艱難梭菌ab毒素的lamp檢測方法及其專用引物與試劑盒的製作方法
2023-06-04 06:06:51 1
艱難梭菌ab毒素的lamp檢測方法及其專用引物與試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種艱難梭菌AB毒素的LAMP檢測方法及其專用引物與試劑盒。本發明是根據艱難梭菌特異性保守基因tcdA和tcdB設計引物，然後以待測物的基因組DNA為模板，在獲得引物的引導下進行LAMP擴增，再通過反應液的顏色變化或反應液濁度變化同步定性檢測待測樣品中的艱難梭菌產毒株。本發明可以在等溫條件下快速、方便、同步、高效、高特異、高靈敏地檢測到艱難梭菌產毒株，不需要複雜儀器，為艱難梭菌的檢測及毒素分型提供了新的技術平臺，可用於基層醫療衛生單位及各疾病預防控制中心篩查和檢測艱難梭菌，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益，適於大範圍推廣應用。
【專利說明】艱難梭菌AB毒素的LAMP檢測方法及其專用引物與試劑盒
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種艱難梭菌AB毒素的LAMP檢測方法及其專用引物與試劑盒，屬於 生物【技術領域】中細菌的分子生物學檢測方法【技術領域】。
【背景技術】
[0002] 艱難梭菌（Clostridium difficile,Cd)為革蘭陽性厭氧芽孢桿菌，廣泛分布於水、 土壤等自然環境及動物和人的糞便中。艱難梭菌是一種條件致病菌，本身沒有侵襲性，當 人體腸道正常微環境遭到破壞時，部分產毒細菌通過分泌毒素 A、毒素 B以及二元毒素引 起抗生素相關性腹瀉、結腸炎甚至致死性偽膜性腸炎，統稱為艱難梭菌感染（Clostridium difficile infection，⑶I)。在醫院獲得感染性腹瀉所明確的病原體中，以艱難梭菌最為 常見；在抗生素相關性腹瀉病因中，艱難梭菌亦佔159Γ25%。而偽膜性腸炎則幾乎100%由 艱難梭菌所致。CDI具有復發率高、耐藥率高、難治率高、死亡率高、醫療費用高等特點。
[0003] 艱難梭菌可分為產毒株和不產毒株，不產毒株不引起臨床症狀。艱難梭菌產毒株 主要分泌毒素 A和毒素 B，分別由tcdA和tcdB編碼，而tcdA和tcdB受tcdR、tcdC、tcdE 調節。毒素 A又稱腸毒素，易使迴腸腸壁中性粒細胞浸潤，釋放淋巴因子，引起液體大量分 泌和出血性壞死；毒素 B又稱細胞毒素，能使肌動蛋白解聚，損壞細胞骨架，導致細胞固縮 壞死，直接損傷腸壁細胞。毒素 B的毒力較毒素 A強10倍。一般認為毒素 A在艱難梭菌 感染的發病中起重要作用，毒素 B只起輔助作用，並不能單獨導致感染。然而，近年來有研 究表明，毒素 B對於艱難梭菌感染的發生、發展至關重要，只產生毒素 A的艱難梭菌菌株是 沒有毒性的（Savidge TC, Pan WH, Newman P, O'brien M, Anton PM, Pothoulakis C. Clostridium difficile toxin B is an inflammatory enterotoxin in human intestine, fesiroefliero/of 2003; 125(2) :413-420.)。在艱難梭菌感染患者的糞便中已發現毒素 A陰性、毒素 B陽性的菌株；而毒素 A陽性，毒素 B陰性的菌株尚未被發現，表明毒素 B可以 單獨致病。據國外綜合醫院統計，A(+)B(+)佔艱難梭菌的57%，A(-)B(+)佔34%，A(-)B(_) 佔9%。而A(-)B(+)佔艱難梭菌產毒株的10%，臨床症狀比A(+)B(+)更嚴重，可出現脫水、 低血壓性休克、死亡率較高，耐藥性更高（Wilkins TD, Lyerly DM. Clostridium difficile testing ： after 20 years, still challenging. J Clin Microbiol. 2003;41 (2)： 531-534.)。隨著全球範圍內艱難梭菌感染的暴發流行增多，艱難梭菌感染快速而特異的實 驗室檢測對於疾病感染的控制和臨床診治顯得迫切重要。而選擇tcdA和tcdB作為檢測艱 難梭菌的目的基因，能全面、特異的鑑定臨床產毒株型艱難梭菌。
[0004] 目前，糞便中艱難梭菌實驗室檢測包括作為檢測"金標準"的艱難梭菌毒素檢測及 細胞毒素中和試驗，但因培養條件及技術要求高、耗時長，難以用於臨床常規檢測。國內外 廣泛應用的酶聯免疫試驗（EIA)則快速、特異，不敏感；而乳膠凝集試驗（GDH)則快速、敏 感，但該方法存在交叉反應、假陽性率高，特異性差等缺點。利用普通PCR可檢測艱難梭菌， 但因實驗設備要求高、操作複雜、速度慢，擴增完成後，需要對產物進行電泳、顯影等一些繁 瑣步驟，不適合基層醫院及現場快速檢測的應用。因此，尋找快速、特異、敏感的艱難梭菌檢 測方法是艱難梭菌感染研究領域的熱點。
[0005] 隨著分子診斷技術的不斷進步，T. Notomi (Notomi T, Okayama H, MasubuchiH, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res 2000; 28(12) :63.)發明的一種新型核酸擴增技術一環介導恆溫擴增技術（LAMP),該技術針對靶 基因的6個區域設計4條特異引物，在恆溫（63飛7°C)的條件下，利用高活性鏈置換DNA 聚合酶（BstDNA聚合酶)，使得鏈置換DNA合成在不停地自我循環，大量合成目標DNA的同 時伴隨有副產物一白色的焦磷酸鎂沉澱產生，從而實現對目的基因的快速檢測。該方法檢 測時間短（3(T60min)，無需特殊儀器，操作簡便，配合相應顯色試劑還能實現肉眼判別結 果。LAMP方法目前已成功應用於細菌、病毒及寄生蟲的定性和定量檢測、胎兒性別鑑定和 其他方面，成為常用的臨床快速檢驗方法之一。2005年，日本Haru Kato等（Kato，H. and T. Yokoyama, et al. (2005). Rapid and simple method for detecting the toxin B gene of Clostridium difficile in stool specimens by loop-mediated isothermal amplification. J Clin Microbiol 43(12): 6108-12.)提出運用 LAMP 法針對 tcdB 基因 設計6條引物檢測艱難梭菌，通過濁度儀和聚丙烯醯胺凝膠電泳判讀結果，檢測結果特異、 敏感、快速，不足之處在於無法檢測艱難梭菌是否攜帶ted A基因，不利於艱難梭菌毒素分 型，結果判讀方式繁瑣、需藉助相關儀器，無法實現肉眼快速判讀結果。劉暢等分別在2012 年(劉暢，蔣棟能，蒲曉允.快速檢測糞便中艱難梭菌的方法研究[J].國際檢驗醫學雜 志.2012 (20))和 2013 年（Liu, C. and D. N. Jiang, etal. (2013). "DNAdetection of Clostridium difficile infection based on real-time resistance measurement. 〃 Genet Mol Res 12(3) : 3296-304.)提出：針對tcdA基因設計4條引物檢測艱難梭菌，分 別通過實時電阻測量和顯色試劑判讀結果，LAMP法特異、敏感、快速，適合現場和基層推廣， 不足之處在於無法檢測艱難梭菌tcdB攜帶情況。目前缺乏針對艱難梭菌tcdA基因和tcdB 基因設計特異性引物，通過顯色試劑判讀結果來實現快速、簡便、特異、靈敏的同步檢測艱 難梭菌tcdA和tcdB。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種艱難梭菌AB毒素的LAMP檢測方法及應用於該LAMP檢 測方法的專用引物。
[0007] 本發明的另一目的在於提供一種同時檢測艱難梭菌tcdA和tcdB的LAMP試劑盒。
[0008] 本發明的技術方案如下。
[0009] -種艱難梭菌AB毒素的LAMP檢測方法，包括如下步驟： (1) 引物的設計：分別對艱難梭菌tcdA與tcdB重複序列通過BLAST軟體進行同源性分 析獲得艱難梭菌特異保守序列，再根據艱難梭菌特異保守DNA序列，用軟體Primer design V4設計分別得到用於對艱難梭菌tcdA與tcdB進行LAMP檢測的引物； (2) LAMP擴增：以待測物的基因組DNA為模板，在步驟（1)獲得引物的引導下進行LAMP 擴增；所述待測物包括人及動物的糞便或培養分離的菌株； (3) 反應結束後進行結果判定：擴增反應前預先在反應液中添加鈣黃綠素指示劑，反應 後根據反應液的顏色變化判斷結果，綠色表示待測樣品中存在艱難梭菌待測毒素基因，橙 色表示待測樣品中不存在艱難梭菌待測毒素基因；或者不添加鈣黃綠素指示劑直接用濁度 儀檢測擴增反應前後反應液的濁度變化來判斷結果，反應液濁度上升表示待測樣品中存在 艱難梭菌待測毒素基因，濁度無變化表示待測樣品中不存在艱難梭菌待測毒素基因。
[0010] 經上述艱難梭菌AB毒素的LAMP檢測方法步驟（1)設計優化獲得一種用於對艱難 梭菌tcdA、tcdB進行LAMP檢測的專用引物如下： (1) 用於對艱難梭菌tcdA進行LAMP檢測的tcdA引物為以下三組引物對混合的引物 組合，第一組引物對：引物I (F3)與引物2 (B3);第二組引物對：引物3 (FIP)與引物4 (BIP);第三組引物對：引物5 (LF)與引物6 (LB);所述各引物序列如下： F3 ：AGTTTGTTTACAGAACAAGAGTT B3 ：ATTTTATCATTTCCCAACGGT FIP ：CCGCCAAAATTTTTTAGGGCTAATATTTTTATAGTCAGGAGTTGTTAAATCG BIP ：AGATGTTGATATGCTTCCAGGTATTTTCTAGTCCAATAGAGCTAGGTC LF ： CTTACTATGTCAGATGCTGCAGCTA LB ：AGATGCTGCAGCTAAATTTCCA 所述"(^引物中三組引物對^1?和81?):(1^和1^):斤3和83)的摩爾比為8 :4:1; (2) 用於對艱難梭菌tcdB進行LAMP檢測的tcdB引物為以下三組引物對混合的引物 組合，第一組引物對：引物I (F3)與引物2 (B3);第二組引物對：引物3 (FIP)與引物4 (BIP);第三組引物對：引物5 (LF)與引物6 (LB);所述各引物序列如下： F3 ：GTATCAACTGCATTAGATGAAAC B3 ：CCAAAGATGAAGTAATGATTGC FIP ：CTGCACCTAAACTTACACCATCTATCTTCCTACATTATCTGAAGGATT BIP ：GAGCTAAGTGAAACGAGTGACCCGCTGTTGTTAAATTTACTGCC LF ： AATAGTTGCAATTATAGG LB ：AGACAAGAAATAGAAGCTAAGATAGG 所述tcdB引物中三組引物對（FIP和BIP): (LF和LB): (F3和B3)的摩爾比為8:4:1。
[0011] 採用本發明的檢測方法，以上述專用引物進行LAMP擴增反應條件可為：檢測tcdA 時，擴增反應體系在58-69°C下恆溫60min ;檢測tcdB時，擴增反應體系在58-69°C下恆溫 60min ;tcdA與tcdB同時檢測時，擴增反應體系在58_69°C下恆溫60min。
[0012] 優選的，所述的LAMP擴增反應條件為：檢測tcdA時，擴增反應體系在61 °C下恆溫 60min ;檢測tcdB時，擴增反應體系在60°C下恆溫60min ;tcdA與tcdB同時檢測時，擴增反 應體系在60°C下恆溫60min。
[0013] 本發明的檢測方法中所述鈣黃綠素指示劑的添加量為?μ? (終反應體系26μ1)，所 述鈣黃綠素指示劑包含有0.5 mM鈣黃綠素和10 mM氯化錳。
[0014] 以上述專用引物進行LAMP擴增時採用的LAMP擴增反應總體系優選如下：待測物 的基因組DNA 2μ1、20 mM Tris.HCl (pH 8.8)、10 mM KC1、10 mM (NH4)2S04、0. l%Tween20， 0. 8 M甜菜鹼、8 mM MgS04、1.4 mM dNTP each、8U Bst DNA聚合酶、專用引物、加雙蒸水至 總容量25yL;所述的專用引物及其加入量為：tcdA引物：40 pmol (FIP和BIP)、20 pmol (LF 和 LB)、5 pmol (F3 和 B3)，所述 tcdA 引物的引物對（FIP 和 BIP)、（LF 和 LB)、（F3 和 B3)中各條引物的混合比例優選為等量混合；tcdB引物：40 pmol (FIP和BIP)、20 pmol (LF 和 LB)、5 pmol (F3 和 B3)，所述 tcdB 引物的引物對（FIP 和 BIP)、（LF 和 LB)、（F3 和 B3)中各條引物的混合比例優選為等量混合。
[0015] 一種同時檢測艱難梭菌tcdA和tcdB的LAMP試劑盒，包含有上述用於對艱難梭菌 tcdA和tcdB進行LAMP檢測的專用引物。
[0016] 所述試劑盒中還包括陽性對照和陰性對照；所述陽性對照為含艱難梭菌的基因組 DNA，所述陰性對照為不含DNA的LAMP擴增體系(如：雙蒸水)。
[0017] 優選的，所述試劑盒中包括：20 mM Tris · HCl (pH 8.8)、10 mM KC1、10 mM (NH4)2S04,0. 1% Tween20、0.8 M 甜菜鹼、8 mM MgS04、1.4 mM dNTP each、8U Bst DNA 聚合 酶、tcdA引物、tcdB引物、鈣黃綠素指示劑、艱難梭菌的基因組DNA和雙蒸水；tcdA引物為： 40 pmol (FIP 和 BIP)、20 pmol (LF 和 LB)、5 pmol (F3 和 B3)，tcdB 引物為：40 pmol (FIP 和 BIP)、20 pmol (LF 和 LB)、5 pmol (F3 和 B3)。
[0018] 本發明相對於現有技術的有益效果如下：採取以上設計，本發明具有以下優點： (1) 高特異性：6條引物對艱難梭菌靶序列的8個特異區域的識別保證了 LAMP擴增的 高度特異性，即LAMP能從相差僅一個核苷酸的基因標本中找出相應的靶序列進行擴增； (2) 高靈敏度：靈敏度比普通PCR高10倍； (3) 結果鑑定簡便：可通過肉眼觀察結果(鈣黃綠素顯色原理：鈣黃綠素是金屬離子指 示劑，能指示反應液中Mg2+的變化，反應前在擴增加入鈣黃綠素顯色劑，反應後反應液顏色 變綠色表示待測樣品中存在艱難梭菌待測毒素基因（陽性)，橙色表示待測樣品中不存在艱 難梭菌待測毒素基因（陰性)），或者直接用濁度儀判斷結果（LAMP反應的過程中會產生焦磷 酸鎂，焦磷酸鎂是一種白色沉澱，濁度儀可以根據濁度的變化來判斷LAMP反應)，反應液濁 度上升表示待測樣品中存在艱難梭菌待測毒素基因（陽性)，濁度無變化表示待測樣品中不 存在艱難梭菌待測毒素基因（陰性）； (4) 操作簡單：只要將檢測樣品(靶核酸）和檢測試劑一起放入60-65°C恆溫水浴鍋或 金屬浴中60分鐘後就可以判斷結果； (5) 快速、高效擴增：整個LAMP擴增反應一小時內即可完成，且產率可達到0. 5mg/mL ; (6) 同步：可同步檢測tcdA和tcdB，快速檢測艱難梭菌產毒株。
[0019] 本發明可以在等溫條件下快速、方便、同步、高效、高特異、高靈敏地檢測到艱難梭 菌產毒株，不需要複雜儀器，為艱難梭菌的檢測及毒素分型提供了新的技術平臺，可用於基 層醫療衛生單位和各疾病預防控制中心篩查和檢測艱難梭菌，具有廣闊的市場前景和較大 的經濟、社會效益，適於大範圍推廣應用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020] 圖1為實施2艱難梭菌tcdA的LAMP檢測方法最佳溫度篩選的濁度儀檢測結果。
[0021] 圖2為實施2艱難梭菌tcdB的LAMP檢測方法最佳溫度篩選的濁度儀檢測結果。
[0022] 圖3為實施例3艱難梭菌tcdA的LAMP檢測方法特異性的濁度儀檢測結果。
[0023] 圖4為實施例3艱難梭菌tcdB的LAMP檢測方法特異性的濁度儀檢測結果。
[0024] 圖5為實施例3艱難梭菌tcdA的LAMP檢測方法特異性的鈣黃綠素染色檢測結果。
[0025] 圖6為實施例3艱難梭菌tcdB的LAMP檢測方法特異性的鈣黃綠素染色檢測結果。
[0026] 圖7為實施例4艱難梭菌tcdA的LAMP檢測方法靈敏度的濁度儀檢測結果。
[0027] 圖8為實施例4艱難梭菌tcdB的LAMP檢測方法靈敏度的濁度儀檢測結果。
[0028] 圖9為實施例4艱難梭菌tcdA的LAMP檢測方法靈敏度的鈣黃綠素染色檢測結果。
[0029] 圖10為實施例4艱難梭菌tcdB的LAMP檢測方法靈敏度的鈣黃綠素染色檢測結 果。
[0030] 圖11為實施例4艱難梭菌tcdA的LAMP檢測方法靈敏度的PCR檢測結果。
[0031] 圖12為實施例4艱難梭菌tcdB的LAMP檢測方法靈敏度的PCR檢測結果。
【具體實施方式】
[0032] 下面通過實施例對本發明做進一步詳細說明，這些實施例僅用來說明本發明，並 不限制本發明的範圍。
[0033] 下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。
[0034] 實施例1通過以下步驟實施本發明： 1、用於對艱難梭菌進行LAMP檢測的引物設計 (1) 用於對艱難梭菌tcdA進行LAMP檢測的引物設計：從美國基因資料庫檢索獲得艱難 梭菌tcdA重複序列（GenBank : X92982. 1)通過BLAST軟體進行同源性分析得知是艱難梭 菌特異保守序列(序列表中SEQ ID NO :1)，再根據該保守靶DNA序列，用軟體Primer design V4設計用於對艱難梭菌進行LAMP檢測的引物，結果優化得到三組引物對，F3和B3為第一 組，FIP和BIP為第二組，LF和LB為第三組，具體各條引物序列如表1。
[0035] 表1用於對艱難梭菌進行LAMP檢測的tcdA引物
【權利要求】
1. 一種艱難梭菌AB毒素的LAMP檢測方法，其特徵在於：包括如下步驟： (1) 引物的設計：分別對艱難梭菌tcdA與tcdB重複序列通過BLAST軟體進行同源性分 析獲得艱難梭菌特異保守序列，再根據艱難梭菌特異保守DNA序列，用軟體Primer design V4設計分別得到用於對艱難梭菌tcdA與tcdB進行LAMP檢測的引物； (2) LAMP擴增：以待測物的基因組DNA為模板，在獲得引物的引導下進行LAMP擴增；所 述待測物為人及動物的糞便或培養分離的菌株； (3) 反應結束後進行結果判定：擴增反應前預先在反應液中添加鈣黃綠素指示劑，反應 後，根據反應液的顏色變化判斷結果，綠色表示待測樣品中存在艱難梭菌待測毒素基因，橙 色表示待測樣品中不存在艱難梭菌待測毒素基因；或者不添加鈣黃綠素指示劑直接用濁度 儀檢測擴增反應前後反應液的濁度變化來判斷結果，反應液濁度上升表示待測樣品中存在 艱難梭菌待測毒素基因，濁度無變化表示待測樣品中不存在艱難梭菌待測毒素基因。
2. 根據權利要求1所述的艱難梭菌AB毒素的LAMP檢測方法，其特徵在於：經所述步 驟（1)設計優化獲得用於對艱難梭菌tcdA和tcdB進行LAMP檢測的專用引物如下： (1) 用於對艱難梭菌tcdA進行LAMP檢測的tcdA引物為以下三組引物對混合的引物 組合，第一組引物對：引物1 (F3)與引物2 (B3);第二組引物對：引物3 (FIP)與引物4 (BIP);第三組引物對：引物5 (LF)與引物6 (LB);所述各引物序列如下： F3 ：AGTTTGTTTACAGAACAAGAGTT B3 ：ATTTTATCATTTCCCAACGGT FIP ：CCGCCAAAATTTTTTAGGGCTAATATTTTTATAGTCAGGAGTTGTTAAATCG BIP ：AGATGTTGATATGCTTCCAGGTATTTTCTAGTCCAATAGAGCTAGGTC LF ： CTTACTATGTCAGATGCTGCAGCTA LB ：AGATGCTGCAGCTAAATTTCCA 所述tcdA引物中三組引物對（FIP和BIP): (LF和LB): (F3和B3)的摩爾比為8:4:1 ; (2) 用於對艱難梭菌tcdB進行LAMP檢測的tcdB引物為以下三組引物對混合的引物 組合，第一組引物對：引物1 (F3)與引物2 (B3);第二組引物對：引物3 (FIP)與引物4 (BIP);第三組引物對：引物5 (LF)與引物6 (LB);所述各引物序列如下： F3 ：GTATCAACTGCATTAGATGAAAC B3 ：CCAAAGATGAAGTAATGATTGC FIP ：CTGCACCTAAACTTACACCATCTATCTTCCTACATTATCTGAAGGATT BIP ：GAGCTAAGTGAAACGAGTGACCCGCTGTTGTTAAATTTACTGCC LF ： AATAGTTGCAATTATAGG LB ：AGACAAGAAATAGAAGCTAAGATAGG 所述tcdB引物中三組引物對（FIP和BIP): (LF和LB): (F3和B3)的摩爾比為8:4:1。
3. 根據權利要求1或2所述的艱難梭菌AB毒素的LAMP檢測方法，其特徵在於：以所 述步驟（1)獲得的引物按步驟（2)進行LAMP擴增的反應條件為：檢測tcdA時，在58-69°C 恆溫60min ;檢測tcdB時，在58-69 °C恆溫60min ; tcdA與tcdB同時檢測時，在58-69 °C恆 溫 60min。
4. 根據權利要求3所述的艱難梭菌AB毒素的LAMP檢測方法，其特徵在於：所述LAMP 擴增的反應條件為：檢測tcdA時，在61°C恆溫60min ;檢測tcdB時，在60°C恆溫60min ; tcdA與tcdB同時檢測時，在60 °C恆溫60min。
5. 根據權利要求1所述的艱難梭菌AB毒素的LAMP檢測方法，其特徵在於：所述鈣黃綠 素指示劑的添加量為1W，所述鈣黃綠素指示劑包含有0.5 mM鈣黃綠素和10 mM氯化錳。
6. 根據權利要求2所述的艱難梭菌AB毒素LAMP檢測方法，其特徵在於：以所述的專 用引物進行LAMP擴增時採用的LAMP擴增反應總體系如下：待測物的基因組DNA 2沿、20 mM Tris.HCl (pH 8.8)、10 mM KC1、10 mM (NH4)2S04、0. l%Tween20,0.8 M 甜菜鹼、8 mM MgS04、 1.4 mM dNTP each、8U Bst DNA聚合酶、專用引物、加雙蒸水至總容量25iiL;所述專用引 物及其加入量為：tcdA 引物：40 pmol (FIP 和 BIP)、20 pmol (LB 和 LF)，5 pmol (F3 and B3);檢測 tcdB 時，tcdB 引物：40 pmol (FIP 和 BIP)、20 pmol (LB 和 LF)，5 pmol (F3 and B3)。
7. -種同時檢測艱難梭菌tcdA和tcdB的LAMP試劑盒，其特徵在於：包括權利要求2 所述的用於對艱難梭菌tcdA和tcdB進行LAMP檢測的專用引物。
8. 根據權利要求7所述的同時檢測艱難梭菌tcdA和tcdB的LAMP試劑盒，其特徵在 於：所述試劑盒中還包括陽性對照和陰性對照；所述陽性對照為含艱難梭菌的基因組DNA， 所述陰性對照為不含DNA的LAMP擴增體系。
9. 根據權利要求7所述的同時檢測艱難梭菌tcdA和tcdB的LAMP試劑盒，其特徵 在於：所述試劑盒中包括：20 mM Tris.HCl (pH 8.8)、10 mM KC1、10 mM (NH4)2S04,0.1% Tween20、0.8 M 甜菜鹼、8 mM MgS04、1.4 mM dNTP each、8U Bst DNA 聚合酶、tcdA 引物、 tcdB引物、鈣黃綠素指示劑、艱難梭菌的基因組DNA和雙蒸水；tcdA引物為：40 pmol (FIP 和 BIP)、20 pmol (LF 和 LB)、5 pmol (F3 和 B3)，tcdB 引物為：40 pmol (FIP 和 BIP)、20 pmol (LF 和 LB)、5 pmol (F3 和 B3)。
10. 根據權利要求7~9中任一項所述的同時檢測艱難梭菌tcdA和tcdB的LAMP試劑 盒，其特徵在於：所述試劑盒可同步定性檢測艱難梭菌tcdA和tcdB。
【文檔編號】C12Q1/68GK104328204SQ201410667259
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年11月20日 優先權日:2014年11月20日
【發明者】陳燁, 林敏怡, 王浦, 譚嘉聖, 張婷, 袁靜, 劉威 申請人:南方醫科大學南方醫院