基於共有表位甲型流感病毒抗體通用型競爭性elisa檢測方法
2023-06-04 14:11:31 1
基於共有表位甲型流感病毒抗體通用型競爭性elisa檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種基於共有表位甲型流感病毒抗體通用型競爭性ELISA檢測方法，採用包含甲型流感病毒特異性表位序列的多肽作為包被抗原，採用特異性型單克隆抗體作為檢測抗體，以提高檢測特異性；應用競爭性ELISA方法，酶標二抗統一採用辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgGFc片段的多克隆抗體，能檢測除鼠以外的所有動物，包括野生哺乳動物和野生鳥類等及人血清樣品中的甲型流感病毒抗體，排除宿主動物種類的限制；包被抗原和單克隆抗體均基於甲型流感病毒共有表位，檢測甲型流感病毒共有的型特異性抗體，不受感染病毒亞型限制。本發明適用於檢測動物及人血清、血漿及相關液體樣本中甲型流感病毒抗體。
【專利說明】基於共有表位甲型流感病毒抗體通用型競爭性ELISA檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於甲型流感病毒檢測【技術領域】，尤其涉及一種基於共有表位甲型流感病毒抗體通用型競爭性ELISA檢測方法。
【背景技術】
[0002]抗體檢測是監測傳染病病原感染狀況，分析疫病三間(時間、空間、種群間)分布和評估疫苗免疫效果的重要技術手段，甲型流感病毒具有亞型眾多、自然感染宿主動物範圍廣的特點，現有流感病毒抗體檢測方法有兩種:血凝抑制試驗和ELISA，血凝抑制試驗具有亞型特異性，檢測結果和檢測方法受所感染的不同亞型流感病毒得限制或幹擾，且除雞血清以外，其餘動物及人血清樣品必須經預處理去除非特異性抑制素後，方能進行檢測，操作繁瑣，有效抗體丟失較多，降低了檢測敏感性，ELISA若採用針對宿主IgG的抗體作為二抗，則檢測對象僅限於該種宿主動物血清樣品，例如採用抗人IgG的抗體作為二抗，僅能檢測人血清樣品，而不能檢測蝙蝠、野生鳥類等動物血清中的流感病毒抗體，若二抗採用兔抗鼠IgG，則必須要採用特性強、覆蓋範圍廣的單克隆抗體，目前尚無有效的檢測方法和試劑盒。
[0003]現有技術方案:
[0004]1.1血凝抑制試驗
[0005]來源於中華人民共和國衛生行業標準《流行性感冒診斷標準》(WS285-2008)、中華人民共和國國家標準《流行性感冒診斷標準及處理原則》(GB15994-1995)；
[0006]1.1.1 原理
[0007]一些動物紅細胞(如雞、豚鼠等)以及人「O」型血紅細胞上有流感病毒受體，遇流感病毒可產生紅細胞凝集現象，簡稱血凝，若將特異性抗體與流感病毒(血凝素)預先作用後再加入紅細胞則不產生凝集，稱為血凝抑制現象，用定量血凝素與不同稀釋度血清抗體作用後，能完全抑制血凝的最高稀釋度，即為血凝抑制抗體效價；
[0008]1.1.2主要材料
[0009]90孔微量血凝試驗板，微量移液器；
[0010]1.1.3雙份血清收集及處理
[0011]急性期血清於發病3d內採取，恢復期血清於發病後2?4周採取，取0.1mL已分離的血清加入0.9 (或0.4) mL霍亂濾液(RDE)(即1: 10或1: 5稀釋)搖勻，於37°C水浴中過夜，以去除血清中的非特異性抑制素，次日置56°C水浴50min以滅活多餘的RDE ；
[0012]1.1.4流感病毒血凝素製備
[0013]流感病毒接種雞胚後48h收穫的尿囊液，加入1/10000硫柳汞防腐，為了延遲尿鹽沉澱可先用無菌生理鹽水做等量稀釋，置4°C備用；
[0014]1.1.5雞紅細胞懸液的製備
[0015]從靜脈或心臟抽取正常健康雞血，保存於阿氏(Alsevr』 s)液中，置4°C保存，用前以生理鹽水洗3次，末次經2000r/min離心lOmin，將紅細胞用生理鹽水配成1%濃度；[0016]1.1.6血凝素滴定
[0017]將流感病毒血凝素在90孔微量血凝試驗板內用生理鹽水從1: 5開始做系列倍比稀釋，每孔50 μ L再加入等量1%雞紅細胞懸液，搖勻，置室溫孵育30min?45min後觀察結果，以出現「++」血凝的血凝素最高稀釋度為其血凝效價，即為I個血凝單位，實驗時採用4個紅細胞凝集單位(指25 μ L體積中含有4個紅細胞凝集單位)，按所需病毒工作液總量換算配製，試驗前須覆核滴定確保準確無誤；
[0018]1.1.7血凝抑制試驗步驟
[0019]1.1.7.1將上述已處理的待檢血清(I: 10或1: 5)再用生理鹽水做系列倍比稀釋，每孔加50 μ L ;
[0020]1.1.7.2加入等量已配好的4個單位血凝素；
[0021]1.1.7.3每孔加入50 μ Ll%雞紅細胞懸液，搖勻置室溫孵育30min?45min ；
[0022]1.1.8結果觀察
[0023]觀察結果時將血凝板傾斜數十秒鐘，待陰性孔內紅細胞自由下滑呈淚滴狀時讀結果，以出現完全抑制的血清最高稀釋度的倒數為抗體的效價，在檢測患者雙份血清時需在同一次試驗中進行，並以恢復期血清抗體效價較急性期抗體效價升高4倍或4倍以上為陽性，具有亞型特異性，檢測結果和檢測方法受不同流感病毒亞型感染的限制或幹擾，且除雞血清以外，其它動物血清樣品必須經預處理去除非特異性紅細胞凝集因子後方能進行檢測，操作繁瑣，有效抗體丟失較多，降低了檢測敏感性；
[0024]1.2人甲型流感病毒抗體間接ELISA檢測方法
[0025]1.2.1 原理
[0026]利用酶標記的二抗以檢測已與固相結合的受檢抗體，首先將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原，受檢抗體與固相抗原結合，形成抗原抗體複合物，酶標二抗與固相複合物中受檢抗體的FC片段結合，從而使該抗體間接地標記上酶，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量，加底物顯色後根據顏色深度(0D值)進行抗體定性檢測，用於檢測人血清、血漿及相關液體樣本中甲型流感病毒抗體；
[0027]1.2.2操作步驟
[0028]1.2.2.1包被抗原:將純化的流感病毒抗原稀釋後包被於90孔酶標板後，用1%明膠或1-2%脫脂奶溶封閉；
[0029]1.2.2.2加標準品和待測樣本:在包被好的酶標板上，分別設置標準品孔、待測樣本孔和空白對照孔，記錄各孔位置，在標準品孔中加入標準品50μ L ;待測樣本孔中先加入待測樣本10 μ L，再加樣本稀釋液40 μ L (即樣本稀釋5倍)；空白對照孔不加；
[0030]1.2.2.3溫育:37°C水浴鍋或恆溫箱溫育30min ；
[0031]1.2.2.4洗板:棄去液體，吸水紙上拍幹，每孔加滿洗滌液，靜置lmin，甩去洗滌液，吸水紙上拍幹，如此重複洗板4次(也可用洗板機按說明書操作洗板)；
[0032]1.2.2.5加酶標二抗(抗人IgGFC片段的多克隆抗體):每孔加入酶標二抗工作液50 μ L，空白對照孔不加；
[0033]1.2.2.6溫育:37°C水浴鍋或恆溫箱溫育30min ；
[0034]1.2.2.7 洗板:同 1.2.2.4 ;
[0035]1.2.2.8顯色:每孔先加入100 μ L底物，平板混勻器混勻30s (或用手輕輕震蕩混勻30s)，37°C避光顯色15min ；
[0036]1.2.2.9終止:取出酶標板，每孔加終止液50 μ L，終止反應(顏色由藍色立轉黃色)；
[0037]1.2.2.10測定:以空白孔調零，在終止後15分鐘內，用450nm波長測量各孔的吸光值(0D值)；
[0038]1.2.2.11根據標準品的濃度及對應的OD值，計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據樣本的OD值，在回歸方程上計算出對應的樣品濃度，也可以使用各種應用軟體來計算，最終濃度為實際測定濃度乘以稀釋倍數。
[0039]同步檢測不同亞型流感病毒感染不同宿主動物產生的特異性抗體，是分析流感病毒感染狀況和疫病三間分布態勢的重要實驗依據。要求所採用的抗體檢測技術不僅要具有高敏感性和高特異性，而且還應具有通用性一一能檢測來源不同宿主動物、不同亞型流感病毒感染產生的特異性抗體。血凝抑制試驗具有亞型特異性，檢測結果和檢測方法受不同流感病毒亞型感染的限制或幹擾，且除雞血清以外，其它動物血清樣品必須經預處理去除非特異性抑制素後方能進行檢測，操作繁瑣，有效抗體丟失較多，降低了檢測敏感性。ELISA若採用針對宿主IgG的抗體作為二抗，則檢測對象僅限於該種宿主動物血清樣品，例如採用抗人IgG的抗體作為二抗，僅能檢測人血清樣品，而不能檢測蝙蝠、野生鳥類等動物血清中的流感病毒抗體。若二抗採用兔抗鼠IgG，則必須要採用特性強、覆蓋範圍廣的單克隆抗體，目前尚無有效的檢測方法和試劑盒。
[0040]現有甲型流感病毒抗體檢測方法特異性不強、受宿主動物種類限制、受不同病毒亞型的限制。
【發明內容】
[0041]本發明實施例的目的在於提供一種基於共有表位甲型流感病毒抗體通用型競爭性ELISA檢測方法，旨在解決現有甲型流感病毒抗體檢測方法特異性不強、受宿主動物種類限制、受不同病毒亞型限制的問題。
[0042]本發明實施例是這樣實現的，一種基於共有表位甲型流感病毒抗體通用型競爭性ELISA檢測方法，該基於共有表位甲型流感病毒抗體通用型競爭性ELISA檢測方法包括以下步驟:
[0043]步驟一，採用分別含有甲型流感病毒核蛋白上的2個型特異性表位和甲型流感病毒基質蛋白上的I個型特異性表位序列的多肽，使用前預混合，作為包被抗原；
[0044]步驟二，將包被抗原用0.05mol / L碳酸鹽緩衝液稀釋到工作濃度，加至96孔ELISA板，每孔加50 μ L，振蕩混勻，4°C保溼過夜，用PBST洗板5次，鋁箔紙密封4°C保存；
[0045]步驟三，採用2株針對甲型流感病毒核蛋白的型特異性單克隆抗體和I株針對甲型流感病毒基質蛋白的型特異性單克隆抗體，使用前預混合，作為檢測抗體；
[0046]步驟四，加樣，將待檢血清用PBST-SM作1:5稀釋，每孔加50 μ L，每份樣品使用兩孔，空白對照兩孔，各加PBST-SM50 μ L ;強陽性血清對照兩孔，各孔加50 μ L ;弱陽性血清對照兩孔，各加入50 μ L ;陰性血清對照兩孔，各加入50 μ L ;置37°C溫箱振蕩溫育反應30min ；
[0047]步驟五，將檢測抗體用PBST-SM稀釋到工作濃度，每孔加50 μ L ;置37°C溫箱振蕩溫育反應30min ;用PBST洗板5次，甩幹；加酶標二抗，將HRP標記的兔抗鼠IgGFC片段的多克隆抗體用PBST-SM稀釋到工作濃度，每孔加50 μ L ;置37°C溫箱振蕩溫育反應30min ；洗板，用PBST洗板5次，甩幹；
[0048]步驟六，加底物和終止，按以下比例配置底物工作液:9.7mL乙酸一檸檬酸緩衝液+50 μ L30%過氧化氫+300 μ L四甲基聯苯胺儲存液，每孔100 μ L加至ELISA板，室溫避光反應IOmin?20min,用2mol / L的硫酸每孔50 μ L,終止反應；
[0049]步驟七,讀數和判定,讀數:在終止反應15min內，用酶標讀板儀讀取450nm波長的每孔吸光度值，計算抑制率；判定條件:陰性對照OD值應在0.8?1.4範圍內，強陽性對照抑制率應大於85%，弱陽性抑制率應在35%?50%之間，如果實際值與此值偏離較大，則不具備判定條件，需重複或重新滴定各組份工作濃度。
[0050]進一步，在步驟七中，抑制率的計算公式為(1-待檢樣品OD值/陰性樣品OD值)XlOOo
[0051]進一步，樣品的抑制率大於60%判定為甲型流感病毒抗體陽性，小於40%判定為陰性；40%?60%之間應重複，若仍為此值可判定為弱陽性。
[0052]本發明提供的基於共有表位甲型流感病毒抗體通用型競爭性ELISA檢測方法，採用包含甲型流感病毒特異性表位序列的多肽作為包被抗原，採用特異性型單克隆抗體作為檢測抗體，以提高檢測特異性；應用競爭性ELISA方法，酶標二抗統一採用辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgGFc片段的多克隆抗體，能檢測除鼠以外的所有動物，包括野生哺乳動物和野生鳥類等及人血清樣品中的甲型流感病毒抗體，排除宿主動物種類的限制；包被抗原和單克隆抗體均基於甲型流感病毒共有表位，檢測甲型流感病毒共有的型特異性抗體，不受感染病毒亞型限制。
[0053]本發明受檢抗體與檢測抗體(單克隆抗體)針對同一抗原表位，通過分析受檢抗體和檢測抗體與表位的結合是否存在競爭、競爭的強弱，判定是否存在特異性抗體，並對抗體滴度高低作定性分析。首先將包含甲型流感病毒型特異性共有表(擬)位序列的多肽與固相載體連接，形成固相抗原。加待檢樣品，樣品中的受檢抗體和固相抗原結合。加檢測抗體，檢測抗體與未結合受檢抗體的固相抗原結合。酶標二抗與檢測抗體的FC片段結合，從而使檢測抗體間接地標記上酶。固相載體上的酶量就代表檢測抗體的量(檢測抗體結合量越大，受檢抗體含量越低，反之，檢測抗體結合量越小，受檢抗體含量越高)。加底物顯色後根據顏色深度(吸光度或光密度值，OD值)計算抑制率，進行抗體定性檢測。適用於檢測動物及人血清、血漿及相關液體樣本中甲型流感病毒抗體。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0054]圖1是本發明實施例提供的基於共有表位甲型流感病毒抗體通用型競爭性ELISA檢測方法流程圖。
【具體實施方式】
[0055]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。[0056]下面結合附圖及具體實施例對本發明的應用原理作進一步描述。
[0057]如圖1所示，本發明實施例的基於共有表位甲型流感病毒抗體通用型競爭性ELISA檢測方法包括以下步驟:
[0058]SlOl:採用分別含有甲型流感病毒核蛋白上的2個型特異性表位和甲型流感病毒基質蛋白上的I個型特異性表位序列的多肽，使用前預混合，作為包被抗原；
[0059]S102:將包被抗原用0.05mol / L碳酸鹽緩衝液稀釋到工作濃度，加至96孔ELISA板，每孔加50 μ L，振蕩混勻，4°C保溼過夜，用PBST洗板5次，鋁箔紙密封4°C保存；
[0060]S103:採用2株針對甲型流感病毒核蛋白的型特異性單克隆抗體和I株針對甲型流感病毒基質蛋白的型特異性單克隆抗體，使用前預混合，作為檢測抗體；
[0061]S104:加樣，將待檢血清用PBST-SM作1:5稀釋，每孔加50 μ L，每份樣品使用兩孔，空白對照兩孔，各加PBST-SM50y L ;強陽性血清對照兩孔，各孔加50 μ L ;弱陽性血清對照兩孔，各加入50 μ L ;陰性血清對照兩孔，各加入50 μ L ;置37 °C溫箱振蕩溫育反應30min ；
[0062]S105:將檢測抗體用PBST-SM稀釋到工作濃度，每孔加50 μ L ;置37°C溫箱振蕩溫育反應30min ;用PBST洗板5次，甩幹；加酶標二抗，將HRP標記的兔抗鼠IgGFC片段的多克隆抗體用PBST-SM稀釋到工作濃度，每孔加50 μ L ;置37°C溫箱振蕩溫育反應30min ;洗板，用PBST洗板5次，甩幹；
[0063]S106:加底物和終止，按以下比例配置底物工作液:9.7mL乙酸一檸檬酸緩衝液+50 μ L30%過氧化氫+300 μ L四甲基聯苯胺儲存液，每孔100 μ L加至ELISA板，室溫避光反應IOmin?20min,用2mol / L的硫酸每孔50 μ L,終止反應；
[0064]S107:讀數和判定，讀數:在終止反應15min內，用酶標讀板儀讀取450nm波長的每孔吸光度值，計算抑制率；判定條件:陰性對照OD值應在0.8?1.4範圍內，強陽性對照抑制率應大於85%，弱陽性抑制率應在35%?50%之間，如果實際值與此值偏離較大，則不具備判定條件，需重複或重新滴定各組份工作濃度。
[0065]在步驟S107中，抑制率的計算公式(I)，I (%)= (1-待檢樣品OD值/陰性樣品OD 值)XlOO ；
[0066]判定:樣品的抑制率大於60%判定為甲型流感病毒抗體陽性，小於40%判定為陰性；40%?60%之間應重複，若仍為此值可判定為弱陽性；
[0067]本發明具體包括以下步驟:
[0068]1.1包被抗原，採用分別含有甲型流感病毒核蛋白上的2個型特異性表位和甲型流感病毒基質蛋白上的I個型特異性表位序列的多肽，使用前預混合，作為包被抗原；
[0069]1.2檢測抗體，採用2株針對甲型流感病毒核蛋白的型特異性單克隆抗體和I株針對甲型流感病毒基質蛋白的型特異性單克隆抗體，使用前預混合，作為檢測抗體；
[0070]1.3操作步驟:試劑溶液如表I所示；
[0071]1.3.1抗原包被，將包被抗原用0.05mol / L碳酸鹽緩衝液稀釋到工作濃度，加至96孔ELISA板，每孔加50 μ L，振蕩混勻，4°C保溼過夜，用PBST洗板5次，鋁箔紙密封4°C保存；
[0072]1.3.2加樣，將待檢血清用PBST-SM作1:5稀釋，每孔加50 μ L，每份樣品使用兩孔，空白對照兩孔，各加PBST-SM50 μ L ;強陽性血清對照兩孔，各孔加50 μ L ;弱陽性血清對照兩孔,各加入50 μ L ;陰性血清對照兩孔，各加入50 μ L ;
[0073]1.3.3溫育，置37°C溫箱振蕩溫育反應30min ；
[0074]1.3.4加檢測抗體，將檢測抗體用PBST-SM稀釋到工作濃度，每孔加50 μ L ;
[0075]1.3.5溫育，置37°C溫箱振蕩溫育反應30min ；
[0076]1.3.6洗板，用PBST洗板5次，甩幹；
[0077]1.3.7加酶標二抗，將HRP標記的兔抗鼠IgGFC片段的多克隆抗體用PBST-SM稀釋到工作濃度，每孔加50μ L ;
[0078]1.3.8溫育，置37°C溫箱振蕩溫育反應30min ；
[0079]1.3.9洗板，用PBST洗板5次，甩幹；
[0080]1.3.10加底物和終止，按以下比例配置底物工作液:9.7mL乙酸一檸檬酸緩衝液+50 μ L30 %過氧化氫+300 μ L四甲基聯苯胺儲存液，每孔100 μ L加至ELISA板，室溫避光反應10min~20min,用2mol / L的硫酸每孔50 μ L,終止反應；
[0081]1.3.11讀數和判定,讀數:在終止反應15min內，用酶標讀板儀讀取450nm波長的每孔吸光度值(0D值)，計算抑制率(I)，I (%) = (1-待檢樣品OD值/陰性樣品OD值)XlOO ；
[0082]判定條件:陰性對照OD值應在0.8~1.4範圍內，強陽性對照抑制率應大於85%，弱陽性抑制率應在35%~50%之間，如果實際值與此值偏離較大，則不具備判定條件，需重複或重新滴定各組份工作濃度；
[0083]判定:樣品的抑制率大於60%判定為甲型流感病毒抗體陽性，小於40%判定為陰性；40%~60%之間應重複，若仍為此值可判定為弱陽性；
[0084]表1試劑溶液
[0085]
【權利要求】
1.一種基於共有表位甲型流感病毒抗體通用型競爭性ELISA檢測方法，其特徵在於，該基於共有表位甲型流感病毒抗體通用型競爭性ELISA檢測方法包括以下步驟: 步驟一，採用分別含有甲型流感病毒核蛋白上的2個型特異性表位和甲型流感病毒基質蛋白上的1個型特異性表位序列的多肽，使用前預混合，作為包被抗原； 步驟二，將包被抗原用0.05mol / L碳酸鹽緩衝液稀釋到工作濃度，加至96孔ELISA板，每孔加50 μ L，振蕩混勻，4°C保溼過夜，用PBST洗板5次，鋁箔紙密封4°C保存； 步驟三，採用2株針對甲型流感病毒核蛋白的型特異性單克隆抗體和I株針對甲型流感病毒基質蛋白的型特異性單克隆抗體，使用前預混合，作為檢測抗體； 步驟四，加樣，將待檢血清用PBST-SM作1:5稀釋，每孔加50 μ L，每份樣品使用兩孔，空白對照兩孔，各加PBST-SM50 μ L ;強陽性血清對照兩孔，各孔加50 μ L ;弱陽性血清對照兩孔，各加入50 μ L ;陰性血清對照兩孔，各加入50 μ L ;置37°C溫箱振蕩溫育反應30min ；步驟五，將檢測抗體用PBST-SM稀釋到工作濃度，每孔加50 μ L ;置37°C溫箱振蕩溫育反應30min ;用PBST洗板5次，甩幹；加酶標二抗，將HRP標記的兔抗鼠IgGFC片段的多克隆抗體用PBST-SM稀釋到工作濃度，每孔加50 μ L ;置37°C溫箱振蕩溫育反應30min ;洗板，用PBST洗板5次，甩幹； 步驟六，加底物和終止，按以下比例配置底物工作液:9.7mL乙酸一檸檬酸緩衝液+50 μ L30%過氧化氫+300 μ L四甲基聯苯胺儲存液，每孔100 μ L加至ELISA板，室溫避光反應10min~20min,用2mol / L的硫酸每孔50 μ L,終止反應； 步驟七，讀數和判定，讀數:在終止反應15min內，用酶標讀板儀讀取450nm波長的每孔吸光度值，計算抑制率；判定條件:陰性對照OD值應在0.8~1.4範圍內，強陽性對照抑制率應大於85 %，弱陽性抑制率應在35 %~50%之間，如果實際值與此值偏離較大，則不具備判定條件，需重複或重新滴定各組份工作濃度。
2.如權利要求1所述的基於共有表位甲型流感病毒抗體通用型競爭性ELISA檢測方法，其特徵在於，在步驟七中，抑制率的計算公式為(1-待檢樣品OD值/陰性樣品OD值)XlOOo
3.如權利要求1或2所述的基於共有表位甲型流感病毒抗體通用型競爭性ELISA檢測方法，其特徵在於，樣品的抑制率大於60%判定為甲型流感病毒抗體陽性，小於40%判定為陰性；40%~60%之間應重複，若仍為此值可判定為弱陽性。
【文檔編號】G01N33/577GK103901202SQ201410135641
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月4日 優先權日:2014年4月4日
【發明者】張富強, 張文東, 範泉水, 宋建領, 趙煥雲, 張應國, 胡挺松, 邱薇, 鄭穎 申請人:中國人民解放軍成都軍區疾病預防控制中心