基於積分球增強光散射檢測技術的均相親和分析新方法

2023-06-04 21:04:01

專利名稱：基於積分球增強光散射檢測技術的均相親和分析新方法
技術領域：
本發明意在用螢光分光光度計等測量光致發光信號的儀器，通過本身為多活性位點的生 物分子或所製備的多活性位點加合物，與帶強散射能力或能產生螢光共振能量轉移效應的生 色團所標記的對應生物活性成分相結合，生成有強散射能力或螢光共振能量轉移效應的非共 價產物複合物(團聚物)，聯用積分球增強發光信號測量比例的光信號檢測技術，建立一種不 需分離出產物複合物的均相親和分析新方法，可用於免疫分析和配體類藥物的離體篩選。
本發明所述方法是一種表徵單活性位點或多活性位點生物分子同其它生物活性成分相互 作用的通用方法。生物分子所含活性位點的數目取決於與其發生相互作用生物活性成分的結 合性質。通常單一肽鏈蛋白也可有多個不同的抗原決定簇。當用針對特定抗原決定簇的單抗 與蛋白抗原結合時，單一肽鏈蛋白大多為單活性位點的生物分子；當用多克隆抗體或多個單 抗與之結合時，單一肽鏈蛋白也可成為多活性位點的生物分子；而基本沒有對稱性的簡單小 分子半抗原或配體類藥物，通常為單活性位點的生物分子。
背景技術：
生物活性分子可通過非共價鍵相互作用特異結合成非共價產物複合物。只要生物分子之 間結合的親和力足夠高，反應達到平衡後，相互結合成分量的變化也有明確的化學計量關係。 因此，利用這類高選擇性結合反應，可測定混合物中生物活性成分的含量或生物分子之間相 互作用的親和力，此即親和分析，其典型代表是免疫分析和配體類藥物的離體篩選。
在親合分析的結合反應過程中，物質都沒有共價鍵的變化，通常難測量吸收、螢光等信 號的變化確定所生成的非共價產物複合物量。為了便於用常用儀器測量所生成的非共價產物 複合物或未結合成分的量，常需將親和分析中的待測成分標準品或與其結合的對應生物活性 成分，用帶有便於檢測信號的物質(如放射性同位素或酶)進行標記，然後通過測定非共價產 物複合物中或剩餘的未結合成分中的標記信號強度，直接或間接確定非共價產物複合物的量。
但採用這類對結合反應中的某個成分進行標記的策略面臨一個問題如何選擇性測定未 結合的帶標記成分量或產物複合物量。解決此問題的最簡單策略是將非共價產物複合物從反 應混合物中分離出來後再定量。因此，使用這類標記親和分析方法，按是否需分離出非共價 產物複合物再定量，分成非均相親和分析和均相親和分析兩種。非均相親和分析需分離出產 物複合物再定量，而均相親和分析則不需分離出非共價產物複合物就可直接定量。均相親和 分析方法效率更高、幹擾更少、操作更簡便，對於免疫分析和配體藥物離體篩選更有價值。 但均相親和分析方法很難建立，目前實用的親和分析技術主要是採用標記的非均相親和分析 方法。另外，按照分析策略的差異，使用標記的親和分析又分成直接親合分析和競爭性親合 分析。直接親合分析用帶標記的過量生物活性成分與待測成分反應，達到平衡後分離出非共
價產物複合物或未結合的帶標記成分進行定量。競爭性親合分析中，將待測成分的標準品用 適當方法進行標記後，將設定量的被標記標準品與待測樣品混勻後競爭結合對應的生物活性 成分，達到平衡後將非共價產物複合物與未結合的被標記標準品儘可能完全地分離後再進行 定量。現有親和分析方法都依賴於這兩種策略表徵生物分子之間的相互作用。
只有直接測定親和分析反應混合物中的非共價產物複合物的量或剩餘未結合生物活性成 分量，才能建立均相親和分析方法。現有常用測量技術中，能滿足此要求的主要有兩種方法 光散射檢測技術和螢光共振能量轉移技術。
光散射是指體系中的顆粒在激發光照射下，在顆粒周圍除了激發光傳播方向以外都能檢 測到光信號的現象。體積越大的顆粒對激發光的散射作用越強。在親合分析的結合反應過程 中，所生成的非共價產物複合物的體積都比未結合成分的體積大，故隨著親和分析反應體系 中非共價產物複合物的生成，反應體系的光散射信號就會增高。所以，基於光散射檢測技術 可建立均相親和分析方法，其代表是免疫比濁法。但是，現有免疫比濁法靈敏度低，局限於 測定細菌等體積較大的物質，還不能成為一種通用的均相親和分析方法。
要利用光散射檢測技術建立通用性的均相親和分析方法，就必須在親和分析的反應過程 中，顯著增加所生成的非共價產物複合物與未結合成分的光散射能力差異。影響顆粒光散射 能力的主要因素是散射顆粒的體積和其內部所含生色團之間的相互作用。因此，需採用特殊 策略促進親和分析反應體系生成體積比未結合成分更大的非共價產物複合物(散射顆粒)，並 促進產物複合物中生色團發生強相互作用，才能用光散射檢測技術建立均相親和分析新方法。 本發明用多活性位點生物分子同帶強散射能力生色團標記的對應生物活性成分結合成大體積
的非共價產物團聚物(用如圖la所示Sigma-Aldrich公司銷售的Dendrimer412368-5G交聯含
活化羧基的生物活性分子，則得到如圖lb所示的多活性位點共價加合物；用結構如圖lb所 示多活性位點共價加合物同帶強生色團標記的對應生物活性成分結合，則豐成結構如圖2所 示非共價產物複合物)；而且，此非共價產物團聚物內部因生色團之間空間距離縮短，可促進 有強散射能力的標記生色團之間可發生強相互作用，進一步增強產物團聚物的光散射能力。 這些特殊策略從優化產物複合物光散射能力內因的角度，促進用光散射檢測技術建立通用性 均相親和分析方法。
在激發光照射下，顆粒的光散射信號是三維空間分布的。採用本發明所述積分球(圖3， 以下所述積分球及圓柱形流式樣品管設計參數均與Shimadzu RF-540螢光分光光度計匹配) 匯聚三維空間的光散射信號，肯定能顯著提高光散射信號的測量比例。這是因為測量光散射 信號常用的螢光分光光度計等儀器，通常只測定與激發光成直角處的光散射信號，使得來自 顆粒的絕大部分光散射信號沒有被測量(圖4)。以Shimadzu RF-540螢光分光光度計為例，本 發明所述積分球增強光散射信號測量比例的機制可簡述如下。Shimadzu RF-540螢光分光光度 計檢測窗口的直徑約3.0 cm。假定檢測器由二極體陣列構成，每個二極體檢測點相當於放置 在積分球表面的一個點；通過相當於檢測器窗口平面內所有二極體的光信號加和為所檢測的 信號總量。假定光散射信號分布以積分球中心到檢測窗口中心的距離為半徑的球面，這樣， 檢測窗口沿著與球心的連線在發光信號分布球面的最大投影對應的球面積代表了可檢測信號 的當量面積。假定光散射信號在空間是均勻分布。那麼，對於半徑為3cm的積分球，通過積 分球匯聚和導向光信號用於檢測有望將測量比例提高到10倍以上(圖4，激發光信號分布球 面的表面積大於4x兀x3x3 cm2，檢測窗口投影對應面積約為7txl.5xl.5，比值為16倍)。另一 方面，光散射信號在空間的分布是很不均勻的，其信號在光散射與激發光夾角接近90°時最弱， 而夾角偏離90。後光散射信號逐漸增強，到接近0°或用180。處可增加近10倍(J Am Chem Soc, 2005; 127:12115-12121)。據此文獻的數據估算，在光散射與激發光夾角為90。附近檢測到的光 散射信號強度總量，只有全部光散射信號強度總量的5%左右。因此，綜合上述兩方面的因 素，用積分球匯聚三維空間的散射信號用於檢測，其測量比例比不用積分球時肯定可遠高於 10倍。因此，使用積分球匯聚光散射信號用於測量就是從優化信號測量外因的角度提高光散 射的測量比例，促進將光散射檢測技術用於建立通用性的均相親和分析新方法。
此外，螢光共振能量轉移技術已用於均相親和分析，但其都需要把作為供體和接受體的 螢光生色團分別標記在能與待測生物活性成分結合的不同生物活性成分上。例如，將針對同 一個蛋白分子上不同抗原決定簇的兩個單抗，分別標記上螢光供體和螢光接受體，用於與待 測生物活性成分結合，生成夾心狀的免疫複合物，通過測量螢光共振能量轉移，可建立均相 免疫分析體系。但此均相親和分析方法不是一種通用性技術，因為其技術上要求兩種單抗針 對相同蛋白質上的不同抗原決定簇，在製備這類單抗時篩選更複雜，尤其此方法很難用於測 量小分子半抗原或配體類藥物同耙蛋白的相互作用。相反，用本發明所述的方法將單活性位 點生物分子交聯成多活性位點共價加合物，就只需要一種單抗且對此單抗所識別的抗原決定 簇無任何要求；輔助以積分球增強螢光信號的測量比例，不僅可表徵大分子之間的相互作用， 還可表徵小分子半抗原以及配體類藥物等同對應蛋白的相互作用。因此，採用本發明所述的 方法，以螢光共振能力轉移技術為基礎也可建立一種通用性的均相親和分析新方法。

發明內容
本發明的關鍵技術環節在於聯用以下策略，建立不分離出非共價產物複合物就可在均相 體系直接測量生物分子含量和相互作用親和力的均相親和分析新方法(l)將單活性位點生物 大分子或小分子，與含多個相同活潑官能團的樹狀分子或其它有類似功能的分子交聯，生成 多活性位點共價加合物(本身為多活性位點的生物分子不需交聯)，再與帶強生色團標記的對 應生物活性成分結合，生成帶強生色團標記的大體積非共價產物複合物；(2)在螢光分光光度 計等可測量光散射信號的儀器上，用所設計帶圓柱形流式樣品管的積分球，匯聚在三維空間 呈不均勻分布的光散射信號用於檢測，顯著提高光散射信號的測量比例。這兩種策略的聯合 應用，是建立本發明所述均相親和分析方法的決定性基礎。應用此發明所述方法，其特徵在 於按如下步驟進行-
(一)、在親和分析的反應體系中，用特殊策略生成有強光散射能力的非共價產物團聚物， 其特徵在於按如下步驟進行
(1) .將單活性位點生物分子的標準品，與含多個相同活潑官能團的樹狀分子或其它有類 似功能的分子交聯，生成多活性位點共價加合物；本身為多活性位點的生物分子不需交聯；
(2) .將可與本身為多活性位點的生物分子或按步驟(l)所得的多活性位點共價加合物相 結合的對應生物活性成分標準品，用有強光散射能力的生色團(如納米金或銀粒子、水溶性卟 啉類物質)進行標記；
(3) .將本身為多活性位點的生物分子對應標準品或按步驟(l)所得的多活性位點共價加 合物，與按步驟(2)所得帶強光散射能力生色團標記的生物活性成分相結合v生成有強光散射 能力的非共價產物團聚物；
(4) .測定本身為多活性位點生物分子的含量時，用設定量的帶強光散射能力生色團標記 的對應生物活性成分直接與待測樣品反應，生成有強光散射能力的非共價產物團聚物；反應 達平衡後，所生成的這種非共價產物團聚物的量，與來自樣品的待測多活性位點生物分子的 含量正相關；
(5) .測定單活性位點生物分子的含量時，先按步驟(l)製備相應的多活性位點共價加合 物；測定時先將待測樣品與此多活性位點共價加合物混勻，再加入設定量的帶強生色團標記 的對應生物活性成分，使其發生競爭結合；達到平衡後，所生成的有強光散射能力的非共價 產物團聚物的量，與來自樣品的待測單活性位點生物分子的含量負相關；
(6) .測定與按步驟(2)所製備的帶強光散射能力生色團標記的生物活性成分結合性質相 同的生物分子含量時，先將待測樣品與帶強光散射能力生色團標記的該生物活性成分標準品 混勻，再加設定量的本身為多活性位點的相應生物分子或按步驟(l)所製備的相應多活性位點 共價加合物，使其發生競爭結合；反應達到平衡後，所生成的有強光散射能力的非共價產物 團聚物的量，與來自樣品的待測生物活性分子的含量負相關； ，
(7) .測定生物活性分子之間親和力時，令本身為多活性位點的生物分子或按步驟(l)所制 備的多活性位點共價加合物為A，按步驟(2)所製備的帶強光散射能力生色團標記的對應生物 活性成分為B;在反應體系中固定A和B的濃度且二者比例接近1:1;測定時，先在反應體 系中加入待測成分(使其濃度在儘可能寬範圍內變化)，再加入與此待測成分有相同結合性質 的生物活性成分(A或B)，混勻後加入設定量的可與待測成分結合的生物活性成分(B或A)，使 其發生競爭結合；反應達平衡後，所生成的有強光散射能力的非共價產物團聚物的量與外加 待測成分的量負相關；再用Scatchard作圖法分析所生成的有強光散射能力的非共價產物團聚 物的量對外加待測成分量的響應，確定解離常數表示二者之間相互作用的親和力；
(8).在步驟(2)中，還可用一對有螢光共振能量轉移效應的生色團分別標記同一種生物 活性成分，將二者等比例混勻後，再與本身為多活性位點的相應生物分子或步驟(l)所得的相 應多活性位點共價加合物結合，使其生成有強螢光共振能量轉移效應的非共價產物團聚物； 然後參照步驟(4)到步驟(7)表徵生物分子間的相互作用。
(二)、用安裝有流式樣品管的積分球(其規格與所用螢光分光光度計等測量儀器相匹配。 以下所述積分球及圓柱形流式樣品管的參數均與ShimadzuRF-540螢光分^;光度計匹配)，匯
聚在三維空間不均勻分布的光散射或螢光信號用於檢測，其特徵在於按如下步驟進行-
(1) .用石英或玻璃製造圓柱形流式樣品管(內徑0.40cm，夕卜徑0.60cm，長2.5 cm);測 量前用緩衝液以流動注射方式清洗；
(2) .製造用於匯聚光散射信號的積分球；在此積分球壁上開三個園孔(分別正對螢光分 光光度計等光散射信號測量儀器的激發窗口和檢測窗口的兩園孔直徑都為0.62cm;用於導出 透射光的園孔直徑為0.82 cm);其中，孔中心連線過積分球球心的一對園孔用於安置圓柱形 流式樣品管(使圓柱形流式樣品管的軸心線與螢光分光光度計等光散射信號測量儀器的激發 窗口軸心線儘量重合)，另一園孔作為光散射匯聚後進入檢測窗口的出口(作為光散射出口的 園孔，其軸心線與螢光分光光度計等光散射信號測量儀器檢測窗口的軸心線儘量重合)；將透 射光用內部強吸光的玻璃直管(內徑0.61cm，外徑0.81cm)引導到積分球以外，樣品管、導光 管與積分球壁上園孔之間的空隙都用合適的墊圈密封；將焦距60cm的匯聚鏡(焦距應遠遠大 於所用積分球的直徑)安裝在激發窗口和圓柱形流式樣品管之間，將激發光匯聚成焦點位於積 分球以外的近平行激發光(避免激發光透過樣品管直接進入積分球內而造成很高的背景)，並 垂直地照射到圓柱形樣品管針對激發窗口的底面上；
(3) .將激發光通路和圓柱形流式樣品管用內徑3.0 cm的不透光塑料直管連接(此直管的 軸心線與激發光通路的軸心線儘量重合)，將積分球匯聚的散射光經出射園孔與檢測窗口用內 徑3.0 cm的不透光塑料直管連接(此直管的軸心線與檢測窗口的軸心線儘量重合)，儘可能降 低背景和雜散光；
(4) .用注射器手動或步進馬達自動把適量液體樣品輸送到圓柱形流式樣品管內；
(5) .用安裝了積分球的螢光分光光度計等光散射測量儀器，測量光散射強度；
(6) .與(一)中所述步驟(8)對應，用安裝了積分球的螢光分光光度計等儀器，測量共振能 量轉移所產生的螢光。
本發明從增強被測物質光散射能力(內因)的角度，設計特殊策略增大非共價產物複合物 的體積，並促進內部生色團之間的相互作用，從而提高散射顆粒的光散射能力；同時，從增 強光散射信號測量比例(外因)的角度，用積分球顯著提高光散射信號測量比例，使光散射信 號強度對待測物量變化的響應係數顯著提高，籍此建立一種通用性均相親和分析新技術，可 用於免疫分析和小分子配體藥物的離體篩選。
本發明應用中，除了用有強光散射能力的生色團標記對應成分外，還可用一對能發生熒 光共振能量轉移的生色團分別標記相同的生物活性成分，並藉助積分球增強螢光信號測量比 例的檢測技術，也可建立起測量螢光共振能量轉移效應的均相親和分析方法，可用於免疫分 析和小分子配體藥物的離體篩選。


附圖中所用濃度都換算成游離瘦肉精的當量濃度(C)， /表示光散射強度。PAMAM Dendrimer 412368 (表面有4個氨基)來自Sigma-Aldrich， USA。
圖la Dendrimer和活化後待交聯的生物活性分f結構示意圖。
圖lb用圖la中所示的Dendrimer與對應生物活性分子交聯生成的多活性位點共價加合
物結構示意圖。
圖2用圖lb所示的多活性位點共價加合物問帶強生色團標記的對應生物分子^f生成的
非共價產物合物結構示意圖。 圖3用於Shimadzu RF-540螢光分光光度計的積分球不意圖。 圖4本發明實施中用積分球增加光散射信號測量比例的原理示意圖。 圖5瘦肉精共價加合物與納米金粒子標記單抗所生成非共價產物複合物的光散射譜。 圖6比較積分球增加散射信號測量比例的效應。
圖7比較Dendrimer交聯痩肉精成共價加合物對非共價產物複合物光散射能力的增強 效應。
圖8本發明方法測定瘦肉精含量的響應曲線。
圖9本發明方法測定瘦肉精單抗含量的響應曲線。.
圖io本發明方法測定瘦肉精衍生物與其單抗結合的親和力。具體實施實例
以Sigma所售PAMAM Dendrimer 412368 (表面有4個氨基)交聯的痩肉精共價加合物同 納米金粒子標記抗瘦肉精的單抗相互作用為例，在Shimadzu RF-540螢光分光光度計上安裝 帶圓柱形流式樣品管的積分球，按照如下步驟實施本發明(結果參見附圖5到附圖10):
1) 瘦肉精半抗原同Dendrimer連接
A. 用亞硝酸鈉在低溫下將瘦肉精重氮化，再與溴乙醯苯胺連接；
B. 將Dendrimer用N-羥基琥珀醯亞胺活化羧基的氧化型巰基乙酸反應(修飾其氨基)後， 再用NaBH4還原，生成表面帶4個巰基的Dendrimer;
C. 將帶巰基的Dendrimer同與溴乙醯苯胺相連的瘦肉精反應，生成表面帶4個痩肉精半 抗原的共價加合物；過製備型HPLC柱純化。
2) 納米金粒子標記抗瘦肉精單抗
A. 製備lOmn納米金粒子，測定游離納米金粒子吸收譜和光散射譜；
B. 將所得納米金粒子用0.2。/。的PEG600穩定，加入未稀釋的商品抗瘦肉精單抗，攪拌 反應10min後置於4'C備用；
C. 測定標記產物的吸收譜和光散射譜。
3) Dendrimer交聯的瘦肉精共價加合物與納米金粒子標記單抗結合生成非共價產物複合 物後，比較用積分球增加光散射信號測量比例的效應
A. 配製線性濃度梯度的瘦肉精共價加合物溶液；
B. 加入與瘦肉精共價加合物最高濃度稍過量的納米金粒子標記對應單抗，調整所有溶 液體積相同；
C. 反應達平衡後，取適量反應液，用注射器手動加樣到流式樣品管中；
D. 打開積分球上蓋(不用積分球)，激發與發射等波長，掃描在中等濃度下Dendrimer交 聯瘦肉精共價加合物反應液的光散射譜(圖5);
E. 關上積分球上蓋(用積分球)，相同方式掃描光散射譜；
F. 打開積分球上蓋(不用積分球)，在最大光散射波長下測量上述不同瘦肉精共價加合物 濃度反應體系的光散射信號；
G. 關上積分球上蓋(用積分球)，在相同散射波長下測量上述溶液的光散射信號強度；
H. 線性回歸比較兩種測量方式的線性響應係數差異，考察積分球對散射信號測量比例 的增加效應(圖6)。
4)用本發明所述方法，比較瘦肉精共價加合物和游離的瘦肉精衍生物，，與納米金粒子標 記的相同單抗反應，所生成的非共價產物複合物的光散射能力差異
A. 製備瘦肉精衍生物用亞硝酸鈉低溫下將瘦肉精重氮化，與乙醯苯胺反應，過製備 型HPLC柱純化後作為瘦肉精衍生物的標準品，測定其偶氮產物在近紫外區吸收峰 的摩爾消光係數；
B. 據所得摩爾消光係數，測定Dendrimer交聯的瘦肉精共價加合物在相同紫外波長下 的吸收，確定其中所含瘦肉精的量；
C. Dendrimer交聯瘦肉精共價加合物為線性濃度梯度下，與設定量納米金粒子標記的 單抗反應，用本發明所述方法測量散射信號；
D. 相同當量游離瘦肉精衍生物在相同的濃度梯度下，與相同設定量的納米金粒子標記 單抗反應達到平衡後，用本發明所述方法測量光散射信號；
E. 回歸分析比較二者響應係數的差異，確定用Dendrimer將瘦肉精交聯成多活性位點 共價加合物對顆粒散射信號的增強效應(圖7)。
5) 用本發明所述方法均相測定瘦肉精共價加合物含量
A. 用所製備的Dendrimer交聯瘦肉精共價加合物，在其線性濃度梯度下與設定量納米 金粒子標記單抗反應，生成非共價產物複合物；
B. 用本發明所述方法測量產物複合物的光散射信號，製作標準曲線；回歸分析數據建 立所需要的響應函數關係(圖6和圖7);
C. 將已知量Dendrimer交聯瘦肉精共價加合物與健康人血清混合作為待測樣品，取適 量樣品與設定量的納米金粒子標記相同單抗反應，生成非共價產物複合物，用本發 明所述方法測量光散射信號；
D. 根據響應函數關係，確定樣品中Dendrimer交聯瘦肉精共價加合物含量，與已知量 比較；
6) 用本發明所述方法測定瘦肉精含量
A. 設定Dendrimer交聯痩肉精共價加合物量和接近等當量的對應納米金粒子標記單抗 反應體系；
B. 將設定量的瘦肉精共價加合物和不同量的游離瘦肉精標準品混勻，加入設定量的納 米金粒子標記抗瘦肉精單抗，均相競爭結合，反應生成非共價產物複合物；
C. 將設定量的Dendrimer交聯瘦肉精共價加合物同待測瘦肉精樣品混勻，加入與設定 量的納米金粒子標記抗瘦肉精單抗，均相競爭結合，反應生成非共價產物複合物；
D. 使用積分球測定不同體系的光散射信號強度；線性回歸確定響應函數(圖8);據響應
函數確定待測樣品中瘦肉精的含量；
7) 用本發明所述方法均相測定瘦肉精單抗含量
A. 設定Dendrimer交聯瘦肉精共價加合物量和接近等當量的對應納米金粒子標記單抗 反應體系；
B. 將設定量的納米金粒子標記抗痩肉精單抗同無標記的相同單抗標準品混勻；
C. 加入設定量的Dendrimer交聯瘦肉精所生成的共價加合物，在均相發生競爭結合反 應，生成對應的非共價產物複合物；
D. 用本發明所述方法測量光散射信號；並建立產物複合物光散射信號同外加抗瘦肉精 單抗待標準品的響應函數(圖9);
E. 類似方法，用未知樣品代替已知單抗，相同方法測定產物複合物的光散射信號；據 響應函數確定待測樣品中的單抗含量；
8) 用本發明所述方法測定瘦肉精的衍生物(痩肉精重氮鹽同乙醯苯胺的共價加合物)與其 單抗結合的親和力
A. 設定Dendrimer交聯瘦肉精共價加合物量和接近等當量的對應納米金粒子標記單 抗反應體系；
B. 在游離瘦肉精衍生物儘可能寬濃度範圍內，先將設定量的Dendrimer交聯瘦肉精共 價加合物同待測的痩肉精衍生物混勻，再加入納米金標記的對應單抗，均相競爭結 合達到平衡；
C. 用本發明所述的光散射檢測方式，測定游離瘦肉精衍生物對生成帶強生色團標記非 共價產物複合物散射信號的影響；
D. Scatchard作圖法分析所生成的非共價產物複合物散射信號隨外加游離瘦肉精衍生 物濃度的變化(圖10);確定瘦肉精衍生物同其對應單抗所形成複合物的解離常數。
權利要求
1.一種在親和分析過程中，用本身為多活性位點的生物分子或通過特殊策略獲得的多活性位點共價加合物，與帶強生色團標記的對應生物活性成分結合，生成有強光散射能力的非共價產物團聚物，並在螢光分光光度計等可測量光散射的儀器上，用安裝有圓柱形流式樣品管的積分球，顯著提高光散射信號的測量比例；聯用這兩種策略，建立不需分離出產物複合物的均相親和分析新方法，用於測定生物活性分子含量及相互作用的親和力，其特徵在於按如下步驟進行(一)、在親和分析的反應體系中，用特殊策略生成有強光散射能力的非共價產物團聚物，其特徵在於按如下步驟進行(1).將單活性位點生物分子的標準品，與含多個相同活潑官能團的樹狀分子或其它有類似功能的分子交聯，生成多活性位點共價加合物；本身為多活性位點的生物分子不需交聯；(2).將可與本身為多活性位點的生物分子或按步驟(1)所得的多活性位點共價加合物相結合的對應生物活性成分標準品，用有強光散射能力的生色團(如納米金或銀粒子、水溶性卟啉類物質)進行標記；(3).將本身為多活性位點的生物分子對應標準品或按步驟(1)所得的多活性位點共價加合物，與按步驟(2)所得帶強光散射能力生色團標記的生物活性成分相結合，生成有強光散射能力的非共價產物團聚物；(4).測定本身為多活性位點生物分子的含量時，用設定量的帶強光散射能力生色團標記的對應生物活性成分直接與待測樣品反應，生成有強光散射能力的非共價產物團聚物；反應達平衡後，所生成的這種非共價產物團聚物的量，與來自樣品的待測多活性位點生物分子的含量正相關；(5).測定單活性位點生物分子的含量時，先按步驟(1)製備相應的多活性位點共價加合物；測定時先將待測樣品與此多活性位點共價加合物混勻，再加入設定量的帶強生色團標記的對應生物活性成分，使其發生競爭結合；達到平衡後，所生成的有強光散射能力的非共價產物團聚物的量，與來自樣品的待測單活性位點生物分子的含量負相關；(6).測定與按步驟(2)所製備的帶強光散射能力生色團標記的生物活性成分結合性質相同的生物分子含量時，先將待測樣品與帶強光散射能力生色團標記的該生物活性成分標準品混勻，再加設定量的本身為多活性位點的相應生物分子或按步驟(1)所製備的相應多活性位點共價加合物，使其發生競爭結合；反應達到平衡後，所生成的有強光散射能力的非共價產物團聚物的量，與來自樣品的待測生物活性分子的含量負相關；(7).測定生物活性分子之間親和力時，令本身為多活性位點的生物分子或按步驟(1)所製備的多活性位點共價加合物為A，按步驟(2)所製備的帶強光散射能力生色團標記的對應生物活性成分為B；在反應體系中固定A和B的濃度且二者比例接近1∶1；測定時，先在反應體系中加入待測成分(使其濃度在儘可能寬範圍內變化)，再加入與此待測成分有相同結合性質的生物活性成分(A或B)，混勻後加入設定量的可與待測成分結合的生物活性成分(B或A)，使其發生競爭結合；反應達平衡後，所生成的有強光散射能力的非共價產物團聚物的量與外加待測成分的量負相關；再用Scatchard作圖法分析所生成的有強光散射能力的非共價產物團聚物的量對外加待測成分量的響應，確定解離常數表示二者之間相互作用的親和力；(8).在步驟(2)中，還可用一對有螢光共振能量轉移效應的生色團分別標記同一種生物活性成分，將二者等比例混勻後，再與本身為多活性位點的相應生物分子或步驟(1)所得的相應多活性位點共價加合物結合，使其生成有強螢光共振能量轉移效應的非共價產物團聚物；然後參照步驟(4)到步驟(7)表徵生物分子間的相互作用。(二)、用安裝有流式樣品管的積分球(其規格與所用螢光分光光度計等測量儀器相匹配。以下所述積分球及圓柱形流式樣品管的參數均與Shimadzu RF-540螢光分光光度計匹配)，匯聚在三維空間不均勻分布的光散射或螢光信號用於檢測，其特徵在於按如下步驟進行(1).用石英或玻璃製造圓柱形流式樣品管(內徑0.40cm，外徑0.60cm，長2.5cm)；測量前用緩衝液以流動注射方式清洗；(2).製造用於匯聚光散射信號的積分球；在此積分球壁上開三個園孔(分別正對螢光分光光度計等光散射信號測量儀器的激發窗口和檢測窗口的兩園孔直徑都為0.62cm；用於導出透射光的園孔直徑為0.82cm)；其中，孔中心連線過積分球球心的一對園孔用於安置圓柱形流式樣品管(使圓柱形流式樣品管的軸心線與螢光分光光度計等光散射信號測量儀器的激發窗口軸心線儘量重合)，另一園孔作為光散射匯聚後進入檢測窗口的出口(作為光散射出口的園孔，其軸心線與螢光分光光度計等光散射信號測量儀器檢測窗口的軸心線儘量重合)；將透射光用內部強吸光的玻璃直管(內徑0.61cm，外徑0.81cm)引導到積分球以外，樣品管、導光管與積分球壁上園孔之間的空隙都用合適的墊圈密封；將焦距60cm的匯聚鏡(焦距應遠遠大於所用積分球的直徑)安裝在激發窗口和圓柱形流式樣品管之間，將激發光匯聚成焦點位於積分球以外的近平行激發光(避免激發光透過樣品管直接進入積分球內而造成很高的背景)，並垂直地照射到圓柱形樣品管針對激發窗口的底面上；(3).將激發光通路和圓柱形流式樣品管用內徑3.0cm的不透光塑料直管連接(此直管的軸心線與激發光通路的軸心線儘量重合)，將積分球匯聚的散射光經出射園孔與檢測窗口用內徑3.0cm的不透光塑料直管連接(此直管的軸心線與檢測窗口的軸心線儘量重合)，儘可能降低背景和雜散光；(4).用注射器手動或步進馬達自動把適量液體樣品輸送到圓柱形流式樣品管內；(5).用安裝了積分球的螢光分光光度計等光散射測量儀器，測量光散射強度；(6).與(一)中所述步驟(8)對應，用安裝了積分球的螢光分光光度計等儀器，測量共振能量轉移所產生的螢光。
2. 根據權利要求1中(一)的步驟(l)所述，其特徵在於將單活性位點的生物分子與含多個相同活潑官能團的樹狀分子或其它有類似功能的分子交聯，生成多活性位點共價加合物；這是單活性位點生物分子在親和反應中生成非共價產物團聚物的必要前提，也是本發明的創 新點之一。
3. 根據權利要求1中(一)的步驟(3)所述，其特徵在於用本身為多活性位點的生物分子 或多個活性位點共價加合物，與帶強光散射能力生色團標記的對應生物活性成分結合，生成 有強光散射能力的非共價產物團聚物。這是本發明的關鍵創新點之一。
4. 根據權利要求1中(二)的步驟(1)到步驟(4)所述，其特徵在於以流動注射方式進樣， 並用圓柱形流式樣品管盛裝液體樣品，增加信號測量重複性和液體樣品的光散射效率。
5. 根據權利要求1中(二)的步驟(1)到步驟(4)所述，其特徵在於在螢光分光光度計等光 散射信號測量儀器上，用裝有流式樣品管的積分球匯聚分布在三維空間的光散射信號進行檢 測。這也是本發明的創新點之一。
6. 根據權利要求1中(一)的步驟(8)和(二)的步驟(6)所述，其特徵在於可用能產生強熒 光共振能量轉移效應的一對生色團分別標記參與親和反應的同一種生物活性成分，再與本身 為多活性位點的相應生物分子或相應多活性位點共價加合物結合，從而使所生成的非共價產 物團聚物中產生螢光共振能量轉移效應，從而不需分離出其產物團聚物，，1」用螢光表徵生物 分子之間的相互作用。
7. 根據權利要求2到權利要求5所述，本發明的特徵在於用有多個相同活性位點的生物分子(天然或交聯生成)與帶強光散射能力的生色團標記的生物活性成分結合，生成有強光 散射能力的非共價產物團聚物，再用積分球增強的光散射檢測技術作為檢測手段，從而建立 一種通用性的均相親和分析新方法。
全文摘要
一種用有多個相同官能團的樹狀分子或其它有類似功能的分子，將單活性位點生物分子交聯，生成多活性位點共價加合物(本身為多活性位點的生物分子不需交聯)，再與帶強光散射能力的生色團所標記的對應生物活性成分結合，生成非共價產物團聚物，並聯用積分球增強光散射信號測量比例的光散射檢測技術，不需從反應混合物中分離出這種非共價產物複合物而直接測定其含量，從而建立起來的均相親和分析新方法，可用於免疫分析和配體類藥物離體篩選；用一對有強螢光共振能量轉移效應的生色團代替有強散射能力的生色團進行標記，也可建立基於測定螢光共振能量轉移的類似均相親和分析方法。
文檔編號G01N21/64GK101178360SQ200710092738
公開日2008年5月14日 申請日期2007年9月24日 優先權日2007年9月24日
發明者於明安, 飛 廖, 楊曉蘭, 謝國明, 萍 鄧, 巍 陸 申請人:重慶醫科大學