毒素基因工程抗原的製備
(1) 目的基因的擴增 參考GenBank收錄的CdVPI10463基因序列，設計引物，並在其5'
端加上合適的限制性核酸內切酶的酶切位點
上遊引物5，TCCGAATTCGCTTATGTCAACTAGTGAA 3， 下遊引物5，GCACTCGAGTTCACTA ATCACT AATTC 3，
反應體系共50ul:上遊引物(20pmol/L)M,下遊引物 (20pmol/L )lul,細菌DNA模板2ul， dd H20 44ul,加入PCR擴增管中(已 加入PCRbuffer、 pfU酶和dNTPs)。反應條件94。C變性45s， 60°C 退火60s， 72°C延伸150s， 39個循環後，72。C再延伸10min。 1%瓊脂 糖凝膠電泳觀察擴增結果。
(2) 目的基因的克隆和陽性重組子的篩選 PCR擴增產物電泳後切膠回收，與PMD-18T克隆載體16'C過夜連
接後，轉化到DH5a感受態細胞中，挑取單克隆菌株，37t:過夜培養， 提取質粒後，以質粒為模板進行PCR鑑定陽性克隆菌株，測定序列。
(3) 融合表達載體的構建
用限制性內切酶五coi I、 ^zoI分別酶切T/重組子和pGEX-4T-l， 1% 瓊脂糖電泳切膠回收目的片段和pGEX-4T-1雙酶切後的大片段，用T4 連接酶將兩者16'C過夜連接，連接產物轉入BL21感受態細胞，LB固 體培養基培養8 10小時，挑取單菌落培養過夜後提取質粒，用PCR及 限制性內切酶^co及I、 J^oI雙酶切分別鑑定，PCR產物和酶切產物用1%瓊脂糖電泳進行分析，篩選陽性克隆，將重組的質粒測序。
(4) pGEX-B融合蛋白的誘導表達 篩選出的陽性克隆菌在LB培養基中搖菌培養過夜後，將過夜菌
按照l: 100的比例接種至1000mlLB液體培養基中，37"C搖床培養。 克隆基因轉化菌在接種後2小時為最佳誘導時機(OD600nm 0.5)， IPTG濃。C 0.3mmol/L， 29。C誘導8小時，目的蛋白存在於細胞裂解液 上清中。
(5) pGEX-B融合蛋白的純化、鑑定
將(4)中1000ml菌液12000r/m、 4°C離心，棄上清，將菌體用 細胞裂解液裂解，使用含有GST標籤的親和層析柱子純化融合蛋白， 用GST-融合蛋白純化試劑盒(B-PER細菌GST標籤融合蛋白柱式純 化Kit貨號78200賽默飛世爾科技)，按試劑盒推薦步驟和體系進 行純化，純化產物進行SDS-PAGE電泳以判斷純化效果，通過紫外 薄層測得產率在95%以上。
融合蛋白的Western-Blot鑑定
切取 一 半膠用B ioRad公司生產的半乾電轉儀轉於硝酸纖維素膜 上，進行印跡試驗， 一抗為B毒素單抗(北京博奧森生物技術有限公 司)，TMB顯色後，結果有特異性蛋白條帶出現。 實施例3艱難梭菌A毒素單克隆抗體的研製 (1)免疫小鼠
A毒素基因工程抗原從-20 °C低溫冰箱取出溶解後，給BALB/C小 鼠背部皮下注射(0.2ml/只)，間隔10天。融合前3曰，在小鼠腹腔以 抗原0.15ml進行攻擊。免疫效果用ELISA法進行檢測。 (2)骨髓瘤細胞
SP2/0骨髓瘤細胞用時將存儲在液氮罐中的SP2/0細胞復甦，在 含有10%小牛血清DMEM培養基中培養48 72小時，待細胞生長良好， 細胞渾圓、透亮、大小均一、排列整齊、呈對數分裂，準備融合。(3) 細胞融合
製備好的SP2/0細胞和免疫的BALB/C小鼠的脾淋巴細胞分別配 製成2 x 10々ml和l x loVml。各取lml室溫下混合。用0.8ml， 50。/。的PEG (分子量1500)作為融合劑；培養液用10。/。小牛血清DMEM。
(4) 陽性孔的檢測和篩選
ELISA法檢測。包被A毒素抗原酶標板。對融合細胞的培養上清 液進行檢測，選擇ELISA效價OD值大於1.0的陽性孔進行亞克隆。共 檢出陽性克隆34株，選擇ll株進行亞克隆操作。
(5) 單抗細胞株的亞克隆 用有限稀釋法對陽性克隆細胞株進行克隆化篩選。對篩選的的陽
性克隆經過凍存、復甦、傳代等過程，最終獲得7株可穩定分泌特異 性抗艱難梭菌A毒素的單克隆抗體細胞株。
(6) 單克隆抗體細胞株檢定
細胞株核型分析對上述雜交瘤細胞染色體進行檢測為96條；證 明他們是SP2/0骨髓瘤與小鼠細胞的雜交瘤細胞。
細胞株穩定性對7株產生單克隆抗體的雜交瘤細胞株經連續克 隆化檢測單克隆抗體陽性率100%,在體外傳代5個月，並經反覆凍存 復甦均能達到保持穩定的分泌抗體，培養上清ELISA效價大於1: 1000。
實施例4:抗艱難梭菌A毒素單克隆抗體的檢定 (1)單抗腹水製備
小鼠SPF級小鼠，經檢查無鼠源病毒汙染，在腹水生產過程中 如發現動物不健康、咬傷、感染者應棄掉。
細胞株擴大培養取生產批細胞管l支復甦，加營養液擴大培養， l只生產細胞只用一次，不再凍存。
雜交瘤細胞株接種製備腹水均需在無菌條件下進行，注射雜交 瘤細胞之前，每隻小鼠腹腔注射液體石蠟0.5ml。 一周後每隻小鼠腹
腔注射雜交瘤細胞l 3xl0V0.2ml。
腹水採集注射細胞株7 10天，或小鼠瀕死前一次採集腹水，置 -20°0保存。
(2) 單克隆抗體的提純
採用硫酸銨沉澱法粗提，進而用HiTraprProteinA柱純化，經SDS -PAGE電泳檢定，僅顯示單一蛋白帶。
(3) 抗體親合力測定
釆用NaSCN競爭ELISA實驗，測定其ED50的下降值，來間接反 映其抗體親合力的大小。
(4) 亞型檢定
釆用免疫擴散法對細胞培養上清的單抗進行Ig亞類的檢測。
(5) 抗原位點檢定
用相加ELISA法對7株單抗的抗原結合位點進行檢測。從而篩選 出配對單克隆抗體。
實施例5艱難梭菌B毒素單克隆抗體的研製
(1) 免疫小鼠
B毒素基因工程抗原從-2(TC低溫冰箱取出溶解後，給BALB/C小 鼠背部皮下注射(0.2ml/只)，間隔10天。融合前3曰，在小鼠腹腔以 抗原0.15ml進行攻擊。免疫效果用ELISA法進行檢測。
(2) 骨髓瘤細胞
SP2/0骨髓瘤細胞用時將存儲在液氣罐中的SP2/0細胞復甦，在 含有10。/。小牛血清DMEM培養基中培養48 72小時，待細胞生長良好， 細胞渾圓、透亮、大小均一、排列整齊、呈對數分裂，準備融合。
(3) 細胞融合
製備好的SP2/0細胞和免疫的BALB/C小鼠的脾淋巴細胞分別配 製成2 x 17/ml和l x 108/ml。各取lml室溫下混合。用0.8ml， 50。/。的PEG (分子量1500)作為融合劑；培養液用10。/。小牛血清DMEM。
(4) 陽性孔的檢測和篩選
ELISA法檢測。包被B毒素抗原酶標板。對融合細胞的培養上清 液進行檢測，選擇ELISA效價OD值大於1.0的陽性孔進行亞克隆。共 檢出陽性克隆28株，選擇9株進行亞克隆操作。
(5) 單抗細胞株的亞克隆 用有限稀釋法對陽性克隆細胞株進行克隆化篩選。對篩選的的陽
性克隆經過凍存、復甦、傳代等過程，最終獲得5株可穩定分泌特異 性抗艱難梭菌B毒素的單克隆抗體細胞株。
(6) 單克隆抗體細胞株檢定
細胞株核型分析對上述雜交瘤細胞染色體進行檢測為96條；證 明他們是SP2/0骨髓瘤與小鼠細胞的雜交瘤細胞。
細胞株穩定性對5株產生單克隆抗體的雜交瘤細胞株經連續克 隆化檢測單克隆抗體陽性率100%,在體外傳代5個月，並經反覆凍存 復甦均能達到保持穩定的分泌抗體，培養上清EUSA效價大於1: 1000。
實施例6:抗艱難梭菌B毒素單克隆抗體的檢定
(1) 單抗腹水製備
小鼠SPF級小鼠，經檢查無鼠源病毒汙染，在腹水生產過程中 如發現動物不健康、咬傷、感染者應棄掉。
細胞株擴大培養取生產批細胞管l支復甦，加營養液擴大培養， l只生產細胞只用一次，不再凍存。
雜交瘤細胞株接種製備腹水均需在無菌條件下進行，注射雜交 瘤細胞之前，每隻小鼠腹腔注射液體石蠟0.5ml。 一周後每隻小鼠腹 腔注射雜交瘤細胞1 3 x 106/0.2ml。
腹水釆集注射細胞株7 10天，或小鼠瀕死前一次釆集腹水，置 -2(TC保存。
(2) 單克隆抗體的提純
採用硫酸銨沉澱法粗提，進而用HiTraprProteinA柱純化，經SDS -PAGE電泳檢定，僅顯示單一蛋白帶。
(3) 抗體親合力測定
採用NaSCN竟爭ELISA實驗，測定其ED50的下降值，來間接反 映其抗體親合力的大小。
(4) 亞型檢定釆用免疫擴散法對細胞培養上清的單抗進行Ig亞類 的檢測。
(5) 抗原位點檢定用相加ELISA法對5株單抗的抗原結合位點進行 檢測。從而篩選出配對單克隆抗體。
實施例7艱難梭菌A、 B毒素膠體金快速檢測試紙條(參見圖1 )
(1) 膠體金抗體結合物的製備
經實驗確定，艱難梭菌A、 B毒素單克隆抗體膠體金標記的最佳 pH值為8.0，膠體金和抗體的配比為22嗎/ml膠體金。標記膠體金經穩 定劑(含0.5。/。BSA， pH8.0， O.OlMTris緩衝液)處理後，按每平方釐 米65pl的量，取膠體金-抗體結合物溶液，均勻吸附於玻璃纖維膜上， 冷凍乾燥，並在乾燥環境中保存。
(2) 包被抗體於硝酸纖維膜 艱難梭菌A毒素的單克隆抗體包被濃度為1.2±0.2mg/ml，抗艱難
梭菌B毒素的單克隆抗體的包被濃度為1.5士0.1mg/ml，抗鼠IgG抗體包 被濃度為2士0.2mg/ml，噴於硝酸纖維膜上，分別形成檢測線和對照線， 且於37'C中乾燥2小時，備用；把固定有抗體的硝酸纖維置37'C烤箱 中乾燥2小時。乾燥環境中保存備用。
(3) 艱難梭菌A、 B毒素膠體金快速檢測試紙條
反應支持物5為6.5cm x 0.4cmPCV板；吸水墊1為2cm x 0.4cm 的濾油紙；1.8cm x 0.4cm的硝酸纖維膜2依次包被抗鼠IgG,艱難梭 菌A毒素的單克隆抗體、抗艱難梭菌B毒素的單克隆抗體，含有0.4cm x0.4cm膠體金標記的艱難梭菌A、B毒素的單克隆抗體玻璃纖維膜3;
金標抗體保護膜4為2.7cm x 0.4cm的聚脂膜；即形成了艱難梭菌A、 B毒素膠體金快速檢測試紙條。
(4)艱難梭菌A、 B毒素膠體金快速檢測試紙條特異性及敏感度實 驗
用艱難梭菌A、 B毒素膠體金快速檢測試紙條檢測基因工程抗原 標本，其A抗原的最低檢出量為5ng/ml， B抗原的最低檢出量為 2ng/ml。
根據本產品的檢測對象為糞便，設計檢測如下的陰性質控品，包 括大腸桿菌、Ol群霍亂弧菌、0139群霍亂弧菌、空腸彎曲菌、痢 疾桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、副溶血弧菌、正常糞便，血便，結果均為 陰性，表明本產品與上述樣品無交叉反應。
實施例8艱難梭菌A、 B毒素膠體金快速檢測試紙條(參見圖1 )
反應支持物5為6. 5cm x 0.4cmPCV板；吸水墊1為2cm x 0.4cm 的濾油紙；1.8cm x 0.4cm的硝酸纖維膜2依次包被抗鼠IgG，艱難梭 菌A毒素的多克隆抗體、抗艱難梭菌B毒素的多克隆抗體，含有0.4cm x 0.4cm膠體金標記的艱難梭菌A、B毒素的單克隆抗體玻璃纖維膜3; 金標抗體保護膜4為2.7cm x 0.4cm的玻璃纖維；即形成了艱難梭菌 A、 B毒素膠體金快速檢測試紙條。
實施例9檢測方法(參見圖2)
將標本放入裝有稀釋液的小瓶內，將實施例7或8試紙條"4" 處插入瓶內(直至觀察完結果後方可取出試紙條)，樣品中的液體吸 起上行，10 15分鐘判讀。
結果
如含有艱難梭菌A、 B毒素，則與試紙條上膠體金標記的艱難梭 菌A、 B毒素的單克隆抗體形成相應的複合物，上行與包被在硝酸纖 維膜上的艱難梭菌A、 B毒素的單克隆抗體或抗艱難梭菌A、 B毒素 的多克隆抗體，形成紅色線條，即在T處形成紅色條帶。
無論是否含有相對應的抗原，膠體金標記艱難梭菌A、 B毒素的
單克隆抗體繼續向上爬行與包被在膜上的抗鼠IgG形成紅色沉澱線， 即在"C"處形成紅色條帶。此線是質控線，如膠體金失效，此線就 不會出現，說明試紙條失效。
雖然，上文中已經用 一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳 盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本 領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎 上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。
序列表
北京莊笛浩未生物醫學科技有限公司
〈120> —種艱難梭菌A、 B毒素膠體金檢測試紙條、其製備方法及其應用

4
Patentln version 3. 3
1
31
〈212〉 ■ <213〉人工序列
<400〉 1
tccgaattgg gcctcaactg gttatacaag t
<210〉 2
<211〉 30
〈212〉 腦A 人工序列
〈400〉 2
gtgctcgaga ggggctttta ctccatcaac
31
30
3
28
腿 〈213〉人工序列
3
tccgaattcg cttatgtcaa ctagtgaa 28
4
27
DNA 人工序列
4
gcactcgagt tcactaatca ctaattc 2權利要求
1、一種艱難梭菌A、B毒素檢測試紙條，其特徵在於，其包含同時包被艱難梭菌A、B毒素的單克隆抗體或抗艱難梭菌A、B毒素特異性抗原的多克隆抗體和二抗IgG三個條帶的硝酸纖維膜(2)；及含有膠體金標記的艱難梭菌A、B毒素的單克隆抗體的玻璃纖維膜(3)。
2、 根據權利要求1所述艱難梭菌A、 B毒素檢測試紙條，其特 徵在於，所述艱難梭菌A毒素的單克隆抗體的位點特異性的針對A 毒素羧基端320個胺基酸的功能區。
3、 根據權利要求1或2所述艱難梭菌A、 B毒素檢測試紙條， 其特徵在於，所述艱難梭菌B毒素單克隆抗體的位點特異性的針對B 毒素羧基端的615個胺基酸的抗原區CDB3。
4、 根據權利要求1-3任意一項所述艱難梭菌A、 B毒素檢測試 紙條，其特徵在於，所述的二抗IgG為抗鼠IgG抗體。
5、 根據權利要求1-4任意一項所述艱難梭菌A、 B毒素檢測試 紙條，其特徵在於，所述玻璃纖維膜中膠體標記的艱難梭菌A、 B毒 素的單克隆抗體的pH值為7.6 8.0,膠體金和抗體的配比為 18 24jig/ml膠體金。
6、 根據權利要求1-5任意一項所述艱難梭菌A、 B毒素檢測試 紙條，其特徵在於，所述艱難梭菌A毒素的單克隆抗體或多克隆抗 體的包被濃度為1.2±0.2mg/ml,抗艱難梭菌B毒素的單克隆抗體或多 克隆抗體的包被濃度為1.5±0.1mg/ml,所述抗鼠IgG抗體的濃度為 2±0.2mg/ml。
7、 根據權利要求1-6任意一項所述艱難梭菌A、 B毒素檢測試 紙條，其特徵在於，還包括反應支持物(5)、金標抗體保護膜(4) 和吸水墊(1),所述反應支持物(5)上依次相互搭接粘貼的金標抗 體保護膜(4)、玻璃纖維膜(3)、硝酸纖維膜(2)和吸水墊(1)。
8、 一種製備權利要求7所述的艱難梭菌A、 B毒素檢測試紙條 的方法，其特徵在於，包括如下步驟1)製備艱難梭菌A、 B毒素的單克隆抗體或抗艱難梭菌A、 B 毒素特異性抗原的多克隆抗體；2 )硝酸纖維膜的製備將艱難梭菌A毒素的單克隆抗體或多克隆 抗體的濃度為1.2±0.2mg/ml，抗艱難梭菌B毒素的單克隆抗體或多克 隆抗體的濃度為1.5士0.1mg/ml，將抗鼠IgG抗體的濃度為2士0.2mg/ml， 噴於硝酸纖維膜上，分別形成檢測線和對照線，且於37°。中乾燥2小 時，備用；3)坡璃纖維膜的製備艱難梭菌A、 B毒素的單克隆抗體標記 膠體金的pH值為7.6 8.0,以18 24pg/ml膠體金加入艱難梭菌A、 B毒 素的單克隆抗體，經穩定劑處理後，按每平方釐米65iil的量均勻吸附 於玻璃纖維膜上，冷凍乾燥，備用；4)最後在反應支持物上依次相互搭接粘貼金標抗體保護膜、玻 璃纖維膜、硝酸纖維膜和吸水墊。
9、 權利要求1-7任意一項所述艱難梭菌A、 B毒素檢測試紙條 在檢測艱難梭菌A、 B毒素中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種用於檢測艱難梭菌A、B毒素的快速檢測試紙條。它是在硝酸纖維膜(NC膜)上包被艱難梭菌A毒素的單克隆抗體或多抗、艱難梭菌B毒素的單克隆抗體或多抗和質控二抗IgG，結合膠體金標記的艱難梭菌A、B毒素的單克隆抗體，應用膜層析雙抗體夾心法，檢測標本中艱難梭菌A、B毒素。應用本發明試紙條檢測，操作簡單、方便、快速、簡捷，不需特殊儀器設備，不需專業培訓，結果清晰易辨，操作簡單，易於推廣，適合基層，適合於現場檢測和流行病學調查，對艱難梭菌感染診斷起到輔助作用。
文檔編號G01N33/569GK101363867SQ200810112738
公開日2009年2月11日 申請日期2008年5月26日 優先權日2008年5月26日
發明者明 劉 申請人:北京莊笛浩禾生物醫學科技有限公司