Nami－a納米微粒及其製備方法與應用的製作方法
2023-06-04 18:51:51
專利名稱：Nami－a納米微粒及其製備方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及納米抗腫瘤藥物，特別是涉及NAMI-A納米微粒及其製備方法與應用。
背景技術：
惡性腫瘤具有極高的致死率，是目前危害人類健康最主要的疾病之一。近年來，非鉑類金屬抗腫瘤藥物的研究得到了很大的發展，其中最受人們關注的是釕的配合物。釕(Ru)配合物的抗腫瘤活性與其所具有的生理活性有關。通常Ru的配合物與DNA結合的能力比Pt類配合物強很多。在生理條件下，Ru配合物的抗腫瘤活性在於與血漿和蛋白(白蛋白和鐵傳遞蛋白)的結合具有顯著的選擇性，其選擇性來自於咪唑配體。體外和體內生理學實驗結果表明，NAMI-A和一些釕的配合物幾乎不具有毒性，釕的配合物容易吸收並在體內很快排洩。國際上已普遍認為，釕配合物將成為最有前途的藥物之一。歐盟自1997年已成立了釕抗癌藥物的研究和發展工作組(COST D8)，進一步加強釕抗癌藥物的研究，其中最受關注的是[ImH][RuCl4-(DMSO)(Im)](以下稱NAMI-A)。1999年，NAMI-A在該類具有抗癌活性的化合物中第一個進入一期臨床階段，並且於2002年下半年進入了二期臨床階段。釘配合物對腫瘤細胞的抑制並不是對其有直接毒害作用，而是通過有選擇性的抑制細胞的新陳代謝來改變腫瘤細胞的毒性。所以，NAMI-A在治療癌症的臨床上具有廣闊的發展空間。
大量研究表明，NAMI-A在水溶液中不穩定，容易水解。NAMI-A的極易水解對其抗腫瘤活性和藥物的緩慢控制釋放具有很大的影響，故需要得到能在水溶液中穩定，並可長期儲存的藥物。Bouma等人通過一系列的研究，發現冷凍乾燥可使NAMI-A在一定的溫度和溼度下長期保存，從而彌補了NAMI-A極易水解的不足。
影響抗癌藥物應用的主要因素為藥物的靶向性和釋放速度。然而大分子藥物的給藥存在一定的缺陷，通過口服或注射給藥，短時間內體內藥物濃度遠超過實際需求量，且缺乏進入人體的選擇性；大分子藥物新陳代謝快、半衰期短，使藥物在體內的濃度很快降低而影響療效，故需要大劑量給藥，而過高的藥物濃度又會增強藥物的副作用；生物大分子藥物在體內易被酶降解或失活，生物半衰期短，須重複給藥，還受到如免疫系統、組織、細胞膜等的限制，多數不易通過這些生物屏障，因而大分子藥物的生物利用度較低。為了克服上述問題，我們將藥物製成納米微球。納米材料由於顆粒度極小，表面積非常大，藥物可高密度的負載在納米材料表面，形成局部的濃度，提高藥物的利用率。此外，納米載體藥物除具有低毒、高效、緩釋、長效、能識別變異細胞、藥物穩定性好、藥物釋放後的高分子載體無毒、不會長期積累在體內及副作用小等優點外，還有更強的定向釋放能力。故納米載體藥物能很好的解決現今抗癌藥物臨床應用中存在的各種問題，具有良好的發展前景。我們採用聚合物PLGA作為載體，製成了NAMI-A的納米微球，從而解決抗癌藥物控制釋放的問題。
發明內容
本發明的目的是克服現有NAMI-A藥物在抗癌應用上存在的不足，提供一種生物相容性好，抗腫瘤活性好，粒徑理想，可以控制藥物緩慢釋放的NAMI-A納米微粒。
本發明的另一個目的是提供一種步驟簡單，穩定性高，重複性好的NAMI-A納米微粒的製備方法。
本發明的進一步目的是提供上述NAMI-A納米微粒在製備抗腫瘤藥物中的應用。
本發明的NAMI-A納米微粒是一種含有釕配合物NAMI-A，含有NAMI-A和基本材料，基本材料為殼聚糖或聚合物Poly(Lactide-co-glycolide)(以下稱PLGA)。
上述本發明的納米微粒可採用雙乳化法製備，包括如下步驟(1)將PLGA溶解於二氯甲烷溶液中配成濃度為25-40mg/ml的PLGA溶液，NAMI-A溶解於水中配成濃度為1-5mg/ml的NAMI-A溶液，膽酸鈉溶解於水中配成濃度為1-5mg/ml的膽酸鈉溶液；PLGA∶NAMI-A∶膽酸鈉的重量比是15∶2∶10～10∶1∶10；(2)將NAMI-A溶液加入到PLGA溶液中，超聲初乳化，形成的懸浮液加入膽酸鈉溶液中，超聲復乳化，得懸浮液；(3)將上述懸浮液通過孔徑為0.12μm的微孔濾膜，將濾液離心收集固體，將收集到的固體乾燥，得到NAMI-A納米微粒。
上述步驟(2)所述超聲初乳化和超聲復乳化是採用超聲探頭進行乳化，時間為1-10min。採用超聲探頭分散樣品的初乳液和復乳液，以減小及控制納米微粒的粒徑。
上述本發明的納米微粒可採用離子凝膠法製備，包括如下步驟(1)將殼聚糖溶解於1％醋酸溶液中配成濃度為1-5mg/ml的殼聚糖溶液，並過0.22μm的濾膜；多聚磷酸鈉(簡稱TPP)溶解於水中配成濃度為0.5-2mg/ml的TPP溶液；殼聚糖∶NAMI-A∶TPP的重量比是30∶1∶10～60∶1∶10；(2)將NAMI-A溶解於殼聚糖溶液中，攪拌，將NAMI-A殼聚糖溶液加入到TPP溶液中，攪拌；(3)離心收集固體，乾燥，得到NAMI-A納米微粒。
上述步驟(2)所述的攪拌為磁力攪拌，速度為200-400rpm，攪拌的時間為5～10min。採用磁力攪拌分散溶液，通過磁力攪拌的速度控制納米微粒的粒徑。
在上述雙乳化法和離子凝膠法製備中，所述乾燥方法採用冷凍乾燥或真空乾燥。
在上述NAMI-A納米微粒中，所述PLGA的分子量為5000-15000。膽酸鈉中膽酸鈉含量≥65％；二氯甲烷為分析醇，其中二氯甲烷含量≥95％。殼聚糖為粘度＜100cps，脫乙醯度＞90.0％。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果1、本發明選用可生物降解的原料(殼聚糖或PLGA)作為基本材料，使製得的納米微粒生物相容性好，抗癌活性好，無毒副作用；製得的納米微粒呈規整的圓球型；製得的納米微粒可以控制藥物的緩慢釋放。
2、本發明納米微粒的製備方法簡單，穩定性高，重複性好。
具體實施例方式實施例1將150mg PLGA(分子量為8000)溶解於4ml二氯甲烷中，將6ml溶解有20mg NAMI-A的水溶液加入到PLGA溶液中，用超聲波細胞粉碎儀超聲乳化5min。將形成的懸浮液加入20ml溶解有100mg膽酸鈉的水溶液中，超聲乳化5min，得懸浮液。將上述懸浮液通過孔徑為0.12μm的微孔濾膜，將濾液用高速離心機離心(15000rpm)15min，收集固體。用蒸餾水將收集到的固體分散，再離心一次(15000rpm)，收集固體。將收集到的固體用冷凍乾燥機冷凍乾燥24h，得到白色粉末狀的NAMI-A納米微粒。通過雷射粒度分析儀測定其粒徑為195nm；熱場環掃電鏡觀測粒子為規整的圓球形。
實施例2將100mg PLGA(分子量為8000)溶解於4ml二氯甲烷中，將6ml溶解有10mg NAMI-A的水溶液加入到PLGA溶液中，超聲乳化10min。將形成的懸浮液加入20ml溶解有150mg膽酸鈉的水溶液中，超聲乳化10min，得懸浮液。將上述懸浮液通過孔徑為0.12μm的微孔濾膜，將濾液用高速離心機離心(15000rpm)15min，收集固體。用蒸餾水將收集到的固體分散，再離心一次(15000rpm)，收集固體。將收集到的固體用冷凍乾燥機冷凍乾燥24h，得到白色粉末狀的NAMI-A納米微粒。通過雷射粒度分析儀測定其粒徑為133nm；熱場環掃電鏡觀測粒子為規整的圓球形。
實施例3將100mg殼聚糖溶解於50ml l％醋酸溶液中，通過0.22μm的濾膜。將10mg NAMI-A溶解於殼聚糖溶液中，在室溫攪拌下(200rpm)用7號針筒將上述溶液滴加入20ml濃度為1.0mg/ml的TPP水溶液中，使殼聚糖與TPP的質量比為5∶1，攪拌10min。高速離心(12000rpm)10min，收集固體。用蒸餾水將收集到的固體分散，再離心一次(15000rpm)，收集固體。室溫下真空乾燥，得到白色粉末狀的NAMI-A納米微粒。通過熱場還掃電鏡觀測粒子為規整的圓球形，粒徑約為50nm。
實施例4將100mg殼聚糖溶解於50ml 1％醋酸溶液中，通過0.22μm的濾膜。將10mg NAMI-A溶解於殼聚糖溶液中，在室溫攪拌下(200rpm)用7號針筒將上述溶液滴加入30ml濃度為1.0mg/ml的TPP水溶液中，使殼聚糖與TPP的質量比為3∶1，攪拌10min。高速離心(12000rpm)10min，收集固體。用蒸餾水將收集到的固體分散，再離心一次(15000rpm)，收集固體。室溫下真空乾燥，得到白色粉末狀的NAMI-A納米微粒。通過熱場還掃電鏡觀測粒子為規整的圓球形，粒徑約為50nm。
實施例5載藥納米微粒的體外抗腫瘤活性的測定人肝癌HepG2細胞株，人胃腺癌SCG-7901細胞株，人肝癌BEL-7402細胞株，人宮頸癌HELA細胞株。MTT法測定的IC50(μg/ml)值分別為250.2；232.4；275.8；171.7。
實施例6NAMI-A納米微粒對動物移植性腫瘤小鼠肝癌H22的抑制實驗昆明小鼠，18～22g，雌雄並用，(每批實驗同一性別)。常規接種腫瘤，接種後24h，隨機分組並開始給藥，每組10隻，實驗設陰性對照組，陽性藥物(環磷醯胺)對照組，NAMI-A納米微粒5，10，20mg/kg不同劑量治療組。納米微粒經sc給藥每10g體重給藥0.1ml，每日1次，連續給藥7d。環磷醯胺經ip給藥100mg/kg，給藥一次，末次給藥24h，頸椎脫臼處死小鼠，測量體重及瘤塊，計算抑瘤率，抑瘤率＝(對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100％，採用t檢驗，比較各組間的差異，進行療效評價。
表1、納米微球對小鼠移植性腫瘤肝癌H22的抑制作用
*P＜0.05**P＜0.01NAMI-A納米微粒體內抑瘤活性實驗結果顯示，納米微球對肝癌H22具有較高的抑制率，並且表現出一定的量效關係。
權利要求
1.一種NAMI-A納米微粒，包括NAMI-A，其特徵在於還含有殼聚糖或PLGA。
2.權利要求1所述的納米微粒的製備方法，其特徵在於採用雙乳化法，包括如下步驟(1)將PLGA溶解於二氯甲烷溶液中配成濃度為25-40mg/ml的PLGA溶液，NAMI-A溶解於水中配成濃度為1-5mg/ml的NAMI-A溶液，膽酸鈉溶解於水中配成濃度為1-5mg/ml的膽酸鈉溶液；PLGA∶NAMI-A∶膽酸鈉的重量比是15∶2∶10～10∶1∶10；(2)將NAMI-A溶液加入到PLGA溶液中，超聲初乳化，形成的懸浮液加入膽酸鈉溶液中，超聲復乳化，得懸浮液；(3)將上述懸浮液通過孔徑為0.12μm的微孔濾膜，將濾液離心收集固體，將收集到的固體乾燥，得到NAMI-A納米微粒。
3.權利要求1所述的納米微粒的製備方法，其特徵在於採用離子凝膠法，包括如下步驟(1)將殼聚糖溶解於1％醋酸溶液中配成濃度為1-5mg/ml的殼聚糖溶液，並過0.22μm的濾膜；TPP溶解於水中配成濃度為0.5-2mg/ml的TPP溶液；殼聚糖∶NAMI-A∶TPP的重量比是30∶1∶10～60∶1∶10；(2)將NAMI-A溶解於殼聚糖溶液中，攪拌，將NAMI-A殼聚糖溶液加入到TPP溶液中，攪拌；(3)離心收集固體，乾燥，得到NAMI-A納米微粒。
4.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於步驟(2)所述超聲初乳化和超聲復乳化是採用超聲探頭進行乳化，時間為1-10min。
5.根據權利要求3所述的製備方法，其特徵在於步驟(2)所述攪拌為磁力攪拌，速度為200-400rpm，攪拌時間為5～10min。
6.根據權利要求2或3所述的製備方法，其特徵在於所述乾燥方法採用冷凍乾燥或真空乾燥。
7.根據權利要求1所述的NAMI-A納米微粒，其特徵在於所述PLGA的分子量為5000-15000。
8.權利要求1所述NAMI-A納米微粒在製備抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及納米抗腫瘤藥物，公開了NAMI－A納米微粒及其製備方法與應用。本發明的NAMI－A納米微粒是一種含有釕配合物NAMI－A，含有NAMI－A和基本材料，基本材料為殼聚糖或PLGA。本發明的納米微粒可採用雙乳化法或離子凝膠法製備，方法簡單，穩定性高，重複性好。本發明選用可生物降解的殼聚糖或PLGA作為基本材料，使製得的納米微粒生物相容性好，抗癌活性好，無毒副作用；製得的納米微粒呈規整的圓球型；製得的納米微粒可以控制藥物的緩慢釋放。
文檔編號A61K31/555GK1931136SQ20061012270
公開日2007年3月21日 申請日期2006年10月13日 優先權日2006年10月13日
發明者劉傑, 張璇, 陳蘭美, 譚彩萍, 石碩, 計亮年 申請人:中山大學