初級細胞的永久化的製作方法

2023-06-04 18:54:31 3

專利名稱:初級細胞的永久化的製作方法
此申請為1986年2月28日提交的835，089號待批申請的繼續部分。
本發明是關於以致癌基團DNA/致癌基因轉染初級細胞，應用電穿孔技術將此DNA轉移到這些細胞中以生產永久化初級細胞的一種方法。
將DNA轉染到哺乳動物細胞，在基因表達和調節的研究中，作出了重要的貢獻。這一技術有助於發現新的基因，而分子探針則對其並不適用。慣常引導基因進入細胞的種種方法，可分為自然的和人工的兩個系統。
「自然的」轉染是通過完整的(或經遺傳操縱處理的)病毒感染細胞來完成的。來自病毒(DNA，RNA)的遺傳信息可被整合到宿主細胞DNA中，結果導致縮主細胞的轉化作用。
「人工的」轉染是在試管中操作處理DNA並將其導入不同起源的完整細胞，通常用化學的或手工的方法來完成。若干技術已發展到引導DNA進入體細胞中。這些技術可分為下述五種，依靠這些不同的方法將大分子轉移到受體細胞內1.微量注射法〔Graessmann等，Hoppe-seyler′s Z Physiol.Chem.，352，527-532，(1971);Capecchi，Cell，22，470-488(1980)〕。
2.載體介導的轉移一、紅細胞影〔Furusawa等，Methods in Cell Biol.，14，17-80，(1976)〕。
-脂質體〔Poste等，細胞生物學方法，(Method in Cell Biol.，14，33-71(1976);Gregoriadis等Nature，224，170-172(1973)〕
-重建的仙臺病毒被膜〔Loyter等，Exp.Cell Res.，139，223-234(1983)〕。
3.藉助促進劑轉移-磷酸鈣〔Graham等，Virology，52，456-467，(1973)〕。
-磷酸鈣/聚乙二醇-二甲亞碸(DMSO)震蕩(Shock)〔Jonak等，「Monoclonal Antibodies and Functional Cell Lines(Progress and Applications)，」Plerum Press，418-422，(1984)〕。
-DEAE-葡聚糖〔Graham，Adv.Cancer Res.，25，1-51，(1977)〕。
-聚乙二醇/蔗糖震蕩〔Chu等，Gene，13，197-202(1981)〕。
4.雷射微光束〔Tsukakoshi等，Applied Physics B.，35，2284-2289，(1984)〕。
5.電穿孔(electroporation)〔Neumann等，Embo.J.，1，841-845，(1982);Potter等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81，7161-7165，(1984)〕這些技術已用於引導DNA，RNA，蛋白質，脂質，藥物，小分子以及細胞器和病毒顆粒進入體細胞。每一種技術都有其使用限制，而且某些生物學問題只有使用特定方法才得以最好的解決。
DNA介導的基因轉移，通常是由各種改進的磷酸鈣-DNA沉澱技術完成的。此方法需有磷酸鈣-DNA-共沉澱物的形成(45分鐘)和將受體細胞與共沉澱物作較長時間保溫(2小時)。之後經細胞內吞的類似過程收集沉澱物〔Loyter等，Ciba Found.，symp.，103，163-175(1982)〕。此技術需要應用具有胞吞潛力的成纖維細胞起源的特異細胞，從而限制了它的應用。
各種類型細胞都有特異的效率並藉以使之得以被轉染。儘管有這些區別，但各種不同類型的細胞均已成功地用於轉染。這些細胞包括正常細胞如淋巴細胞，此淋巴細胞是在懸浮液中使用磷酸鈣DNA共沉澱/聚乙二醇-DMSO技術被轉染的〔Jonak等，Hybridoma，3，107-118(1984)〕。
先前的實驗〔Jonak等，Hybridoma，上已引用〕業已表明，將由人白血病細胞分離的DNA為藉助磷酸鈣DNA-共沉澱/聚乙二醇-DMSO介異導的釋放引入到受刺激過的初級小鼠淋巴細胞內可產生有能力在培養中連續增殖的細胞系。因此，用致癌基因DNA經這種釋放技術轉染正常的、刺激過的淋巴細胞，已表明是一種使小鼠淋巴細胞不會死亡並在培養中持續地保持這些細胞的新的方法學。此種新的細胞系(永久化的小鼠淋巴細胞)會以單克隆的形式生產其產物。
Potter等(引文同上)和Celis〔Biochem.J.，223，281-291，(1984)〕研究了可通過電穿孔將被克隆的人和小鼠的IgK基因引入到小鼠前-B細胞和成纖維細胞內的表達，並揭示此方法可適用於許多類型的細胞，包括那些對傳統的轉染方法難於奏效的細胞。
Van Brunt〔Biotechnology，3，187-191，(1985)〕綜述了在電場中融合細胞的新方法學，並指出在Technicleone公司工作的Lundak及其同事已從人癌細胞分離了myc基因，將其克隆，插入質粒，並用一高電壓脈衝以質粒轉染產生抗體的人淋巴球。結果得到一個至少已經穩定了8個月的細胞系。Van Brunt的文章並不能使本領域內熟練的技術人員重複Lundak的實驗，因為其中沒有披露(a)必需用多大電壓的脈衝，(b)是否這樣的細胞必須在轉染之前經激活/或刺激過，(c)在給予脈衝前，如何使細胞和質粒靠得最近，(d)要給多少脈衝，(e)各脈衝的適當的長度(脈衝時間)和振幅，(f)細胞和致癌基因DNA的適當濃度，(g)所用的「myc」基因的性質和起源，(h)使細胞在培養中得以增殖並維持其無限增殖的組織培養條件。
本發明是關於生產永久化的初級細胞系的方法，此方法包括(a)提供正常的、被激活/刺激過的初級細胞;
(b)經電穿孔用致癌基因DNA/致癌基因轉染初級細胞，從而產生轉染了的初級細胞;和(c)從這種轉染的初級細胞中回收永久化了的初級細胞系。
在上述的(b)步驟中用於轉化初級細胞的致癌基因DNA/致癌基因在通過電穿孔轉染之前，可任意選擇地包含於脂質體之中。
本發明還涉及通過該方法生產永久化的初級細胞系。
本發明也涉及生產生物製品的一種方法，製品的編碼序列是由包含在本發明的永久化初級細胞系內的DNA組成的。該方法包括在能夠生產這種生物製品的條件下培養所說的細胞系、「編碼序列」包括那些用來製備本發明之永久化初級細胞系的正常的、經激活/刺激的初級細胞的、天然地存在於DNA內的編碼序列以及包含在用於本發明方法的致癌基因DNA/致癌基因的編碼序列。
本發明也涉及生產含有一外源功能性DNA序列的共轉染的永化初級細胞系的方法，此方法包括(a)提供正常的、激活/刺激過的初級細胞;
(b)用致癌基團DNA/致癌基因和外來功能性DNA序列的經電穿孔共轉染上述的初級細胞，從而產生共轉染的初級細胞;並(c)從此種共轉染的初級細胞中回收含有外來功能性DNA序列的共轉染的永久化初級細胞系。
本發明還涉及利用這一方法生產共轉染的永久化的初級細胞系。
本發明也涉及一生產物製品的方法，其「密碼序列」是由包含於本發明的共轉染的永久化初級細胞內的DNA組成的，該方法包括在能夠生產這種生物製品的條件下培養上述的細胞系。
「密碼序列」包括由在本發明的方法中用於轉染的致癌基因DNA/致癌基因組成的，外來功能性DNA序列的編碼序列以及那些「自然存在」於為製備本發明之共轉染的永久化細胞系而用作DNA受體細胞的正常的、激發/刺激過的初級細胞內的DNA編碼序列。
此發明還涉及一永久化初級細胞系，條件是這種永久化作用是用主要含有致癌基因DNA轉染正常初級細胞系的結果。
在前述步驟(b)中，用於轉染初級細胞的致癌基因DNA和外源功能性DNA在經電穿孔轉染之前，可有選擇性地含於脂質體之中。
Jonak等〔Hybridoma，3，107-118(1984)〕曾報導將人白血病細胞DNA由磷酸鈣DNA-共沉澱/聚乙二醇-DMSO介導的釋放引入經刺激過的小鼠淋巴細胞內，可產生能夠在培養中連續增殖的細胞系。現已發現，用致癌基因DNA轉染初級細胞(如淋巴細胞等免疫細胞)以影響這類細胞的永久化，取決於用於釋放這樣的DNA進入細胞的方法學，以及受體細胞的功能狀態和用於使之永久化的致癌基因的來源。例如，磷酸鈣DNA共沉澱技術，在此種技術中B淋巴細胞均與共沉澱物一同保溫，並藉助聚乙二醇-DMSO震蕩處理(Jonak等，Hybridoma，引文同上)以促進DNA進入被用來將致癌基因DNA轉染到各種初級免疫細胞(即造血細胞來源的細胞)內，以試圖使這類細胞永久化。這種方法就其產生永久化細胞系的效率來說，只是偶然地獲得成功。此外，磷酸鈣-DNA共沉澱技術還有與受體細胞的性質有關的其它一些限制。例如，初級細胞(巨噬細胞和具有胞吞潛在能力的成纖維細胞起源的某些細胞除外)均無吞噬能力，因此攝入磷酸鈣-DNA共沉澱物並不是將DNA引入這些細胞的一個非常有效的方法。同樣，磷酸鈣-DNA共沉澱法的另一限制是此法是複雜的而且包括使初級免疫細胞與高濃度鹽溶液接觸將會直接影響這些細胞的生存能力並幹擾此方法的轉染效率。
現已發現，電穿孔能可靠地應用於有效地轉染從造血和非造血細胞起源的正常的、經激活/刺激的初級細胞，用致癌基因有效地製得永久化初級細胞系。
「初級細胞」一詞，是指為從未曾預先經過組織培養或曾預培養過但未經過無限期地組織培養的活的生物體得來的任何細胞，造血組織起源的初級細胞更為適用，特別是多潛能幹細胞，B-淋巴細胞，B-系細胞前體，T-淋巴細胞，T-系細胞前體，髓樣幹細胞，單核細胞，巨噬細胞，中性白細胞，嗜曙紅細胞、巨核細胞和肥大細胞。這樣的細胞可用常規技術分離。
「永久化的初級細胞』一詞，是指那些用本發明的方法轉染後能在培養中連續增殖的初級細胞，此類細胞如未經這樣的轉染便不能增殖。
「正常的初級細胞」是指非永久化的初級細胞，如果這種正常初級細胞是首先經過激活/刺激的，即能夠用本發明的方法使之永久化。「經激活/刺激的初級細胞」是指能夠用本發明的方法產生永久化的正常初級細胞，這種經激活/刺激過的初級細胞，可通過將這些細胞暴露於刺激/激活劑中而製得。「刺激/激活劑」是指一種能刺激正常初級細胞增殖(有限的生命期限)的藥劑，這樣的藥劑是本技術中眾所周知的。經激活/刺激的初級細胞的製備方法是本領域中人所共知的。更為可取的是，此刺激/激活劑也能刺激正常的初級細胞分化，被應用於激活/刺激正常B細胞的、適用的激活/刺激劑包括抗原、分裂素和生長因子。如果需要通過本發明的永久化初級細胞系生產一特異的單克隆抗體，則要用已知的抗原作為刺激/激活劑。例如經激活/刺激的B淋巴細胞，是一種已經受到抗原攻擊並已分化成產生抗體細胞的一種淋巴細胞，這種抗體對於攻擊抗原的一種抗原決定因素是特異的。從而，即可用本發明的方法使這樣的被激活/刺激的B淋巴細胞永久化。用於激活/刺激正常初級細胞而不是B細胞的適當的刺激/激活劑包含分裂素和生長因子。分裂素是在技術中已知的。應注意到的是，特異的分裂素可能更適合於特殊類型的正常初級細胞。例如，脂多糖(LPS)是更適用於刺激/激活正常B細胞的分裂素;伴刀豆球蛋白A是更適用於刺激/激活正常T細胞(它刺激分化和增殖)的分裂素;美國商陸分裂素是適用於刺激/激活正常B細胞或正常T細胞的分裂素(它刺激分化及增殖);胰島素和聚肉豆蔻酸(PMA)則為更適用於刺激/激活正常成纖維細胞的分裂素。
所採用的最適刺激/激活劑和刺激/激活正常初級細胞的最適條件，可由本領域內的熟練技術人員使用通常技術來確定。並將取決於所應用的初級細胞類型和特殊刺激/激活劑等其它因素。
「致癌基因DNA/致癌基因」一詞，是指當用本發明的方法轉染到正常、激活的初級細胞時，會使這些細胞永久化的任何DNA序列。此中所用的「致癌基因DNA」包括來自腫瘤細胞或腫瘤細胞系的DNA，當用本發明的方法轉染到這種初級細胞內時，會使正常，經激活/刺激的初級細胞永久化。致癌基因是分離到的已知其在正常細胞轉化為癌細胞中起作用的DNA序列。本文所說的「致癌基因」，包括當用本發明的方法轉染到這種細胞內時，能使正常、經激活/刺激的初級細胞永久化的任何分離的DNA序列。重要的是要注意到按本發明的方法使特殊的正常的激活的初級細胞永久化可能需要不止一種類型的致癌基因。可依照本發明的方法用於使正常、激活/刺激的初級細胞永久化的優選致癌基因包括來自初級細胞腫瘤或腫瘤的初級細胞系的致癌基因，其中癌或癌細胞系具有與被永久化的初級細胞相一致的起源。按照本發明的方法，更為適用於使正常、激活/刺激過的B細胞永久化的致癌基因是從T-24人膀胱癌細胞系分離到的Ha-ras致癌基因，此可從美國馬裡蘭州羅克維爾市美國典型培養物保藏中心〔American Typeculture Collection Rockville，Maryland，U.S.A.(ATCC)〕得到，其登記號為ATCC HTB4.(Haras)以及P53致癌基因(P53-H7克隆，此克隆從Varda Rotton醫生處獲得;對此克隆的詳細敘述見Molecular and Cel-lular Biology，Vol.5，NO.8，Pages 1887-1893，1985)。依照本發明的方法，更為適用於使正常的激活的/刺激的B細胞永久化的致癌基因DNA，包括得自人急性淋巴母細胞白血病細胞，即所謂REH細胞系(可從ATCC得到，其登記號為CRL8286)或EL4小鼠胸腺瘤細胞系(可從ATCC得到，其登記號為TIB39)的基因組DNA;以及來自腫瘤B細胞系或B細胞腫瘤、特別是B細胞淋巴腫瘤如美國費城兒童醫院病毒室W.Henle醫生建株的人Burkitt′s淋巴腫瘤細胞系(BJAB)的基因組DNA。更適合於按本發明的方法使正常、經激活/刺激的T細胞永久化的致癌基因DNA包括得自T細胞腫瘤或腫瘤T細胞系(如EL4)的基因組DNA。更適合於按本發明的方法使其他正常、經激活/刺激的初級細胞永久化的致癌基因DNA包括從初級細胞腫瘤或腫瘤初級細胞系得到的基因組DNA，其中這樣的腫瘤或腫瘤細胞系具有與要進行永久化的正常初級細胞類型相一致的起源。例如，上皮細胞起源的腫瘤DNA，更適合於按本發明的方法使正常、經激活/刺激過的初級上皮細胞永久化。其他適用於製備本發明的永久化細胞系的致癌基因DNA/致癌基因，可使用本發明方法由熟煉的技術人員確定，並取決於諸如致癌基因DNA/致癌基因的來源和所用的正常、經激活的初級細胞類型等許多因素。近來文獻中曾報告了許多不同的致癌基因DNA/致癌基因，某些致癌基因DNA/致癌基因可以從不同來源如ATCC得到。
「電穿孔」一詞，意為使細胞暴露於高壓電脈衝。從而使細胞膜更易於通過某些高分子量的大分子如DNA。電穿孔用能發射高壓電脈衝的任何儀器作用於含有細胞和DNA的容器。例如，有許多可在市場買到的電融合系統，如BTX電動細胞操作器(BTX Electro Cell Manipulator)，比較好的有401型(美國加州聖地牙哥BTX出品)，技術人員可將其配備電穿孔儀器使用。再者，可用Potter等的方法，(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81，7161-7165，1984)完成電穿孔。如果採用Potter的方法則最好用LKB＃2197電源(瑞曲LKB公司)作電脈衝電源。
「高電壓」一詞，是指電壓在1000伏/釐米左右到約5500伏/釐米之間。最適電壓可由本領域技術人員根據正常、被激活/刺激的初級細胞的性質，致癌基因DNA/致癌基因源的性質，細胞和/或DNA濃縮細胞密度及所用的電穿孔裝置的性質等各種不同因素來確定。
本發明涉及生產永久化初級細胞系的方法，此方法包括(a)提供正常的、經激活/刺激的初級細胞;
(b)經電穿孔，用致癌基因DNA/致癌基因轉染此初級細胞，從而產生轉染的初級細胞;並(c)從轉染的初級細胞中回收永久化了的初級細胞系。
本發明還涉及用本發明的方法生產的永久化了的初級細胞系。
通過電穿孔，應用一般方法學將致癌基因DNA/致癌基因轉染到正常的、經激活的/刺激的初級細胞內的方法如下用常規技術分離正常的初級細胞。分離細胞後按上述方法(體內刺激)激活/刺激之，或者作為正常、被激活/刺激的初級細胞從曾在體內暴露於適當的刺激/激活劑的供體(活的生物體)內分離得到。之後將這些正常、被激活/刺激的細胞懸浮於保護培養基中，細胞濃度最好為大約5×106到約2×107細胞/毫升。
「保護」培養基是指在電穿孔期間，可維持正常、被激活/刺激的初級細胞存活力的任何培養基。可應用於本發明之方法的保護培養基的例子包括緩衝液和非離子溶液，如磷酸緩衝鹽水(PBS)(pH約7)和葡萄糖(0.3摩爾)。PBS是最為適用的。如果應用PBS，優選的電壓條件為1000伏/釐米。如果用葡萄糖(0.3摩爾)則以5500伏/釐米的電壓更為合適。
正常的、經激活/刺激的初級細胞在保護培養基中混懸之後，將致癌基因DNA(以約1微克/毫升到約100微克/毫升為較合適)或致癌基因(10毫微克/毫升到約10微克/毫升)加入此懸浮液。加到懸浮液中的致癌基因可以游離DNA的形式，包括基因組DNA或一適當的重組DNA載體，或者可將DNA包裹在脂質體內，此脂質體用對正常的、激活/刺激的初級細胞表面的至少一種抗原決定簇是特異的抗體作包被的。「適當的重組DNA載體」，是指由重組DNA技術製備的載體，其含有一可操縱地連接於致癌基因DNA/致癌基因的表達控制序列。重組DNA載體的製備，技術上是眾所周知的。「表達控制序列」，是指一種DNA序列，如啟動子(啟動基因)它調節致癌基因DNA/致癌基因的轉錄。「啟動子」是指致癌基因DNA/致癌基因上遊的任何區域，其允許RNA多聚酶的結合和發生轉錄。「可操縱地連接」的意思是指致癌基因DNA/致癌基因轉錄或轉譯地連接於適當的表達控制序列。脂質體的製備和抗體包被的脂質體的製備，在技術上是眾所周知的。
含有正常的、經激活/刺激的初級細胞和致癌基因DNA/致癌基因的懸浮液在經受電穿孔作用之前，最好於約2-4℃保溫5-10分鐘左右。然後，對懸浮液施以1-10次、最好3-5次的高壓電脈衝藉以用致癌基因DNA/致癌基因轉染正常的、經激活/刺激的初級細胞。在用401型BTX電動細胞操作儀時，較為適當的電脈衝長度(時間)為大約50到99微秒左右，尤以99微秒為好。401型BTX電動細胞操作儀的振幅較為適當，它能達到最大振幅。對釋放到細胞/DNA懸浮液中之電脈衝的最適電壓、長度、振幅和脈衝數，可由本領域內技術人員使用本發明的方法，並依據所用初級細胞的性質、致癌基因DNA/致癌基因源的性質、懸浮液中初級細胞的濃度，懸浮液中致癌基因DNA/致癌基因的濃度，所用保護培養基和所用電穿孔裝置的性能等多種因素加以確定。
在電穿孔作用之後，在加入新的培養基以滋養轉染的初級細胞之前，將懸浮液在大約2～4℃放置5～10分鐘左右。
在電穿孔作用之後，用鑑定永久化細胞系的常規技術由含有已轉染的初級細胞的懸浮液中回收本發明的永久化了的初級細胞系。例如，將細胞懸浮液分配到96孔培養板，並且每周換一次新鮮培養基或根據需要更換培養基。孔中含有細胞的克隆，顯示可連續增殖(依細胞克隆數而定)，例如可增殖至少6周，即含有本發明的永久化了的初級細胞系。
回收之後，可用常規技術克隆地擴增本發明之永久化初級細胞系，以產生該細胞系均質的細胞群體，該細胞系可在適當的培養基(即一種能維持該細胞系的生存力，並能使其增殖的培養基)中連續維持。
本發明也涉及一生產生物製品的方法，該製品的編碼序列是由含在本發明的永久化細胞學內的DNA組成的。該方法包括於能夠產生這類生物製品的條件下培養上述細胞系。如上所述，「編碼序列」包括那些自然地存在於用以製備本發明的永久化初級細胞系的正常的、經激活/刺激的初級細胞的DNA內編碼序列，以及用於本發明方法中的包含致癌基因DNA/致癌基因的編碼序列。所有正常的初級細胞均具有生產生物製品的潛在能力，該製品的編碼序列包括含在上述初級細胞中的DNA。激活/刺激此初級細胞可使它們能夠產生不同的或另外的生物製品。例如，用某種有用的抗原激活/刺激正常B淋巴細胞後，這些正常的被激活/刺激的B細胞便能分化成抗體生成細胞。產生的抗體將對激活/刺激抗原的某一決定簇是特異的。用本發明的方法使這種正常的、經激活/刺激的B淋巴細胞永久化，將產生一種能為單克隆抗體的生產提供連續來源的細胞系，以及包含於該永久化初級細胞系內的致癌基因DNA/致癌基因密碼序列的表達產物。同樣，其他正常初級細胞的永久化能使它們連續地生產(a)一種其編碼序列包括有含在初級細胞內之DNA的生物製品;例如，這樣的編碼序列可編碼淋巴激活素，如白細胞間素-1(IL-1)，白細胞間素-2(IL-2)或幹擾素;或者某種生長因子，以及(b)包含於這類永久化初級細胞系內的致癌基因DNA/致癌基因編碼序列的產物。用以培養能夠生產預期生物製品的本發明的之永久化初級細胞系的適當培養基條件，可由本領域內的技術人員按照常規技術並依據所用初級細胞的類型及期望產生的生物製品等其它因素來確定。按照本發明的方法，由本發明的初級細胞系生產的生物製品可被該細胞系直接地分泌到培養基中，在此情況下即可從培養基中分離出這種生物製品，如果想要分離，可由本領域內的技術人員使用常規的蛋白質分離技術來完成。這種生物製品亦可能不會分泌出來，此時如想要得到這類生物製品，則可應用常規技術，從此細胞系的培養物溶解產物中分離之。
本發明還涉及生產經共轉染含外源功能性DNA序列之永久化初級細胞系的方法，此方法包括(a)提供正常的、經激活/刺激的初級細胞;
(b)用致癌基因DNA/致癌基因和外源功能性DNA序列，通過電穿孔共轉染上述初級細胞，從而產生共轉染的初級細胞;以及(c)從此共轉染的初級細胞中回收含有外源功能性DNA序列的永久化初級細胞系。
本發明也涉及用本發明的方法經共轉染產生的永久化初級細胞系。
「功能性DNA序列」一詞，是指從任何來源衍生的DNA的任何分離區，其在本發明之永久化初級細胞系內是作為一種基因表達單位、結構基因、啟動子或一調節區而發揮功能的。「基因表達單位」是指一種結構基因和啟動子及為其轉錄和轉譯所需的調節區。「啟動子」是指允許RNA多聚酶結合和發生轉錄的結構基因上遊的任何區域。「調節區」是指調節結構基因轉錄的DNA序列。「結構基因」是指用作合成信使RNA之模板的某多肽的編碼序列。
「外源功能性DNA序列」，是指一功能性DNA序列，它並非天然地存在於用於本發明之方法的正常的、經激活/刺激的初級細胞DNA中，而且也不是導致按本發明方法使細胞永久化的致癌基因DNA/致癌基因的一部分。更優選的外源功能性DNA序列包括那些為醫藥學上重要的多肽例如(但並不限於)胰島素、生長激素、組織血纖維蛋白溶酶原激活劑、-1-抗胰蛋白酶、水蛭素、用於生產疫苗的抗原、淋巴激活素、生長因子、受體等產物編碼的DNA序列，以及為那些能提高本發明之共轉染的永久化初級細胞增殖能力的產物編碼的DNA序列。
用以生產本發明之共轉染的永久化初級細胞的通用方法學，大體上與用以生產本發明之永久化細胞系的方法相同，不同的只是其包括了致癌基因DNA/致癌基因和外源功能性DNA序列的共轉染。這種共轉染可同時或相繼地進行。「相繼地」是指可先用本發明的方法將經激活/刺激的初級細胞轉染成永久化的初級細胞系，然後再用外源功能性DNA序列經電穿孔或任何其他的DNA轉染技術轉染之。所用外源功能性DNA的量從1微克/毫升左右到100微克/毫升較為合適。所用外源功能性DNA的最適量由本領域的技術人員使用本發明的方法，並依據於所用的外源功能性DNA的性質以及上述影響生產本發明永久化初級細胞之方法的其它因素加以確定。這種外源功能性DNA序列可以游離DNA的形式加入到懸浮液內，摻入到一適當的重組DNA載體中(它也可含有所用的致癌基因DNA/致癌基因)，或者可將其包裹在攜帶對用於共轉染的初級細胞表面抗原決定簇特異之抗體的脂質體內。用以共轉染的電穿孔的優選條件，即電脈衝振幅、電壓和長度(脈衝持續時間)，均與上面概述的製備本發明之永久化初級細胞系的條件相同。
電穿孔作用之後，可用下述技術從懸浮液中回收本發明之共轉染的永久化初級細胞(a)使用上述的，用於常規鑑定永久化細胞系的技術;
(b)使用鑑定包含外源功能性DNA序列之永久化細胞系的常規技術。
回收之後，可用常規技術克隆擴增本發明之共轉染的永久化初級細胞系，以生產該細胞系均一群體。該細胞系可在適當的培養基(即能使該細胞系保持活存並連續增殖的培養基)中持續傳代。這樣的培養基可由本領域內的技術人員來選定。
本發明還涉及一生產生物製品的方法，製品的編碼序列包含於含在本發明之共轉染的永久化初級細胞系的DNA內;此方法包括在能夠生產該生物製品的條件下培養所說的細胞系。如上所述，「編碼序列」包括外源功能性DNA序列的編碼序列以及天然存在於用以製備本發明之共轉染的永久化初級細胞系的正常、經激活/刺激過的初級細胞的DNA中，還包括用於該細胞系之製備的致癌基因DNA/致癌基因的編碼序列。
培養本發明之共轉染的永久化初級細胞以使之能夠產生易於生產的預期之生物製品的適當的培養條件，可由本領域內的技術人員使用常規技術尤其是依據所包括的初級細胞系的類型及所要生產的預期生物製品等因素而很容易地確定下來。依照本發明方法由共轉染的永久化初級細胞系產生的生物製品，可由這樣的細胞系直接分泌到培養基中，在這種情況下如需要分離產品時，即可由本領域的熟練技術人員使用常規的蛋白質分離技術將此類生物製品從培養基中分離出來;在生物製品不能被細胞系分泌出來的情況下，如想要從中分離出生物製品，即可應用常規技術從此細胞系的培養物溶解產物中得到。
因此，本發明的共轉染的永久化初級細胞系提供了下述多肽的持續來源(a)由在本發明中應用來製備初級細胞系的、天然存在於本發明之正常的、經激活/刺激過的初級細胞內的DNA編碼的多肽;
(b)由用於此發明方法的致癌基因DNA/致癌基因編碼的多肽以及(c)由包含於本發明之共轉染的永久化初級細胞系內的外源功能性DNA序列編碼的多肽。
現還發現，主要地由致癌基因組成的DNA能用於使正常的初級細胞永久化。因此，本發明也涉及一種永久化的初級細胞系，其條件是這種永久化作用是用主要含致癌基因的DNA轉染正常的初級細胞的結果。製備此種永久化的初級細胞系的最適宜的方法是依照本發明的方法，經電穿孔作用介導轉染正常的初級細胞。
實施例下述實施例均更為充分地公開了本發明的特定實施方案。這些實施例旨在作為本發明的例證，而不能構成對本發明之範圍的限制。
例1
淋巴細胞的刺激/激活淋巴細胞的刺激/激活是用常規的技術完成的，如應用下列的通用方法學(a)正常人或小鼠淋巴細胞是經用所需的抗原(不同的量)以不同途徑注射到動物體內而使之在體內被激活/刺激的。本發明的方法中，激活/刺激和轉染兩者間的時間間隔，以及注射的次數可能是不同的。從小鼠脾臟中分離得來正常的、經刺激/激活的淋巴細胞，並按〔Kennett等，Current Topics in Microbiol.and Immunol.，81，77-94(1978)〕處理。
(b)正常人或小鼠淋巴細胞用抗原或分裂素作為刺激/激活劑，於體外被刺激的/激活。用特異抗原在體外刺激/激活是參照Jonak等〔Hybridoma，3，107-118(1984)〕所敘述的改進方法。
(c)在體內已接觸抗原的正常的人或小鼠淋巴細胞，再在體外的用預期的抗原/分裂素重複刺激。
例2人淋巴細胞的永久化作為依本發明的方法用致癌基因DNA/致癌基因生產永久化初級細胞的一個普通例證，將正常人淋巴細胞懸浮液和致癌基因DNA混合，並暴露於高壓電脈衝。具體方法如下正常的人淋巴細胞(外周血淋巴細胞)用淋巴細胞分離劑(Iymphoprep)經離心純化。按實施例1中所述的方法激活/刺激細胞。將這種正常的經激活/刺激的初級細胞懸浮於冰冷的磷酸鹽-緩衝鹽水(PBS，未加MgCl2或CaCl2)中再次離心(200×克/10分鐘)。將所得片狀沉澱物再懸浮於PBS緩衝液中，濃度為1-5×107個細胞/毫升。將從人腫瘤細胞系(Burkitt′s淋巴瘤，BJAB)純化的、其起源與B-淋巴細胞細胞型相一致的基因組DNA(40-50微克/毫升)或含有功能性致癌基因的質粒DNA(P53-H7)(1～20微克/毫升)加入細胞懸浮液內，並在401型BTX電細胞操作儀的電穿孔室中於0℃保溫10分鐘。之後給予3-5次電脈衝(1000伏/釐米到5，500伏/釐米)(最大振幅)(寬度在99微秒內)。
電脈衝作用後將細胞和DNA在0℃放置10分鐘，再加入5毫升經過調節的TY培養基(Jonak等，「Monoclonal Antibodies and Functional Cell Lines」Plerum Press，418-422，1984)並分到96孔的培養板中，供以新鮮培養基，每月一次或根據需要更換新鮮培養基。
在用致癌基因(插入表達載體的功能性致癌基因)P53或得自BJAB人Burkitt氏淋巴瘤細胞系的致癌基因DNA經電穿孔轉染人淋巴細胞的實驗中，已成功地取得了高效永久化。此成功已清楚地為業經得到的高效的連續增殖細胞數所證明。在對照實驗中，同樣方法處理淋巴細胞，不同的是以正常DNA代替致癌基因DNA/致癌基因，或被省略之。將用致癌基因DNA/致癌基因轉染的培養物與對照組比較，表明用致癌基因DNA/致癌基因轉染的細胞中呈現增殖的細胞數(以克隆數表示)高了許多。對照實驗中的細胞於三周內死亡。致癌基因DNA/致癌基因轉染的細胞則可持續增殖6周到幾個月以上，從而證實它們的永久化。
例3小鼠淋巴細胞的永久化用全脾臟灌注法製備Balb/c小鼠的脾細胞(雌性，得自Charles River實驗室)並用0.83%的NH4Cl在4℃處理5分鐘以溶解紅細胞。然後離心分離淋巴細胞，將片狀沉澱物再懸浮於5毫升Dulbecco′s改進的含高葡萄糖的EAGLE′S培養基(DMEM)(見Cerottini等J.Exp.Med.，140.，703-717，1974)內，並加至一尼龍棉柱上(柱內裝尼龍棉10毫升)。將此柱子在37℃保存45分鐘，加入20毫升添加了5%胎牛血清(FCS)並加溫到37℃的DMEM培養基經過濾而除去T細胞，(Julius等.，Eur.J.Immunol.，3∶645，1973)。用20毫升相同的培養基與尼龍棉混合，從柱子上回收b淋巴細胞。離心出此細胞，將片狀沉澱(一個脾約有4×107B細胞)再懸浮於添加了5%FCS的DMEM的Iscove氏改進培養基(RPMI1640)(見Moore等，GAMA，199，519-524，1967)內。此細胞(3×107)裝在有20毫升添加了5%熱滅活之胎牛血清(FCS)，2mM(毫克分子)穀氨酸胺，5×10-5摩爾2-巰基乙醇和慶大黴素的RPMI1640培養基的組織培養瓶中，於37℃並充以7%CO2的條件下保溫。
為完成分裂素-誘發的刺激，將純化的B淋巴細胞加20微克/毫升(20微克/毫升)的脂多糖(LPS)保溫。細胞在用LPS(3(H)-胸腺嘧啶參入到DNA中以指示刺激的程度)經刺激24-48小時之後，達到了最大刺激。培養24-48小時後，用PBS緩衝液(無CaCl2或MgCl2)將淋巴細胞洗滌2次，以2×106～2×107細胞/毫升的細胞濃度再懸浮並於0℃保存。致癌基因DNA的來源是由EL4小鼠胸腺瘤細胞系(ATCC.TIB39)純化的基因組DNA或是插入到合適表達載體內的致癌基因Ha-ras〔從T24(ATCC HTB4)分離的〕。電穿孔是經下列步驟達到的(a)將106-107細胞/0.5毫升PBS和40微克基因組DNA或10-100毫微克致癌基因懸浮在401型BTX電動細胞操作儀的電穿孔室中，(b)給予3-5次電脈衝(最大時間長度和振幅)。電穿孔後，將細胞於0℃放置10分鐘，然後用TY培養基〔見Jonak等，「Monoclonal Antibodies and Functional Cell Lines(Progress and Application)，」Plenum Press，418-422(1984)〕。稀釋到濃度為106細胞/毫升，將細胞以每孔2×105細胞的濃度加入96孔培養板中於37℃培養。將細胞每周換一次新鮮培養基。培養3-4周後，培養板各孔顯現擴增了生長的細胞。這樣的細胞具有未成熟細胞的形態，並在培養中生長了幾個月。這些實驗結果表明這種刺激在永久化中起到一個重要的作用，因為未刺激的淋巴細胞在用致癌基因DNA/致癌基因經電穿孔作用介導轉染後並沒有生長。
例4電穿孔/DNA-脂質體釋放本發明的電穿孔技術，能將攜帶含有致癌基因/致癌基因DNA的脂質體的抗體/蛋白A的應用與電穿孔作用聯合起來。
由54摩爾%的二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼(Avanti極性脂質)、10摩爾%的二肉豆蔻醯磷脂醯絲氨酸(Avanti)、35摩爾%膽固醇(Sigma)和用n-羥基琥珀醯亞胺基3-(2-吡啶基二硫丙酸)(SPDP)(Pharmacia)改性的二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺(Sigma)組成的大單層脂質體囊泡是按照改進的反相蒸發技術的方法(Szoka和Papahadjopoulos，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，75∶4194-4198，1978)製成的。將脂質溶於1毫升氯仿2毫升二異丙醚(Merck)中。按已述方法將水溶液(1毫升在緩衝鹽水中含有1～2毫克業經放射標記的質粒DNA的等分式樣)和有機相分開放入配有Luer栓的氣封玻璃注射器中〔Machy and Leserman，Biophy.Biochem.Acta，730∶313-320，(1983)，Machy and Leserman，「Liposome Technology」(Gregoriadis，ed.)CRC Press，Cleveland Vol.I∶221-234，(1984)〕。注射器均連接一金屬三通閥。將水相注射到有機相中，然後使混合液能迅速地從一注射器轉到另一注射器內，反覆通過10～20次。將此脂質-水乳化液轉移到14毫升旋轉蒸發管內，加熱到45℃，使有機相在350-400毫米汞柱壓力時除去。然後通過0.4微毫米(um)單孔聚碳酸酯過濾器(Bio-Red)過濾，根據大小而選擇出逆相蒸發囊泡(REV)。(Olson等，Biochem.Biophys.Acta，557∶9-23(1979)〕。
將脂質體與蛋白A(Pharmacia)及經10摩爾SPDP/摩爾蛋白A改性的碘化蛋白A(NEN)之等分試樣保溫(終濃度為200微克/毫升)〔Leserman等，Nature，288∶602-604，(1980);Machy等，J.Immunol.，129∶2098-2102，(1982)〕。脂質體的終濃度約為20毫摩爾。偶聯反應是於室溫下，在L-緩衝液(145毫升NaCl，10毫摩爾Hepes，pH8)中反應20小時完成的。在結合含DNA蛋白A包被的脂質體以前，依下述方法純化之將脂質體與在添加了10毫升MgCl2的L-緩衝液中的5微克/毫升的DNase I(Sigma)於25℃保溫30分鐘。然後使含有DNA的蛋白A包被的脂質體通過用L-緩衝液(pH7.45)平衡過的瓊脂糖4B-CL柱。從而使未偶聯的蛋白A和降解了的未被包裹的DNA從脂質體製劑中除去。通常約有5%的DNA被包裹並有5-10%的蛋白A偶合到脂質體的表面上。
這些更適用的脂質體與淋巴樣細胞按下述方法一起保溫人B-細胞(107)同40微克/毫升單克隆抗體於4℃保溫1小時。然後洗去未結合的抗體並同3微克含有DNA的蛋白A包被的脂質體於4℃保溫2小時。脂質與抗體預處理的細胞結合。然後，用上述方法使細胞被電穿孔。例如，當這些細胞在加脂質體之前同抗-HCA抗體保溫時，至少有35%的培養孔顯示有轉染過的細胞。若用不相干的抗體或不加抗體，則只有8-10%的培養孔顯示有轉染的細胞。當細胞同抗-HCA抗體和脂質體保溫但未電穿孔時，則沒有細胞受到轉染。此實施例的結論是，只有中靶的脂質體才能用電穿孔轉染細胞。
這種研究方法的優點是，DNA(包裹到脂質體中)會特異地釋放到混合細胞群體中預期類型的細胞內(即成熟B-細胞、單核細胞)。脂質體的內含物(致癌基因DNA/致癌基因)將會通過施以電脈衝被引入細胞內。必需指出的是，並不期望或需要脂質體同靶細胞融合，但希望經施以電脈衝，使DNA通過靶細胞和脂質體間形成微孔(該微孔是電脈衝的結果)插入到細胞中。此改進方法的優點是，可使DNA特異地釋放到淋巴細胞混合群體內的預期之細胞類型中。
雖然以上描述和實施例充分地說明本發明及其優選的實施方案，但不言自明的是，本發明並不限於這些特別公開的實施方案。因此，本發明包括以下權利要求
範圍內的所有實施方案。
權利要求
1.一種生產永久化初級細胞系的方法，此方法包括(a)提供正常的、經激活/刺激的初級細胞；(b)經電穿孔作用用致癌基因DNA/致癌基因(包含或不包含於脂質體中)轉染上述初級細胞，從而產生轉染了的初級細胞；以及(c)自上述轉染的初級細胞中回收永久化的初級細胞系。
2.根據權利要求
1的方法，其中致癌基因DNA是從初級細胞腫瘤或腫癌初級細胞系得來的基因組DNA，其中這樣的腫瘤或腫瘤細胞系具有與將被永久化初級細胞類型相一致的起源。
3.根據權利要求
1的方法，其中致癌基因是從一初級細胞腫瘤或腫瘤的初級細胞系得來的，其中這樣的腫瘤或腫瘤細胞系具有與將被永久化的初級細胞類型相一致的起源。
4.根據權利要求
2的方法，其中初級細胞是造血細胞源。
5.根據權利要求
4的方法，其中初級細胞是多潛能幹細胞、B-淋巴細胞、B-系細胞前體、T-淋巴細胞。T-系細胞前體、髓樣幹細胞、單核細胞、巨噬細胞、中性白細胞、嗜曙紅細胞、巨核細胞或肥大細胞。
6.根據權利要求
4的方法，其中初級細胞都是B-淋巴細胞。
7.根據權利要求
5的方法，其中B一淋巴細胞是已用抗原激活/刺激過的。
8.根據權利要求
5的方法，其中致癌基因是Ha-ras致癌基因或P53-H7致癌基因。
9.根據權利要求
6的方法，其中致癌基因DNA是從BJAB得來的基因組DNA。
10.根據權利要求
6的方法，其中致癌基因DNA是從REH細胞系得來的基因組DNA。
11.根據權利要求
6的方法，其中致癌基因DNA是從EL4細胞系得來的基因組DNA。
12.根據權利要求
1的方法產生的永久化的初級細胞系。
13.根據權利要求
12的細胞系，其中致癌基因DNA是從初級細胞腫瘤或腫瘤初級細胞系得來的基因組DNA，其中這樣的腫瘤或腫瘤細胞系具有與將被永久化的初級細胞系類型相一致的起源。
14.根據權利要求
12的細胞系，其中致癌基因是從初級細胞腫瘤或腫瘤初級細胞系得來的，其中這樣的腫瘤或腫瘤細胞系具有與將被永久化的初級細胞類型相一致的起源。
15.根據權利要求
12的細胞系，其中初級細胞是造血細胞源。
16.根據權利要求
15的細胞系，其中的初級細胞是多潛能幹細胞、B-淋巴細胞、B-系細胞前體、T-淋巴細胞、T-系細胞前體、髓樣幹細胞、單核細胞、巨噬細胞、中性白細胞、嗜曙紅細胞、巨核細胞或肥大細胞。
17.根據權利要求
16的細胞系，其中初級細胞是B-淋巴細胞。
18.根據權利要求
17的細胞系，其中B一淋巴細胞是已用抗原激活/刺激過的。
19.根據權利要求
16的細胞系，其中致癌基因是Ha-ras致癌基因。
20.根據權利要求
16的細胞系，其中致癌基因DNA是來自BJAB基因組DNA。
21.根據權利要求
16的細胞系，其中致癌基因DNA是從REH細胞系得來的基因組DNA。
22.根據權利要求
16的細胞系，其中致癌基因DNA是從EL4細胞系得來的基因組DNA。
23.一種生產生物製品的方法，其中生物製品的編碼序列包含在含於永久化的初級細胞系中的DNA內，此方法包括(a)提供正常的、經激活/刺激的初級細胞;(b)經電穿孔作用用致癌基因的DNA/致癌基因(可任意選擇地包含於脂質體中)轉染上述初級細胞，從而產生轉染的初級細胞;(c)自這種轉染的初級細胞回收永久化的初級細胞系;並且(d)在能夠生產此生物製品的條件下培養此種永久化的細胞系。
24.一種生產含有外源功能性DNA序列的共轉染的永久化初級細胞系的方法，該方法包括(a)提供正常的、經激活/刺激過的初級細胞;(b)用致癌基因DNA/致癌基因和外源功能能性DNA序列(可任意選擇地包含於脂質體中)經電穿孔共轉染這種初級細胞，從而產生共轉染的初級細胞;(c)從這種共轉染的初級細胞回收含有外源功能性DNA序列的永久化的初級細胞系。
25.根據權利要求
24的方法，其中致癌基因DNA是來自初級細胞腫瘤或腫瘤初級細胞系的基因組DNA，其中此腫瘤或腫瘤細胞系具有和將被永久化的初級細胞類型相一致的起源。
26.根據權利要求
24的方法，其中致癌基因是來自初級細胞腫瘤或腫瘤初級細胞系，其中此腫瘤或腫瘤細胞系具有與將被永久化的初級細胞類型相一致的起源。
27.根據權利要求
24的方法，其中初級細胞均為造血細胞源。
28.根據權利要求
27的方法，其中初級細胞是多潛能幹細胞、B-淋巴細胞、B-系細胞前體、T-淋巴細胞、T-系細胞前體、髓樣幹細胞、單核細胞、巨噬細胞、中性白細胞、嗜曙紅細胞、巨核細胞或肥大細胞。
29.根據權利要求
28的方法，其中的初級細胞是B-淋巴細胞。
30.根據權利要求
29的方法，其中的B一淋巴細胞是已用抗原激活/刺激過的。
31.根據權利要求
29的方法，其中致癌基因是Ha-ras致癌基因或P53-H7致癌基因。
32.根據權利要求
29的方法，其中致癌基因DNA是從BJAB得來的基因組DNA。
33.根據權利要求
29的方法，其中致癌基因DNA是從REH細胞系得來的基因組DNA。
34.根據權利要求
29的方法，其中致癌基因DNA是從EL4細胞系得來的基因組DNA。
35.用權利要求
24的方法生產的共轉染的永久化初級細胞系。
36.根據權利要求
35的細胞系，其中致癌基因的DNA是來自初級細胞腫瘤或腫瘤初級細胞系的基因組DNA，其中此腫瘤或腫瘤細胞系具有與將被永久化的初級細胞類型相一致的起源。
37.根據權利要求
35的細胞系，其中致癌基因是來自初級細胞腫瘤或腫瘤的初級細胞系，其中這樣的腫瘤或腫瘤細胞系具有與將被永久化的初級細胞類型相一致的起源。
38.根據權利要求
35的細胞系，其中初級細胞是造血細胞源。
39.根據權利要求
38的細胞系，其中初級細胞為多潛能幹細胞、B-淋巴細胞、B-系細胞前體、T-淋巴細胞、T-系細胞前體、髓樣幹細胞、單核細胞、巨噬細胞、中性白細胞、嗜曙紅細胞、巨核細胞或肥大細胞。
40.根據權利要求
39的細胞系，其中初級細胞為B-淋巴細胞。
41.根據權利要求
40的細胞系，其中B-淋巴細胞是已用抗原激活/刺激過的。
42.根據權利要求
40的細胞系，其中致癌基因是Ha-ras致癌基因。
43.根據權利要求
40的細胞系，其中致癌基因DNA是來自BJAB的基因組DNA。
44.根據權利要求
40的細胞系，其中致癌基因DNA是來自REH細胞系的基因組DNA。
45.根據權利要求
40的細胞系，其中致癌基因DNA是來自EL4細胞系的基因組DNA。
46.一種生產生物製品的方法，該生物製品的編碼序列包括含於含有外有源功能性DNA序列的經轉染的永久化細胞系中的DNA內，該方法包括(a)提供正常的、經激活/刺激過的初級細胞;(b)用致癌基因DNA/致癌基因和外源功能性DNA序列(該序列可任選地包裹於脂質體中)經電穿孔以共轉染此初級細胞，從而產生共轉染的初級細胞;(c)自此共轉染的初級細胞回收含有外源功能性DNA序列的共轉染的永久化初級細胞系;以及(d)在能生產所需生物製品的條件下培養這一共轉染的永久化的細胞系。
47.一種永久化的初級細胞系，其條件是這種永久化作用是用主要含致癌基因的DNA轉染正常初級細胞的結果。
48.根據權利要求
47的細胞系，其中致癌基因是來自初級細胞腫瘤或腫瘤的初級細胞，其中這樣的腫瘤或腫瘤細胞系具有與將被永久化的初級細胞類型相一致的起源。
49.根據權利要求
47的細胞系，其中初級細胞是造血細胞源。
50.根據權利要求
49的細胞系，其中初級細胞是多潛能幹細胞、B-淋巴細胞、B-系細胞前體、T-淋巴細胞、T-系細胞前體、髓樣幹細胞、單核細胞、巨噬細胞、中性白細胞、嗜曙紅細胞、巨核細胞或肥大細胞。
51.根據權利要求
50的細胞系，其中初級細胞是B-淋巴細胞。
52.根據權利要求
51的細胞系，其中致癌基因是Ha-ras致癌基因或P53-H7致癌基因。
專利摘要
應用電穿孔作為一種轉染方法，用致癌基因DNA/致癌基因使初級細胞永久化。
文檔編號C07K14/47GK87102457SQ87102457
公開日1988年1月13日 申請日期1987年2月28日
發明者愛德華·馬克·亨利, 茲登卡·勒德米拉·喬納克, 派屈克·西蒙·雅克·馬希 申請人:史密絲克萊恩貝克曼公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan