一種用於冬蟲夏草寄主感染的菌種材料及寄主感染方法
2023-06-04 04:56:41 1
專利名稱：一種用於冬蟲夏草寄主感染的菌種材料及寄主感染方法
技術領域：
本發明涉及一種冬蟲夏草培養方法，更具體的說涉及一種用於冬蟲夏草寄主感染的菌種材料及寄主感染方法。
背景技術：
冬蟲夏草Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc 又名蟲草,系麥角菌科蟲草屬真菌中國被毛孢寄生蝙蝠蛾屬昆蟲幼蟲體內形成的蟲菌複合體，是我國特有珍稀名貴中藥材。具有補肺益腎、止咳化痰，主治咳嗽、咳血、陽痿遺精、病後體虛、老年慢性咳嗽等疾病。冬蟲夏草主產於我國西藏、青海、雲南、四川和甘肅等省區海拔3500-5200m局部高寒山區草甸地帶。天然資源十分有限，近年來採挖過度造成生態環境的惡化，天然資源日趨枯竭。因此， 人工栽培冬蟲夏草勢在必行。人工培殖的關鍵是冬蟲夏草菌能否侵染寄主昆蟲，進入到寄主的體腔內，並在體腔中繁殖生長，最後產生子座，形成冬蟲夏草藥材。野生冬蟲夏草寄主蝙蝠蛾幼蟲的的感染途徑為，蝙蝠蛾屬昆蟲幼蟲在野生環境中通過體表或食道感染中華被毛孢菌，但是上述方法，染菌率低，周期長，而且不能進行規模化生產。目前寄主人工感染方法為將中國被毛孢孢子菌液採用塗抹於寄主體表、注射到寄主體內、灌注或通過飼料從寄主食道進入寄主體內。塗永勤等在期刊《食用菌》2010 (3)中發表的《蝠蛾屬幼蟲感染冬蟲夏草茵的實驗研究》公開了多種以中華被毛孢孢子菌液作為冬蟲夏草寄主感染的菌種材料。但是上述方法存在中華被毛孢菌種分離純化難度大，且幼蟲染菌率和染菌後存活率較低的問題。專利申請人在國家自然科學基金面上項目「冬蟲夏草寄主幼蟲適應飼料的機理及其生態適合度評估」(編號為81072997)、「冬蟲夏草寄主昆蟲擬青黴病的分子流行病學研究」(編號為81173479)和國家自然科學基金青年基金項目「人工繁育冬蟲夏草寄主幼蟲發育變異的影響因素研究」(項目批准號為30901964)的資助下對冬蟲夏草寄主感染的菌種材料進行了研究。
發明內容
為解決上述問題，本發明提供了一種採用冬蟲夏草菌皮代替中國被毛孢孢子菌作為冬蟲夏草寄主染菌的菌種材料。具體內容為一種用於冬蟲夏草寄主感染的菌種材料，所述用於冬蟲夏草寄主飼養中寄主感染的菌種材料為冬蟲夏草菌皮。所述的冬蟲夏草菌皮為冬蟲夏草採挖出來時，冬蟲夏草僵蟲菌核表面覆蓋的菌膜。所述冬蟲夏草菌皮的提取方法為將挖出來且未經過任何清理的冬蟲夏草清理掉表面的顆粒狀土塊以及雜物，保留冬蟲夏草僵蟲菌核表面與僵蟲菌核外形相似的一層與土混合的菌膜外殼；將與土混合的菌膜外殼剝落收集得到冬蟲夏草菌皮。一種冬蟲夏草寄主的寄主感染方法，為將上所述冬蟲夏草寄主感染的菌種材料的溶混懸液體灌注到冬蟲夏草寄主蟲口中或拌到冬蟲夏草寄主飼料中，對冬蟲夏草寄主進行飼養。一種冬蟲夏草寄主的寄主感染方法，為將上所述冬蟲夏草寄主感染的菌種材料或粉末直接拌入冬蟲夏草寄主飼料或直接餵到冬蟲夏草寄主蟲口。一種冬蟲夏草寄主的寄主感染方法，所述的寄主感染的方法為將權利要求3所述冬蟲夏草寄主感染的菌種材料溶混懸液體注射到蟲體中。
一種冬蟲夏草寄主的寄主感染方法，為將上所述冬蟲夏草寄主感染的菌種材料溶混懸液體直接噴淋到冬蟲夏草寄主蟲體上或將冬蟲夏草寄主感染的菌種材料混入到冬蟲
夏草寄主的培養基中。本發明的有益技術效果是本發明提供的採用冬蟲夏草菌皮代替中國被毛孢孢子菌作為冬蟲夏草寄主染菌的菌種材料的方法，菌種材料的製備成本更低；更重要的是，冬蟲夏草菌作為菌種材料，冬蟲夏草寄主的存活率和感染率較接種中國被毛孢孢子菌菌液，寄主幼蟲的感染率和存活率都顯著提高。
具體實施例方式實施例I用於冬蟲夏草寄主感染的菌種材料的製備方法採集長成的冬蟲夏草，具體的採集方法為撬起冬蟲夏草周圍的表土，不能觸及冬蟲夏草的僵蟲菌核表面；剝落冬蟲夏草周圍的土塊，得到被一層外形與僵蟲菌核形態相似的菌膜與泥土混合物構成的外殼包裹的冬蟲草夏草；收集上述菌膜與泥土混合物構成的外殼，得到冬蟲夏草菌皮。將冬蟲夏草菌皮用水超聲融化，得到冬蟲夏草菌皮的混懸液，過濾混懸液中的泥土，得到第一次水溶液；將過濾出的泥土用水洗滌，過濾得到第二次水溶液，合併第一次和第二次水溶液，濃度為每Ig菌皮製備3mL菌皮水溶液，得到用於冬蟲夏草寄主感染的菌種材料。實施例2冬蟲夏草寄主的感染方法的考察I從已感染中國被毛孢菌的蝙蝠蛾幼蟲活體得到蝙蝠蛾幼蟲體液，將體液用接種針粘上在無菌條件下塗抹(即接種)於平板培養基上。將塗抹了帶菌活幼蟲體液的平板培養基置於8 18°C恆溫箱內培養。3天後，每天觀察一次，及時汰除雜菌，10 16天後方在平板培養基的接種處形成深灰、繼而轉變成棕黃乃至黑色的中國被毛孢菌落。將分離出來的中國被毛孢菌，從平培養基板上轉入行的培養基上，置18°C條件下培養，接種體中心呈黃褐色、菌落堅硬，有稀疏平貼的纖細菌絲，進而形成冬蟲夏草菌的分生孢子。用無菌水將其孢子洗下，配製成孢子懸浮液；濃度為每毫升105個孢子。收集小金蝠蛾Hepialus xiaojinensisTu etMa幼蟲,2400條蟲六等分放於8個Im2乾淨的經消毒的搪瓷盤中，每組300條蟲，上一些經消毒的幹樹葉，以利蟲子活動和隱蔽，噴一些蒸餾水保持溼度。先用無菌的珠芽寥、胡蘿蔔、紅苕、菜葉飼餵7d,使蟲體恢復生長。然後清除剩餘全部食用。停餵2 3d後，取上述任意3組飼餵孢子懸浮液噴淋過的珠芽寥、胡蘿蔔、紅苕、菜葉，作為對照組I ;取任意4組飼餵實施例I得到的冬蟲夏草寄主感染的菌種材料噴淋過的珠芽寥、胡蘿蔔、紅苕、菜葉，作為實驗組I ;每天清除剩餘物，第2d用同樣方法飼喂，連餵30d，觀察蟲生長和活動情況，這時剔除那些生長健壯。活動敏捷，反應靈敏的蟲，然後上覆IOcm幼蟲生長區採回的高山草甸土及草皮，控制溫度在I 5°C，繼續飼喂，分別在I個月、3個月、6個月和I年後，分別將實驗組和對照組個一組挖出蟲體，計算感染僵化的成活的和死亡的蟲體數；得到混合飼料飼餵方法組數據。按I個月、3個月、6個月和I年的時間階段定期收集幼蟲群體內隨機抽取10頭幼蟲進行調查。將幼蟲體表面消毒後，採用特製的工具在無菌條件下抽取微量的血淋巴製片，鏡檢觀察，記錄血淋巴內菌體的形態。追蹤觀察幼蟲僵化情況。在對菌體進行觀察的同時，抽取微量帶菌血淋巴塗抹在滅菌PDA培養基平板上,置於18°C恆溫箱內培養。每日一次取出培養皿鏡檢觀察菌體生長發育的狀態，或挑取菌體及其培養物製片觀察。待塗布菌體處形成菌落，挑取菌落表面的菌絲體製片鏡檢觀察；具體結果如表I所示。表I不同菌種材料幼蟲的感染情況 菌種材料檢測時間接種幼蟲數/頭存活幼蟲數/頭感染幼蟲數/頭感染率/%
對照組I I個月後 3002908930.68
3 個月後 30024511546.93
6 個月後 30020816880. 10
_I 年後_300_ITl_155_90. 64_
實驗組I I個月後 300 284 231 81.333 個月後 300 221 210 95.026 個月後 300 187 187 100.00_I 年後_300_180_180_100. 00_結果表明，寄主幼蟲感染冬蟲夏草菌是一個複雜的過程，需要一定的時間，才能完成整個侵染過程。由表I可知，採用實施例I所述的用於冬蟲夏草寄主感染的菌種材料，寄主幼蟲接種I個月後即可感染上冬蟲夏草菌。接種6個月後感染達高峰，感染率為100%。實施例3冬蟲夏草寄主的感染方法的考察2收集小金蝠蛾Hepialus xiaojinensisTu etMa幼蟲，2400條蟲六等分放於8個Im2乾淨的經消毒的搪瓷盤中，每組300條蟲，上一些經消毒的幹樹葉，以利蟲子活動和隱蔽，噴一些蒸餾水保持溼度。先用無菌的珠芽寥、胡蘿蔔、紅苕、菜葉飼餵7d,使蟲體恢復生長。將上述6組，清洗蟲子表面，用3%雙氧水作表面消毒後；選取任意4組，用微型注射槍，在顯微鏡下將實施例2製備的孢子懸浮液通過蟲體表面的微孔道注入蟲體血腔內，作為對照組II ;選取任意4組，用微型注射槍，在顯微鏡下將實施例I所述的用於冬蟲夏草寄主感染的菌種材料通過蟲體表面的微孔道注入蟲體血腔內，作為實驗組II ；30d後觀察蟲生長和活動情況，這時剔除那些生長健壯，活動敏捷，反應靈敏的蟲，然後上覆IOcm幼蟲生長區採回的高山草甸土及草皮，控制溫度在I 5°C，繼續飼喂，分別在I個月、3個月、6個月和I年後，挖出蟲體，計算感染僵化的、成活的和死亡的蟲體數；得到注射方法組數據。按I個月、3個月、6個月和I年的時間階段定期收集幼蟲群體內隨機抽取10頭幼蟲進行調查。採用是實施例2所述的檢測方法，具體結果如表2所示。表2不同菌種材料幼蟲的感染情況
權利要求
1.一種用於冬蟲夏草寄主感染的菌種材料，其特徵在於所述用於冬蟲夏草寄主飼養中寄主感染的菌種材料為冬蟲夏草菌皮。
2.根據權利要求I所述的用於冬蟲夏草寄主感染的菌種材料，其特徵在於所述的冬蟲夏草菌皮為冬蟲夏草採挖出來時，冬蟲夏草僵蟲菌核表面覆蓋的菌膜。
3.根據權利要求2所述的用於冬蟲夏草寄主感染得菌種材料，其特徵在於所述冬蟲夏草菌皮的提取方法為將挖出來且未經過任何清理的冬蟲夏草清理掉表面的顆粒狀土塊以及雜物，保留冬蟲夏草僵蟲菌核表面與僵蟲菌核外形相似的一層與土混合的菌膜外殼；將與土混合的菌膜外殼剝落收集得到冬蟲夏草菌皮。
4.一種冬蟲夏草寄主的寄主感染方法，其特徵在於所述的寄主感染的方法為將權利要求3所述冬蟲夏草寄主感染的菌種材料的溶混懸液體灌注到冬蟲夏草寄主蟲口中或拌到冬蟲夏草寄主飼料中，對冬蟲夏草寄主進行飼養。
5.一種冬蟲夏草寄主的寄主感染方法，其特徵在於所述的寄主感染的方法為將權利要求3所述冬蟲夏草寄主感染的菌種材料或粉末直接拌入冬蟲夏草寄主飼料或直接餵到冬蟲夏草寄主蟲口。
6.一種冬蟲夏草寄主的寄主感染方法，其特徵在於所述的寄主感染的方法為將權利要求3所述冬蟲夏草寄主感染的菌種材料溶混懸液體注射到蟲體中。
7.—種冬蟲夏草寄主的寄主感染方法，其特徵在於所述的寄主感染的方法為將權利要求3所述冬蟲夏草寄主感染的菌種材料溶混懸液體直接噴淋到冬蟲夏草寄主蟲體上或將冬蟲夏草寄主感染的菌種材料混入到冬蟲夏草寄主的培養基中。
全文摘要
本發明提供了一種採用冬蟲夏草菌皮代替中國被毛孢孢子菌作為冬蟲夏草寄主染菌的菌種材料。具體內容為一種用於冬蟲夏草寄主感染的菌種材料，所述用於冬蟲夏草寄主飼養中寄主感染的菌種材料為冬蟲夏草菌皮；本發明提供的採用冬蟲夏草菌皮代替中國被毛孢孢子菌作為冬蟲夏草寄主染菌的菌種材料的方法，菌種材料的製備成本更低；更重要的是，冬蟲夏草菌作為菌種材料，冬蟲夏草寄主的存活率和感染率較接種中國被毛孢孢子菌菌液，寄主幼蟲的感染率和存活率都顯著提高。
文檔編號A01K67/033GK102792855SQ20121033858
公開日2012年11月28日 申請日期2012年9月13日 優先權日2012年9月13日
發明者劉飛, 張德利 申請人:重慶市中藥研究院