一種啟動子BgIosP516、其製備方法及用途的製作方法

2023-06-04 19:57:56

專利名稱:一種啟動子BgIosP516、其製備方法及用途的製作方法
技術領域：
[0001]本發明屬於分子生物學領域，涉及一種啟動子，具體地，涉及一種來源於水稻的啟動子。本發明還涉及含有該啟動子的重組載體、含有該重組載體的重組細胞、轉化有所述啟動子的愈傷組織、一種製備轉基因植物的方法、以及所述啟動子的製備方法及用途。
背景技術：
啟動子是基因的一個組成部分，通常位於結構基因5』端上遊，是RNA聚合酶識別、結合和開始轉錄的一段DNA序列。啟動子能夠指導全酶(holoenzyme)同模板正確結合,活化RNA聚合酶，啟動基因轉錄，從而控制基因表達(轉錄)的起始時間和表達的程度。在轉基因植物中，啟動子是影響轉基因表達效率的重要因素之一，選擇高效率的啟動子是高效率表達外源基因的關鍵。
根據啟動子的轉錄模式可將其分為3類組成型啟動子、組織或器官特異性啟動子和誘導型啟動子。所謂組成型啟動子是指在組成型啟動子調控下，不同組織器官和發育階段的基因表達沒有明顯差異，因而稱之組成型啟動子。雙子葉植物中最常使用的組成型啟動子是花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子。另一種高效的組成型啟動子CsVMV是從木薯葉脈花葉病毒(cassava vein mosaic virus)中分離的。
人們高度重視從植物本身克隆組成型啟動子。例如肌動蛋白(actin)和泛素(ubiquitin)等基因的啟動子已被克隆。用這些啟動子代替CaMV 35S啟動子，可以更有效地在單子葉植物中驅動外源基因的轉錄。Naomi等分別從擬南芥的色氨酸合酶β亞基基因和植物光敏色素基因中克隆了相應啟動子，用其代替CaMV 35S啟動子，在轉基因菸草中也取得了很好的表達效果(Plantbiotechnology, 2002,19 (I) : 19-26)。
單子葉植物基因中常見的啟動子有Ubi啟動子(Plantubiquitinpromoter)、Actin 啟動子(Plant Actin promoter)和 Adh-I 啟動子(Maize alcohol dehydrogenase
Ipromoter)。
Ubi啟動子以其啟動效率高、甲基化程度低、遺傳性狀穩定等因素而倍受青睞。目前，已經從很多泛素基因中分離得到啟動子序列，例如玉米基因組中的Ubi-I啟動子、水稻泛素RUBQ2啟動子、擬南芥泛素啟動子、向日葵泛素UbBl啟動子、菸草泛素Ubi. U4啟動子、馬鈴薯泛素Ubi7啟動子、番茄泛素Ubil-I啟動子、大麥泛素Mubl啟動子，等等。玉米泛素Ubi-I啟動子已經廣泛地應用於玉米、小麥、水稻等單子葉植物中，水稻泛素RUBQ2啟動子在水稻和甘蔗中也有較多的應用。
Actin啟動子1990年由康奈爾大學的McElroy等首次在水稻中發現,屬於強組成型啟動子。Actin啟動子在單子葉禾本科中作用顯著，但是鄰近科屬的植物中的基因調控功能卻十分不理想。因此，許多相關研究通過其它單子葉植物尋找Actin啟動子，並成功在香蕉、甜瓜、玉米和擬南芥中陸續發現。Actin啟動子由於對基因表達的強調控作用，在單子葉植物優良性狀的轉基因中已經得到越來越廣泛的應用。
Adh-I啟動子調控乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase)基因，對植物在缺氧環境下乙醇脫氫酶的表達至關重要。Adh-I啟動子對單子葉植物特別是穀類植物如水稻、燕麥和大麥，和少部分雙子葉植物如菸草，基因的調控功能比花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動子提高10-50倍。Adh-I啟動子主要應用於單子葉植物，對絕大部分雙子葉植物基因表達的調控效果都很有限。
單子葉植物是被子植物的主要類群，單子葉植物中的禾本科、百合科、棕櫚科和天南星等，是非常重要的農業作物。單子葉植物基因的強效啟動子，能夠調控植物高效率表達具有特殊性狀的外源基因，對優良作物的分子育種研究意義重大。
在強效啟動子相關研究領域，發現並驗證了許多單子葉植物的啟動子。此外，雙子葉植物中的一些強效啟動子如CsVMV啟動子、番茄E8啟動子、白藜蘆醇合酶基因Vstl啟動子等高效啟動子，在單子葉植物中也有很強的基因調控作用。
儘管已經有上述已知的單子葉植物的啟動子，本發明人通過對水稻基因組的深入研究，提供了一種新的來源於單子葉植物的啟動子，所述啟動子能夠用於調控單子葉植物 甚至是雙子葉植物中目的基因表達，為研究單子葉植物和雙子葉植物中目的基因表達提供了一種新的工具和選擇。

發明內容
本發明人經過大量的試驗和創造性的勞動，從水稻日本晴(Oryzasativa L. ssp.japonica cv. Nipponbare)中得到了一種啟動子,並且本發明人驚奇地發現,該啟動子不僅能夠調控單子葉植物(例如水稻)中目的基因的表達，而且能夠調控雙子葉植物(例如菸草)中目的基因的表達。由此提供了下述發明
本發明的一個方面提供了一種具有SEQ ID NO :1所不核苷酸序列的啟動子。在本發明中，所述啟動子的具體鹼基序列長度為2533個鹼基，如SEQ ID NO :I所示
TCTCTTGGTACTTCAGTTCGCTCATTTATTTCTCATAATTTAAATTTCAAAGTAATAAGCGATAGATCAGGATCCATGATTTGAACATGCAACTTTAAAGTAATGCAGTAAGATATAGATCGGTGTCCATGACTTGAACATGCATGAACAGTAACCCCACTCGTGAGTTAAAAAGATAGATCCATGATTTAAACATACATTCGCAGATATTTGATCATTATATGTTGTAATTATATTCTCATAAAAAAAACTAAAAATGCTTCATAGCATTTGTATATTATGCCAATATTGAGATAATTTCGATATCTCATATGTTTTAGATTGGAACAGATCACGAAAGTTTTTCTTCGAAAAGTTATGGTCATTAGGACATGATGGATTTGAGGTAACAAAATAGATGAGATTTATTAAAACCCTTGAAATAGTCCAACAATCCAGCGCTAACATTTAGCACAGTGTAATTCAAAAGAAGACAACCACAGAAACACACAGGGGATGTTTTAAACTCCAATTTTTATATATTTGGCATTATTCAAATTGCAAACAAATATGATGACTCTCTTTCTCAAAGAAACATATGCCGTTAGGGTGATCCCAGCGCTTCACTTAGAATGGTTTTTCATAGCATTAAATGATATGCCACGTAGGAAAAAACATGATGTGCCATTTTATTAACTTAGGAAAGAGAAGAAAATTGGGTCTTCTCAAAATGATCATCATCTAACAAAATGTCTCTTTGTTTATTTGTGCAAAGAGTAAATGTGCATCGTGCAATGTCATGCATGCTGCCAACCAAGATTAATTTCTATTTAGTTGAACCTGTGCAACATTTAAAGTGTGAAGTAATTTTTGTTGGACTTGAAGCGACAAAGCACCTTGGTCGATTAGGCCATCCCCAACCCATGGTGTCCATGGGTGGTGTCTAGAGCAGTGAGAGATCAATAAATGCATATATGGACACTACCTCCCCATTGCATCGTTTATATACCAGTTTTCATAGGCAAAAAAAAATTAGTAGCTCTTTGCATGTAACATTAACAGAGGAGGGTCAGCTGTGGCAAGCAAGCAAGCAGACGCGGGAGGGGAGGCGCGCAGCAGGCATGGTGACGGGGTAGGGCGCAGCGGATCGAGATGCGAGGATTTTTTTTTGGGGGGGTGGGGTGGGGGGAGAGAAACGAGTCATCCAACCCAACGCGGATTTAGCTAGTTTCCAGTGCCTTGGAACAGCCGCCGAAACGGTGTCGCGCATGCGACCTGGTTTCTATGTTTTTGCTTCTTTCTCTTCTTTTATTCCGTTGCCACATCAACTTTTTGTCTAGTTGGCAGCCTAATTAATTCTATGGAAACCAGGTGACATGGAGGGTTGGGGACATGGTGGAAAAAACCGGAACGGGCCGACAGTTCAACCGGAAAAAACCAGAACCCGTTCAGTTCAAAAGAAAGACCGGACATGCATATGACCCGCTTTGAACCGGCAGAACCGGTCGGTTTTTCTATGAACCGGTCATTAAACCGTCCCCGGTTAGACCGAACAAGCCACAATAATCTTGAAATGGGCCTTGATGTGGCCCAATTGGTCTGCCTAGAGCGTTTTGGTTGGCAAAAATCAATCTCCTATTCTCGGCACGTGTGATATACAATGGTAAGTGAGATATACAATTCTCGGCACGGCTACATTACAAGGTGTCGCATTGTGTCAATGTTTGGTTAATTTGCTAGATTCACATAATACATGCCAGGAAGTTCAGAACAATGTGTTGCCTTTCACCGGAAAACTTTGTTGGAGCAAATGCCTTCTTCTTTTTTGCTTCTGCTTCTTGAGTCCATGTGGAGGAAGCAGTAGATAGCTGATGATATCAGGATTCCTTCTGTGTCTGTGTAGGTGTAGCAACACCACTATAATTTTTATTTAGCAACACAATATCAATTTGGTCTATAAAAGTATGAATTAAATCAATCCCCAACCACAATTAGAGTAAGTTGGTGAGTTATTGTAAAGCTCTGCAAAGTTAATTTAAAAGTTATTGCATTAACT TATTTCGTATCACAAACAAGTTTTCACAAGAGTATTAATGGAACAATGAAAACCATTGAACATACTATAATTTTTTTTCTTACTGAAATTATATAATTCAAAGAGCATAAACCCACACAGTCGTAAAGTTCCACGTGTAGTGCATTATCAAAATAATAGCTTACAAAACATAACAAACTTAGTTTCAAAAGTTGCAATCCTTATCACATTGACACATAAAGTGAGCGATGAGTCATGTCATTATTTTTTTGCTCACCATCATGTATATATGATGGGCATAAAAGTTACTTTGATGATGATATCAAAGAACATTTTTAGGTGCACCTAACAGAATATCCAAATAATATGACTCACTTAGATCCTAATATAGCATCAAGCAAAACTAACACTCTAAAGCAACCGATAGGGAAACATCTATAAATAGACAAGCATAATGAAAACCCTCCTCATCCTTCACACAATTCAAACATTATAGTTGAAGCATAGTAGTAGAATCCT(SEQ ID NO 1)
在本發明中，將SEQ ID NO :1所示的啟動子序列稱為啟動子BgIosP516，或簡稱為P516啟動子。
帶有該啟動子和⑶S(0 -葡萄糖苷酸酶,其英文名稱為β-glucuronidase,簡稱為GUS)基因的水稻愈傷組織以及轉基因水稻苗經GUS染色實驗後，所述水稻愈傷組織和轉基因水稻苗的根、葉等變為藍色。帶有該啟動子和GUS基因的轉基因菸草苗經GUS染色實驗後，所述轉基因菸草苗的根、葉等也變為藍色。
本發明的又一方面涉及具有與SEQ ID NO :1所示核苷酸序列互補的序列的啟動子。
本發明的又一方面還涉及SEQ ID NO :1所示啟動子的具有啟動子功能的選自如下的變體
I)在高等嚴緊條件下與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，
2)對SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列進行一個或多個鹼基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列，和
3)與SEQ ID NO :1所不的核苷酸序列具有至少90%的序列同一'丨生的核苷酸序列。
典型地，「雜交條件」根據測量雜交時所用條件的「嚴緊性」程度來分類。嚴緊性程度可以以例如核酸結合複合物或探針的解鏈溫度(Tm)為依據。例如，「最大嚴緊性」典型地發生在約Tm-5°C (低於探針Tm 5°C )高等嚴緊性」發生在Tm以下約5_10°C;「中等嚴緊性」發生在探針Tm以下約10-20°C ;「低嚴緊性」發生在Tm以下約20_25°C。作為替代，或者進一步地，雜交條件可以以雜交的鹽或離子強度條件和/或一或多次的嚴緊性洗滌為依據。例如，6XSSC =極低嚴緊性；3XSSC =低至中等嚴緊性；1XSSC =中等嚴緊性；O. 5XSSC =高等嚴緊性。從功能上說，可以採用最大嚴緊性條件確定與雜交探針嚴緊同一或近嚴緊同一的核酸序列；而採用高等嚴緊性條件確定與該探針有約80%或更多序列同一性的核酸序列。
對於要求高選擇性的應用，典型地期望採用相對嚴緊的條件來形成雜交體，例如，選擇相對低的鹽和/或高溫度條件。Sambrook等(Sambrook, J.等(1989)分子克隆,實驗室手冊，Cold Spring HarborPress, Plainview, N. Y.)提供了包括中等嚴緊性和高等嚴緊性在內的雜交條件。
為便於說明，用於檢測本發明的多核苷酸與其它多核苷酸雜交的合適的中度嚴緊條件包括用 5XSSC、0. 5% SDS、1. OmM EDTA(pH8. O)溶液預洗；在 50-65°C下在 5XSSC 中雜交過夜；隨後用含O. 1% SDS的2X、0. 5X和O. 2XSSC在65°C下各洗滌兩次20分鐘。本領域技術人員應當理解，能容易地操作雜交嚴緊性，如改變雜交溶液的含鹽量和/或雜交溫度。例如，在另一個實施方案中，合適的高度嚴緊雜交條件包括上述條件，不同之處在於雜交溫度升高到例如60-65°C或65-70°C。
在本發明中，所述在高等嚴緊條件下與SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列雜交的核 苷酸序列，其具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動子活性。
在本發明中，所述對SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列進行一個或多個鹼基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列，是指分別或同時在所述核苷酸序列的5』端和/或3』端，和/或序列內部進行例如不超過2-45個,或者不超過2-30個,或者不超過3-20個,或者不超過4-15個,或者不超過5-10個,或者不超過6-8個的分別用逐個連續整數表示的鹼基的取代、缺失、添加修飾。
在本發明中，所述對SEQ ID NO : I所示的核苷酸序列進行如上述一個或多個鹼基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列具有與SEQ IDNO 1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動子活性。
通過一種多核苷酸進行說明，其所具有的核苷酸序列例如與SEQID NO 1的參考核苷酸序列至少具95%的「同一性」是指在SEQ IDNO 1的參考核苷酸序列之每100個核苷酸中，該多核苷酸的核苷酸序列除了含有多達5個核苷酸的不同外,該多核苷酸之核苷酸序列與參考序列相同。換句話說，為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95%相同的多核苷酸，參考序列中多達5%的核苷酸可被刪除或被另一核苷酸替代；或可將一些核苷酸插入參考序列中，其中插入的核苷酸可多達參考序列之總核苷酸的5% ;或在一些核苷酸中，存在刪除、插入和替換的組合，其中所述核苷酸多達參考序列之總核苷酸的5%。參考序列的這些突變可發生在參考核苷酸序列的5』或3』末端位置，或在這些末端位置之間的任意地方，它們或單獨散在於參考序列的核苷酸中，或以一個或多個鄰近的組存在於參考序列中。
在本發明中，用於確定序列同一性和序列相似性百分數的算法是例如BLAST和BLAST 2. O 算法，它們分別描述在 Altschul 等(1977)Nucl. Acid. Res. 25 =3389-3402 和Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403_410。採用例如文獻中所述或者默認參數，BLAST和BLAST 2. O可以用於確定本發明的核苷酸序列同一性百分數。執行BLAST分析的軟體可以通過國立生物技術信息中心(NCBI)為公眾所獲得。
在本發明中，所述與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列包括與SEQ ID NO :1所公開序列基本同一的多核苷酸序列，例如當採用本文所述方法(例如採用標準參數的BLAST分析)時，與本發明多核苷酸序列相比含有至少90%序列同一性、優選至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的序列同一性的那些序列。
在本發明中，所述與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動子活性。
本發明中，所述的啟動子來源於單子葉植物；具體地，為禾本科；更具體地，為稻屬或水稻，例如所述水稻為日本晴(Oryza sativaL. ssp. japonica cv. Nipponbare)。水稻日本晴種子已經於2009年12月18日保藏於中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCNO :P200910，保藏單位地址為中國.武漢.武漢大學，郵編430072 ;水稻日本晴的保藏記載在公開號為CN 101864418A的中國專利申請(申請號為200910249575. 6，
公開日為2010年10月20日)中。
本發明的又一方面，涉及一種核酸構建體，包含本發明的啟動子，以及與啟動子可 操作地連接的基因，其中啟動子與基因的來源相同或者不同。
在本發明中，術語「可操作地連接」是指兩個或多個核苷酸區域或核酸序列的功能性的空間排列。在本發明的核酸構建體中，例如，啟動子被置於所述基因的核酸序列的特定位置，例如啟動子位於所述基因核酸序列的上遊位置，使得核酸序列的轉錄受到該啟動子區域的引導，從而，啟動子區域被「可操作地連接」到該基因的核酸序列上。所述基因一般是需要提高轉錄水平的任何核酸序列，或者，可設計本發明所述啟動子和基因以便下調特定核酸序列。也就是通過將啟動子與反義方向的基因相連來實現。
所述「可操作地連接」可以通過基因重組的手段實現，具體地，所述核酸構建體為重組核酸構建體。在本發明一個具體的實施方式中，所述基因為⑶S基因。
本發明的又一方面，還涉及一種含有本發明的啟動子或核酸構建體的載體。具體地，為重組載體。所述重組載體可以通過將上述啟動子或核酸構建體插入到克隆載體或表達載體而得到。
適於構建本發明所述重組載體的克隆載體包括但不限於，例如pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pMD19-T、pMD20-T、pMD18-T SimpleVecter、pMD19_T Simple Vecter 等。
適於構建本發明所述的表達載體包括但不限於，例如pBI121、pl3W4、pGEM等。
在本發明的一個實施方案中，所述重組載體為pMD18-T+P516重組載體或p8+P516
重組載體。
本發明的又一方面還涉及含有本發明的啟動子或核酸構建體或重組載體的重組細胞。所述重組細胞可以通過將本發明的啟動子或核酸構建體或重組載體轉化至宿主細胞而得到。
適於構建本發明所述重組細胞的宿主細胞包括但不限於，例如根癌農桿菌細胞LBA4404、EHA105、GV3101 等。
在本發明的一個實施方案中，所述重組細胞為重組大腸桿菌細胞DH5 α -Ρ516或重組根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105-P516。根癌農桿菌 EHA105Agrobacterium tumefaciens EHA105已經於2009年12月24日保藏於中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC NO M 209315，保藏單位地址為中國.武漢.武漢大學，郵編430072 ;農桿菌EHA105的保藏記載在公開號為CN 101864418A的中國專利申請(申請號為200910249575. 6，
公開日為2010年10月20日)中。[0043]本發明的又一方面還涉及一種含有本發明的啟動子或本發明的核酸構建體或本發明的載體或本發明的重組細胞的植物愈傷組織或植物外植體或植物。具體地，所述植物為被子植物，更具體地為單子葉植物或雙子葉植物。在本發明的一個實施方案中，所述單子葉植物為水稻。所述水稻包括但不限於，例如中花9、中花10、中花11、臺北309、丹江8號、雲稻2號、汕優63、汕優608、豐優22，黔優88、II優416、II優107、II優128、II優718、準兩優527、川農I號、雜0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101 (上述水稻品種均可購自安徽徽商農家福有限公司)等。在本發明的又一實施方案中，所述水稻為日本晴。所述雙子葉植物為菸草，具體為菸草K326、K346、K394、NC82、NC89、G140、G28、G80、中煙 90、Cokerl76、或 CV87。其中，菸草 NC89 種子已經於2010年11月12日保藏於中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC NO P201017，保藏單位地址為中國.武漢.武漢大學，郵編430072。
本發明的又一發明，涉及用於擴增本發明的啟動子的引物對，其具有Seq ID NO 2和Seq ID NO :3所示的核苷酸序列；具體地，所述引物對為在Seq ID NO :2和Seq ID NO: 3所示核苷酸序列的5』端分別連接有限制性酶切位點和/或保護鹼基；更具體地，所述引物對具有Seq ID No 4和Seq ID No 5所示的核苷酸序列。
TCTCTTGGTACTTCAGTTCG(SEQ ID NO :2)。
AGGATTCTACTACTATGCTTC(SEQ ID NO :3)。
CCGgaattcTCTCTTGGTACTTCAGTTCG(SEQ ID NO :4)，其中小寫字母代表 EcoRI 酶切位點。
GCctgcagAGGATTCTACTACTATGCTTC(SEQ ID NO :5)，其中小寫字母代表PstI 酶切位點。
本發明的又一發明，涉及一種製備本發明的啟動子的方法，包括下述步驟
I)根據SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，設計PCR擴增引物對；具體地，PCR擴增引物對為 SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO :3，或者為 SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 5 ；
2)以水稻日本晴基因組DNA為模板，使用步驟I)中所設計的PCR擴增引物對進行PCR擴增。
本領域技術人員周知，可以根據待擴增的目的核苷酸序列按照鹼基互補原則設計相應的PCR擴增引物對。在本發明的一個實施方案中，所述PCR擴增引物對如SEQ ID NO:
2和 SEQ ID NO 3 所示。
本發明的又一方面，還涉及一種調控植物中基因表達的方法，所述方法包括將本發明的啟動子或本發明的核酸構建體或本發明的載體或本發明的重組細胞導入植物的步驟，具體地，導入植物愈傷組織；具體地，包括使用本發明的啟動子轉化植物愈傷組織的步驟。在本發明的一個實施方案中，所述植物愈傷組織的轉化利用了含有本發明的啟動子的重組細胞。在本發明的一個實施方案中，所述植物愈傷組織的轉化過程中利用了前述的重組農桿菌EHA105-P516。具體地，所述植物為被子植物，更具體地，為單子葉植物或雙子葉植物。在本發明的一個具體實施方案中，所述單子葉植物為水稻，具體地，所述水稻為日本晴。在本發明的一個具體實施方案中，所述雙子葉植物為菸草，例如菸草NC89。
在本發明中，可採用植物基因轉化技術將目的基因插入到植物基因組中，包括農桿菌介導轉化、病毒介導的轉化、顯微注射、粒子轟擊、基因槍轉化和電穿孔等。本領域周知，農桿菌介導的基因轉化常被用於單子葉植物或雙子葉植物的基因轉化，但其它轉化技術也可用於本發明的啟動子的轉化。當然，適於本發明的轉化單子葉或雙子葉植物的另一種方法是粒子轟擊(顯微金或鎢粒子包覆轉化的DNA)胚性愈傷組織或胚胎開發。另外，還可以採用的轉化單子葉或雙子葉植物的方法是原生質體轉化。基因轉化後，採用通用的方法來篩選和再生整合有表達單元的植株。
本發明中，可利用本發明的啟動子調控目的基因表達的所述單子葉植物包括但不限於,例如水稻、小麥、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麥等。
菸草是典型的基因工程模 式植物。故本發明選擇菸草進行轉基因研究，以研究本發明的啟動子在雙子葉植物中的效果。實驗結果表明，該啟動子能在轉基因菸草中起作用。本發明中，可利用本發明的啟動子調控目的基因表達的所述雙子葉植物包括但不限於，例如菸草、大豆，馬鈴薯、蠶豆、蘿蔔、花生等。
本發明的又一方面還涉及本發明的啟動子或本發明的核酸構建體或本發明的載體或本發明的重組細胞或本發明的植物愈傷組織或植物外植體或植物在調控植物中目的基因表達中的用途。在本發明的一個實施方案中，利用本發明所述啟動子調控的目的基因是GUS。在本發明的一個實施方案中，所述單子葉植物為水稻，具體地，所述水稻為日本晴。在本發明的一個實施方案中，所述雙子葉植物為菸草，例如菸草NC89。
為實現上述調控目的基因表達的目的，本發明所述啟動子可以以單拷貝和/或多拷貝的形式應用，也可以與現有技術中已知的啟動子聯用。
一種製備轉基因植物的方法，包括在有效產生植物的條件下培養本發明的重組細胞或本發明的植物愈傷組織或植物外植體或植物的步驟。
本發明的又一方面還涉及本發明的啟動子或本發明的核酸構建體或本發明的載體或本發明的重組細胞或本發明的植物愈傷組織或植物外植體或植物在植物育種中的用途；具體地，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；更具體地，所述單子葉植物為稻屬植物或水稻，所述雙子葉植物為菸草屬植物；進一步具體地，所述水稻為日本晴、中花9、中花
10、中花11、臺北309、丹江8號、雲稻2號、汕優63、汕優608、豐優22，黔優88、II優416、II優107、II優128、II優718、準兩優527、川農I號、雜0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207、或津原101，所述菸草屬植物為菸草K326、K346、K394、NC82、NC89、G140、G28、G80、中煙 90、Cokerl76、或 CV87。在本發明的一個實施方案中，所述水稻為日本晴。在本發明的一個實施方案中，所述菸草為菸草NC89。
本發明的啟動子可成為一種新的啟動子作為單子葉植物(尤其是水稻)或雙子葉植物(尤其是菸草)轉基因的工具啟動子，為開展低表達基因轉化苗篩選、植物花器官敗育等分子育種研究提供便利，從而極大的縮短優良品種的選育時間。本發明的啟動子可廣泛用於培育水稻、小麥、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麥等單子葉植物以及菸草、大豆、馬鈴薯、蠶豆、蘿蔔、花生等雙子葉植物。
在本發明中，術語「單子葉植物」，具體地，可以為禾本科植物，更具體地，可以為稻屬植物例如水稻，包括但不限於，例如日本晴、中花9、中花10、中花11、臺北309、丹江8號、雲稻2號、汕優63、汕優608、豐優22，黔優88、II優416、II優107、II優128、II優718、準兩優527、川農I號、雜0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101。
在本發明中，術語「雙子葉植物」，具體地，可以為茄科植物，更具體地，可以為菸草屬植物例如菸草，包括但不限於菸草K326、K346、K394、NC82、NC89、G140、G28、G80、中煙90、Cokerl76、*CV87。
發明的有益效果
本發明提供了一種新的啟動子。所述啟動子不僅能夠調控單子葉植物(例如水稻)中目的基因的表達，而且能夠調控雙子葉植物(例如菸草)中目的基因的表達。具體地，所述啟動子能夠在水稻和基因工程模式植物-菸草中均能夠調控GUS基因的表達。


圖I :用於構建p8質粒的pCAMBIA-1301質粒示意圖。
圖2:p8質粒示意圖。
圖3 p8質粒示意圖中多克隆位點和⑶S序列部分的示意圖。
圖4 :經轉化的水稻愈傷組織的GUS染色結果。其中，由帶有本發明所述啟動子P516序列的重組根癌農桿菌P8+P516轉化的水稻愈傷組織(右)經⑶S染色後呈現藍色；不帶有本發明啟動子序列的重組根癌農桿菌P8質粒的水稻愈傷組織(對照，左)經⑶S染色後顏色未發生變化。
圖5:經過轉化的轉基因水稻苗的根的GUS染色結果。其中，由帶有本發明所述啟動子P516序列的重組根癌農桿菌P8+P516轉化的水稻苗的根(右)經⑶S染色後，呈現藍色；不帶有本發明啟動子序列的重組根癌農桿菌P8轉化的水稻苗的根(對照，左)經⑶S染色後根的顏色未發生變化。
圖6:經過轉化的轉基因水稻苗的葉的GUS染色結果。其中，由帶有本發明所述啟動子P516序列的重組根癌農桿菌P8+P516轉化的水稻苗的葉(右)經⑶S染色後，呈現藍色；不帶有本發明啟動子序列的重組根癌農桿菌P8轉化的水稻苗的葉(對照，左)經GUS染色後葉的顏色未發生變化。
圖7:經過轉化的轉基因菸草苗的葉的GUS染色結果。其中，由帶有本發明所述啟動子P516序列的重組根癌農桿菌p8+P516轉化的菸草苗的葉(右)經⑶S染色後，呈現藍色；不帶有本發明啟動子序列的重組根癌農桿菌P8轉化的菸草苗的葉(對照，左)經GUS染色後葉的顏色未發生變化。
圖8:經過轉化的轉基因菸草苗的根的GUS染色結果。其中，由帶有本發明所述啟動子P516序列的重組根癌農桿菌p8+P516轉化的菸草苗的根(右)經⑶S染色後，呈現藍色；不帶有本發明啟動子序列的重組根癌農桿菌P8轉化的菸草苗的根(對照，左)經GUS染色後葉的顏色未發生變化。
本發明涉及保藏的生物材料菸草NC89種子，2010年11月12日保藏於中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC NO :P201017，保藏單位地址為中國.武漢.武漢大學，郵編430072。
具體實施方式
下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用於說明本發明，而不應視為限定本發明的範圍。實施例中未註明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
實施例中涉及的N6D培養基、YM液體培養基、YM固體培養基、AAM培養基、N6-AS共培養基、MS-R分化培養基、1/2MS生根培養基，其具體配方可以參考《分子克隆實驗指南》或者參考公開號為CN101864418A的中國專利申請(申請號為200910249575. 6，
公開日為2010 年 10 月 20 日)。
實施例I :P516啟動子片段的PCR擴增和dMD18_T+P516重鉬載體的構律
I) PCR 擴增
使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑盒，目錄號DP320-02)提取水稻日本晴的基因組DNA，根據該啟動子在水稻日本晴gDNA中的序列，分別在首尾設計一對PCR特異性擴增引物(上遊引物F1，加限制性酶切位點EcoRI和保護鹼基，下遊引物R1，加限制性酶切位點PstI和保護鹼基)。以上述提取的水稻日本晴的gDNA為模板，使用高保真ExTaq (TaKaRa，DRR100B)聚
合酶進行PCR擴增。擴增啟動子的PCR體系如下
組成體積(μ I)
基因組DNAO. 2
dNTPs (2. 5mM)2
IOXEx Buffer (含續離子) 2.5
引物Fl (50 μ M)I
引物Rl (50 μ Μ)I
Ex taqO. 2
ddH20補滿至總體積25 μ I
PCR擴增程序為94°C預變性5min，然後以94°C變性45s，55°C退火50s，72°C延伸90s，進行35個反應循環，最後72°C延伸7min。
其中，上遊引物Fl:CCGgaattcTCTCTTGGTACTTCAGTTCG(SEQ ID NO :4)，其中小寫字母代表EcoRI酶切位點。
下遊引物Rl :GCctgcagAGGATTCTACTACTATGCTTC(SEQ ID NO :5)，其中小寫字母代表PstI酶切位點。
PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，使用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(目錄號DP209-03)進行純化回收。
2)pMD18_T+P516重組載體的構建
將如上述得到的PCR擴增產物進行T/A克隆(pMD18-T質粒，TaKaRa，D103A)，轉化大腸桿菌，挑取陽性克隆測序，測序結果證明得到的序列準確。
其中，T/A克隆的連接條件如下
T/A 連接體系10 μ I[0098]pMD18-TI μ I
2*solution I5 μ I
PCR擴增產物(回收插入片段)10_20ng，根據其濃度定
ddH20補齊至 10 μ I
於16 °C在節能型智能恆溫槽(寧波新芝，SDC-6)中連接8h以上，得到PMD18-T+P516重組載體。將經過上述連接後的產物按照如下方法轉化大腸桿菌
從超低溫冰箱中取出按照《分子克隆實驗指南》(第三版，科學出版社)所示氯化鈣法製備的感受態細胞100μ I DH5a (中國科學院昆明動物研究所董楊提供；或者可從例如上海生工購得)，冰上融化後，加入10 μ I如上所得的連接產物，即pMD18-T+P516重組載體，輕輕攪勻，冰浴30min，42°C熱激60s，冰浴5min，加入600 μ I 4°C預冷的SOC培養 基(具體配方詳見《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)，37°C 220rpm復甦45min,8000rpm離心30s,去上清，留取150 μ I,用剩下的150 μ I上清重懸沉澱後的混合物,輕輕吹勻，玻璃珠塗布LB (卡那黴素)平板(具體配方詳見《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)，37°C倒置培養16h 24h。獲得含有pMD18-T+P516克隆載體的重組大腸桿菌，命名為DH5 a -P516。深圳華大基因科技股份有限公司對pMD18_T+P516克隆載體中的P516進行測序，證明獲得的PMD18-T+P516克隆載體中P516啟動子序列正確。
實施例2 p8+P516重糹目載體的構律
按照TIANGEN普通質粒小提試劑盒(目錄號DP103_03)的操作手冊，從實施例I構建的轉化有啟動子P516的大腸桿菌DH5a -P516中提取帶有本發明P516啟動子序列的克隆載體PMD18-T+P516 ;純化後用相應的限制性內切酶EcoRI (NEB)和PstI (NEB)進行酶切，回收相應的啟動子插入片段，並分別與P8質粒用相同的限制性內切酶酶切後回收的載體大片段進行連接。
將所得連接產物p8+P516重組載體轉化按照《分子克隆實驗指南》(第三版，科學出版社)所示氯化鈣法製備的感受態細胞DH5a，37°C倒置培養16-24h，待轉化子長出菌落後，挑取單克隆進行PCR檢測和酶切鑑定。
具體操作如下
1)ρ8質粒構建
本發明中所使用的p8質粒是由pCAMBIA-1301質粒(中國科學院昆明動物研究所董楊提供；或者可從例如上海國瑞基因科技有限公司購得，該公司的pCAMBIA-1301質粒的原始來源是The CAMBIABios (biological open source) Licensee, Australia)按照如下方式改造並構建的，具體說明如下
用Kpn I/Nco I (NEB)雙酶切質粒pCAMBIA-1301 (參見圖I)，回收大片段。根據所採用的限制性內切酶位點合成如下序列GGTACCAAGCTTACTAGTCCTGCAGGTCTAGAGGATCCGTCGACCATGG(SEQ ID NO :6)(包含的酶切位點是 Kpn I/Hind ΙΙΙ/Spe I/Sbf I/Pst I/XbaI/BamH I/Sal I/Nco I)，用Kpn I/Nco I雙酶切後回收，與上述所回收的大片段連接後轉化toplO細胞(中國科學院昆明動物研究所董楊提供；或者可從例如北京索萊寶科技有限公司購得)。用引物 GCTTCCGGCTCGTATGTTGT(SEQ ID NO 7)和 GAGTCGTCGGTTCTGTAAC(SEQIDNO 8)篩選轉化子，通過PCR檢測方法，帶有擴增片段為350bp的轉化子即為含有需要構建的多克隆位點及GUS序列的p8質粒的轉化子(參見圖2)。[0111]所述p8質粒中的多克隆位點和⑶S序列的長度2353鹼基，如SEQID NO :9所示(參見圖3)
權利要求
1.一種啟動子，其核苷酸序列為SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列或者為與SEQ ID NO:I互補的核苷酸序列。
2.—種核酸構建體，包含權利要求
I所述的啟動子，和與啟動子可操作地連接的基因序列，其中所述啟動子與所述基因序列來源相同或者不同。
3.一種載體，其特徵在於，所述載體含有權利要求
I所述的啟動子或權利要求
2所述的核酸構建體。
4.根據權利要求
3所述的載體，其為權利要求
I所述的啟動子或權利要求
2所述的核酸構建體與PMD18-T或p8質粒經重組得到的重組載體。
5.一種重組細胞，其特徵在於，所述細胞含有權利要求
I所述的啟動子或者權利要求
2所述的核酸構建體或者權利要求
3或4所述的載體，並且所述重組細胞為重組大腸桿菌細胞或重組農桿菌細胞。
6.一組引物對，所述引物對用於擴增得到權利要求
I所述的啟動子，其特徵在於所述引物對的兩條引物的核苷酸序列分別為SEQ IDNO 2所示的序列或在其5』端連接有限制性酶切位點和/或保護鹼基，和SEQ ID NO 3所示的序列或在其5』端連接有限制性酶切位點和/或保護鹼基。
7.權利要求
6的引物對，其特徵在於，所述引物對的兩條引物分別如SEQID N0:4和SEQ ID NO 5 所示。
8.製備SEQID NO 1所示的啟動子的方法，包括下述步驟 以水稻日本晴基因組DNA為模板，使用一對擴增引物進行擴增，所述擴增引物根據SEQID NO :1在水稻日本晴基因組DNA中的序列分別針對首尾進行設計。
9.根據權利要求
8所述的方法，其中，所述引物對為權利要求
6或7所示的引物對。
10.一種調控植物中基因表達的方法，所述方法包括，將權利要求
I所述的啟動子或者權利要求
2的核酸構建體或者權利要求
3或4的載體或者權利要求
5的重組農桿菌細胞導入植物的步驟。
11.根據權利要求
10所述的方法，其中，所述導入植物為導入植物愈傷組織。
12.根據權利要求
10或11所述的方法，其中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
13.根據權利要求
10或11所述的方法，其中，所述植物為稻屬或菸草屬。
14.根據權利要求
10或11所述的方法，其中，所述植物為水稻或菸草。
15.根據權利要求
10或11所述的方法，其中，所述植物為水稻日本晴或菸草NC89。
16.一種製備轉基因植物的方法，包括在有效產生植物的條件下培養植物愈傷組織或植物外植體或植物的步驟，其中，所述植物愈傷組織或植物外植體或植物含有權利要求
I的啟動子或權利要求
2的核酸構建體或權利要求
3或4的載體或權利要求
5的重組農桿菌細胞。
17.根據權利要求
16所述的方法，其中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
18.根據權利要求
16所述的方法，其中，所述植物為稻屬或菸草屬。
19.根據權利要求
16所述的方法，其中，所述植物為水稻或菸草。
20.根據權利要求
16所述的方法，其中，所述植物為水稻日本晴或菸草NC89。
21.權利要求
I所述的啟動子、或者權利要求
2的核酸構建體、或者權利要求
3或4的載體、或者權利要求
5的重組農桿菌細胞、或者植物愈傷組織或植物外植體或植物在調控植物中目的基因表達或植物育種中的用途，其中，所述植物愈傷組織或植物外植體或植物含有權利要求
I的啟動子或者權利要求
2的核酸構建體或者權利要求
3或4的載體或者權利要求
5的重組農桿菌細胞。
22.根據權利要求
21所述的用途，其中，所述植物是單子葉植物或雙子葉植物。
23.根據權利要求
21所述的用途，其中，所述植物為稻屬或菸草屬。
24.根據權利要求
21所述的用途，其中，所述植物為水稻或菸草。
25.根據權利要求
21所述的用途，其中，所述植物為水稻日本晴或菸草NC89。
專利摘要
本發明屬於分子生物學領域，涉及一種啟動子BgIosP516、其製備方法及用途。具體而言，本發明所述啟動子具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，或其具有啟動子功能的選自如下的變體1)在高等嚴緊條件下與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，2)對SEQ ID NO1所示的核苷酸序列進行一個或多個鹼基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列，和3)與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列。本發明還涉及所述啟動子的製備方法以及所述啟動子在調控單子葉植物或雙子葉中目的基因表達和水稻或菸草育種中的用途。
文檔編號C12N5/10GKCN102146392 B發布類型授權 專利申請號CN 201010614976
公開日2012年8月22日 申請日期2010年12月30日
發明者張豐豐, 張耕耘, 束禮平, 蔡雪梅 申請人:深圳華大基因科技有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan