一種豬口蹄疫苗用的複合分子型佐劑及其製造方法

2023-06-04 16:29:51

專利名稱：一種豬口蹄疫苗用的複合分子型佐劑及其製造方法
技術領域：
本發明涉及一種豬口蹄疫苗用的佐劑及其製造方法，更具體地說，涉及一種利用 基因工程技術生產的複合分子型佐劑，以及豬口蹄疫病毒滅活抗原疫苗與這種佐劑配伍而 成豬口蹄疫苗組合物。本發明的這種佐劑是由CpG基序和豬IFN-Y基因克隆入真核表達 載體構成。
背景技術：
自從上世紀20年代以來，許多物質被嘗試作為免疫佐劑，但只有鋁膠獲得了人類 疫苗佐劑的許可，並大量用於動物疫苗。它作為抗原的儲存庫和載體，緩慢釋放抗原延長誘 導機體的體液免疫反應，但缺點是僅誘導Th2體液免疫反應，抗體以IgGl型為主，無TCL反 應；油佐劑和弗氏完全佐劑雖能明顯提高免疫應答能力，但在實際應用中常出現不良反應， 如注射部位腫脹、疼痛、發燒，或發生過敏等，僅限用於實驗室內動物試驗；206佐劑是目前 商品化的高效動物疫苗油佐劑，已廣泛使用於動物疫苗中，實踐證實是可靠的、有效的和安 全的，但需要進口，價格較高。CpG基序已經報導的有三種類型(Klinman，et al，2004)。傳統的CpG ODN也叫做 K型CpG ODN或是B型CpG 0DN，可以活化B細胞和誘導巨噬細胞產生細胞因子。D型CpG 0DN,也叫做A型CpG，其活化B細胞與巨噬細胞能力較弱，但具有較強的誘導漿細胞樣樹突 狀細胞產生I型幹擾素的能力。C型CpG ODN可以誘生I型幹擾素，以及活化B細胞等功能。 它由多個CpG基序重複的硫代磷酸骨架和5』端的TCG 二聚體所組成。CpG基序能夠刺激機 體的免疫系統產生免疫應答，主要是由於免疫細胞具有能夠識別CpG基序的受體結構。目 前CpG ODN在免疫增強效應方面的研究已取得了一定的進展。非甲基化CpG基序的免疫 增強作用已被許多研究所證實，含非甲基化的CpG寡核苷酸序列(簡稱CpG 0DN)能使B、 T細胞激活，同時增強機體的特異性細胞免疫和體液免疫，它能誘導強烈的Thl型反應，以 IgG2a型為主，有TCL反應，同時能與鋁膠等其他佐劑配伍使用，有較好的協同作用(Risini D. W, M J. McCluskie, Yu Xu, et al. CpG DNA induces stronger immune responses with less toxicity than other adjuvant. Vaccine, 2000,18 :1755_1762)。中國發明專利200410033878. 1公開的一種新型免疫佐劑，其主要成分是從卡介 苗菌中提取的CpG-DNA，其為富含CpG基序的DNA。該佐劑為免疫刺激型佐劑，本身具有免 疫活性作用，在體內誘導的是Thl型免疫應答，可作為治療與預防用疫苗佐劑。中國發明專利200310106226. 1公開的能促進畜禽疫苗效價的用作 畜禽疫苗佐劑的CpG DNA的基因工程重組體，該基因工程重組體是根據由 序列為5' -GGTGCATCGATGCAGGGGGG-3'、5' -GGTGCGTCGATGCAGGGGGG-3'及 5，-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT—3，串聯而成的D 19D282006目的片段DNA的序列，合成其 寡核苷酸正鏈和負鏈，在合成的寡核苷酸末端加上能與線形載體末端相匹配的鹼基序列， 然後將此寡核苷酸片段、退火緩衝液、及無菌重蒸水混合後，於90°C 100°C水浴中孵浴3 分鐘以上，自然冷卻至室溫，形成含D19D282006序列的DNA片段，此後將此DNA片段插入線性載體的相應的酶切位點，最後，將其轉化感受態大腸桿菌而得到的基因工程重組體。IFN- Y是由Thl細胞和NK細胞分泌的多功能細胞因子，具有廣譜的抗病毒活性， 對多種病毒如DNA病毒和RNA病毒均有抑制作用。發現IFN除具有抗病毒、抗腫瘤活性以 外，還有強大的免疫調節活性，通過刺激細胞表達MHC I類分子和II類分子增強免疫反應。 近年來，隨著研究的深入，人們發現以重組IFN-Y為疫苗佐劑，不僅能特異性的增強疫苗 的免疫效果，而且可增強機體抗感染的能力。Schijns等用IFN-Y對狂犬病滅活苗免疫 的增強效果，結果表明IFN-Y對該疫苗免疫佐劑作用相當，可使疫苗達到50%保護的稀釋 倍數提高50倍，當標準疫苗做1 10000稀釋時，仍可有效提高機體免疫保護力(Schijns VECJ, 1994)。Virgil等(2002)用狂犬病毒和杯狀病毒與表達貓IFN- γ的重組杆狀病毒免 疫貓，結果發現IFN-Y可促進抗體的產生，增強抗原的特異性抗體水平，人IFN-Y作為乙 肝疫苗佐劑也能增強抗體的水平。中國發明專利200510119720.0公開的一種豬疫苗使用的基因佐劑，其特徵在於 重組表達質粒中含有豬Y-幹擾素基因(PlFN-Y)，在動物細胞中表達後發揮免疫增強作 用。但這種佐劑的免疫增強作用類型單一、程度有限，成本相對較高。

發明內容
本發明提供一種可克服現有技術不足，有更高安全性和高效、廉價的豬口蹄疫苗 用的複合分子型佐劑，以及這種佐劑的製造方法，同時提供一種使用這種佐劑的豬口蹄疫 苗組合物。本發明的這種豬口蹄疫苗用的複合分子型佐劑是由CpG基序和豬IFN-Y基因克 隆入真核表達載體構成的重組質粒。本發明的豬口蹄疫苗用的複合分子型佐劑，其CpG基序為至少由3個GTCGTT、2個 GACGTT和1個AACGTT特殊序列構成的一段基序，其序列為SEQ No :1，用其構建的PcDNA3. 1 重組質粒，並在大腸桿菌中增殖。本發明的豬口蹄疫苗用的複合分子型佐劑是由CpG基序構建的重組質粒，其序列 為 SEQ No :2ο本發明的豬口蹄疫苗用的複合分子型佐劑，所用的豬IFN-Y基因為含信號肽的 序列，其序列為SEQ No :3，用其構建的PcDNA3. 1重組表達質粒，使IFN-γ基因處在啟動子 的下遊、CpG序列的上遊，並能在哺乳動物細胞中表達。本發明的豬口蹄疫苗用的複合分子型佐劑的製備方法是人工設計、合成一段基本 骨架由3個GTCGTT、2個GACGTT和1個AACGTT所構成的CpG基序以及其配對序列，同時在 其5』端分別設計EcoRI和Xhol酶切位點的部分鹼基，並使其成為雙鏈DNA，通過基因重組 方法構建到經EcoRI和Xhol酶切的真核表達載體中，獲得含CpG基序的重組質粒；然後利 用豬 IFN-Y 特異引物上遊引物5，端CCCAAGCTTACAATGGGTTATACAACTACTTATTTCT Hid III ；下遊 5，端GGAATTCTTATTTTGATGCTCTCTGGCCT EcoR I，在 pGEM-Teasy-pIFN-γ 重組 質粒，參見「豬IFN-Y基因的克隆與序列分析」竇永喜、景志忠等，《中國獸醫科技》2003， 33(9) :11_15，上克隆pIFN-γ基因片段擴增獲得IFN-γ基因，再分別將含CpG基序的重組 質粒和IFN- γ基因經相應的酶切後連接，得到PcDNA-pIFN- y -CpG DNA重組質粒。本發明的豬口蹄疫苗用複合分子型佐劑製備方法中，首先將構建的PcDNA-pIFN- y -CpG DNA重組質粒轉化到大腸桿菌，再用氨苄青黴素抗性篩選陽性克隆，提 取重組質粒測序鑑定後，選擇高拷貝的陽性菌株，接種到含氨苄的LB培養基中大量增殖， 擴增PcDNA-pIFN- y -CpG DNA重組質粒，用SDS鹼裂解法大量提取重組質粒DNA。本發明的豬口蹄疫苗組合物是用豬口蹄疫病毒滅活抗原疫苗與前述的佐劑配伍 而成。本發明有如下優點本發明的豬口蹄疫苗用pIFN-Y-CpG的複合分子DNA新型 佐劑，其中既含有具有免疫刺激活性的未甲基化CpG基序，也含有可在動物細胞內表達的 IFN-Y基因，這保證了 PlFN-γ-CpG重組表達質粒可分別發揮其佐劑分子的各自功能—— 非特異性的免疫刺激作用，且使其二者通過協同作用發揮更有效的激起機體的免疫應答； 而且這種複合分子佐劑的重組表達質粒可在大腸桿菌等原核宿主菌中簡單易行地得到擴 增和大量提取，其製備成本較低；該方法製備的PlFN-γ-CpG DNA新型佐劑含量可達2. 5 4. Og/L,純度可達 1. 78 1. 85 (0D260/0D280)。pIFN- y -CpG重組質粒的複合分子DNA新型疫苗佐劑具有明顯的免疫增強效果 具體表現在(1)能增強小鼠抗口蹄疫滅活抗原免疫反應，同時具有較高的體液免疫和細胞 免疫即Thl反應。實驗表明，本發明用PlFN- γ和CpG基序複合分子的重組DNA質粒能誘 導顯著高於(p<0.01)pcDNA-CpG+Ag組(單一 CpG基序成分)的中和抗體水平，能夠促進 T淋巴細胞的增殖可達6. 28%顯著高於其它組(P < 0. 01)，而且能夠促進⑶8+T淋巴細胞 增殖可達31. 61%，與其它組相比差異極顯著(ρ <0.01)。(2)能明顯增強豬口蹄疫滅活 疫苗的免疫效果，其免疫後21天的抗體滴度可達144，是標準疫苗(普通商品疫苗)的2. 5 倍以上。(3)具有使用劑量小、毒性低的特性。20 μ g pIFN-γ-CpG DNA的小鼠免疫劑量可 達到比鋁膠、206佐劑標準劑量更好的免疫效果，在IOOOyg劑量也未發現對小鼠的毒副作 用。


圖1表明了 pcDNA-pIFN-Y-CpG重組質粒對豬口蹄疫病毒滅活抗原疫苗免疫小 鼠的抗體滴度增強效果。在圖1中TE代表接種不含抗原的疫苗稀釋液免疫組；Ag代表豬 亞洲I型口蹄疫滅活抗原疫苗組；pcDNA+Ag代表空質粒加抗原免疫組；pcDNA-CpG+Ag代表 pcDNA-CpG 重組質粒加抗原免疫組；pcDNA-pIFN- y -CpG+Ag 代表 pcDNA-pIFN- y -CpG 重組 質粒加抗原免疫組。縱軸代表阻斷ELISA法檢測的抗體滴度值，橫軸代表免疫後的天數。圖2是流式細胞儀檢測小鼠淋巴細胞增殖反應圖。以說明pcDNA-p IFN-γ-CpG 重組質粒對豬口蹄疫病毒滅活抗原免疫小鼠後增強脾淋巴細胞增殖效果。圖2中TE、Ag、 pcDNA+Ag, pcDNA-CpG+Ag、pcDNA-pIFN-γ-CpG+Ag 所代表試驗組與圖 1 的相同；ConA 代表 陽性對照組，縱軸代表小鼠脾淋巴細胞增殖的百分數，橫軸代表不同的試驗組別。圖3為小鼠體內特異性CTL活性檢測，檢測pcDNA-pIFN-Y-CpG重組質粒對豬口 蹄疫病毒滅活抗原疫苗免疫小鼠後增強體內特異性CTL殺傷反應。其組別與圖1相同，縱 軸代表體內脾細胞裂解的百分數，橫軸代表免疫的組別。圖4是小鼠IFN-Y的分泌水平，表明了本發明的pcDNA-pIFN-Y-CpG重組質粒對 豬口蹄疫病毒滅活抗原疫苗免疫小鼠後體內促進IFN-Y含量分泌情況。圖中mative代 表正常細胞組，positive代表利用PMA刺激的陽性對照這組，irrelevant代表與實驗不相
5關的蛋白BSA刺激細胞組，其它組別與圖3相同。橫坐標代表組別，縱坐標代表IFN-Y分 泌的含量。圖5小鼠IL-6的分泌水平，表明了本發明的pcDNA-pIFN- y -CpG重組質粒對豬 口蹄疫病毒滅活抗原的免疫小鼠後促進體內細胞因子含量IL-6的分泌。圖中mative， positive, irrelevant與圖4中代表的組別相同；橫坐標代表組別，縱坐標代表IL-6的含量。圖6為pcDNA-pIFN- y -CpG重組質粒對豬口蹄疫病毒滅活抗原疫苗免疫豬的 抗體滴度增強效果圖。圖中CPG/pc代表pcDNA-CpG質粒免疫組；pIFN-Y-CpG/pc代表 pcDNA-pIFN- y -CpG質粒免疫組；橫坐標代表免疫天數，縱坐標代表抗體的滴度。
具體實施例方式本發明以下結合實施例作進一步詳述含有豬Y-幹擾素基因(PlFN-Y)及人工篩選的CpG序列的重組質粒 pcDNA-pIFN- y -CpG 的構建1、PcDNA3. I-CPG-IFN-γ複合分子引物的合成根據所用載體的特性，依據已獲 得的PlFN-γ全基因序列(SEQ No 3)設計引物，用DNAStar軟體設計1對引物，並在不同 引物的序列前加酶切位點，引物如下ρIFN-γ 引物(SEQ No 5 和 SEQ No 6)上遊5 端CCC AAG CTT ACA ATG GGTTATACAACTACTTATTTCT Hid III下遊5 端G GAATTC TTATT TTGATG CTC TCT GGC CT EcoR I2PcDNA3. I-CpG重組質粒的構建CpG基序序列的重組複製人工合成的基本骨架由3個GTCGTT、2個GACGTT和1個 AACGTT 所構成的 CpG 基序，並其 5，端加入 EcoRI S卩(5，AATTCTCGTCGTTTGTCGTTTTGTCGTTT CGACGTTTGACGTTTAACGTTTC3，(SEQ No 1)同時合成其配對序列並在5，端加入Xhol部分鹼 基，採用控溫變性、復性技術使其成為雙鏈DNA;再經基因工程重組技術，將其定向克隆入 經EcoRI和Xhol雙酶切PcDNA3. 1載體，轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，用氨苄青黴素抗 性篩選陽性克隆，提取質粒測序鑑定，確認將含有CpG基序序列克隆到質粒載體中，及獲得 PcDNA-CpG重組質粒，其序列為SEQ No :2。SEQ No 2 -TCGTCGTTTGTCGTTTTGTCGTTTCGACGTTTGACGTTTAACGTTTC-3、3pcDNA-pIFN- y -CpG 重組質粒的構建3. IpIFN-Y基因片段擴增利用所設計的pIFN- γ引物，從先前構建的pGEM-T easy-pIFN- γ重組質粒上 克隆pIFN-γ基因片段，擴增體系為pGEM-T easy-pIFN-y 1 μ 1，上、下遊引物(50pmol/ μ 1) (SEQ No :5禾口 SEQ No :6)，各 1μ 1, IOXPCR buffer (Mg2+free) 5 μ l,25mM MgCl2 3 μ 1， 2. 5mM dNTP Mixture 2 μ 1，1 μ 1 (5U/ μ 1) Taq DNA 聚合酶，菌雙蒸水加至 50 μ 1。PCR 反應 條件為95°C預變性 5min 後，進行 35 個循環(94°C lmin,50°C 30s, 72°C 5min)，最後 72°C 延伸5min。擴增完成後，取PCR產物5 μ 1用1. 2%瓊脂糖凝膠(含0. 5 μ g/ml溴化乙錠， EB)電泳分析，擴增到一條大小約501bp的CPG片段，產物經DNA凝膠快速回收試劑盒純化回收，得到豬IFN-Y，即SEQ No :3οSEQNo ,3
ATGAGTTATACAACTTATTTCTTAGCTTTTCAGCTTTGCGTGACT45
TTGTGTTTTTCTGGCTCTTACTGCCAGGCGCCCTTTTTTAAAGAA90
ATAACGATCCTAAAGGACTATTTTAATGCAAGTACCTCAGATGTA135
CCTAATGGTGGACCTCTTTTCTTAGAAATTTTGAAGAATTGGAAA180
GAGGAGAGTGACAAAAAAATAATTCAGAGCCAAATTGTCTCCTTC225
TACTTCAAATTCTTTGAAATCTTCAAAGATAACCAGGCCATTCAA270
AGGAGCATGGATGTGATCAAGCAAGACATGTTTCAGAGGTTCCTA315
AATGGTAGCTCTGGGAAACTGAATGACTTCGAAAAGCTGATTAAA360
ATTCCGGTAGATAATCTGCAGATCCAGCGCAAAGCCATCAGTGAA405
CTCATCAAAGTGATGAATGATCTGTCACCAAGATCTAACCTAAGA450
AAGCGGAAGAGAAGTCAGACTATGTTCCAAGGCCAGAGAGCATCA495
AAATAA5013. 2PcDNA3. I-IFN- y -CPG 重組質粒的構建將含有CpG基序的PcDNA3. I-CpG重組質粒和pIFN- γ目的片段利用Hid III/ EcoRI雙酶切，用Agarose Gel DNA Extraction Kit回收後連接，連接體系同上，連接產物 轉入大腸桿菌JM109感受態細胞)。用氨苄青黴素抗性篩選陽性克隆，提取質粒測序鑑定， 確認將含有PlFN-γ序列克隆到PcDNA3. I-CPG質粒載體中，轉變為pIFN-γ-CpG DNA重組 質粒形式，其序列為SEQ No :4。SEQ No 4
ATGGGTTATACAACTTATTTCTTAGCTTTTCAGCTTTGCGTGACTTTGTGTTTTTCTGGC60
TCTTACTGCCAGGCGCCCTTTTTTAAAGAAATAACGATCCTAAAGGACTATTTTAATGCA120
AGTACCTCAGATGTACCTAATGGTGGACCTCTTTTCTTAGAAATTTTGAAGAATTGGAAA180
GAGGAGAGTGACAAAAAAATAATTCAGAGCCAAATTGTCTCCTTCTACTTCAAATTCTTT240
GAAATCTTCAAAGATAACCAGGCCATTCAAAGGAGCATGGATGTGATCAAGCAAGACATG300
TTTCAGAGGTTCCTAAATGGTAGCTCTGGGAAACTGAATGACTTCGAAAAGCTGATTAAA360
ATTCCGGTAGATAATCTGCAGATCCAGCGCAAAGCCATCAGTGAACTCATCAAAGTGATG420
AATGATCTGTCACCAAGATCTAACCTAAGAAAGCGGAAGAGAAGTCAGACTATGTTCCAA480
GGCCAGAGAGCATCAAAATAAGAATTCTCGTCGTTTGTCGTTTTGTCGTTTCGACGTTTG540
ACGTTTAACGTTTC554
4、pIFN- y -CpG DNA質粒的大量擴增、提取和純化
選擇高拷貝的陽性菌株，接種到IOOOml含氨苄的LB培養基中，在搖床中220rpm37°C培養12 14小時後，用SDS鹼裂解法大量提取重組質粒DNA。粗提取的質粒經5M冰
冷的LiCl分離後，其上清用等體積異丙醇沉澱，再用70%乙醇洗滌沉澱，離心除去上清；將 沉澱用含RNase的TE buffer溶解，室溫處理30分鐘後，再用酚氯仿抽提2次，2倍無水 乙醇沉澱離心；用Iml滅菌水溶解沉澱後，加入0. 5ml PEG-MgCl2溶液(30mM MgCl2中加入 40% PEG 8000)，充分混勻後放置15分鐘，13000rpm離心20分鐘，沉澱用70%的乙醇洗滌 2次，再用TE buffer或無菌水溶解沉澱，用核酸蛋白檢測儀測定其含量和純度，4°C保存備
7用。本發明的佐劑，由於原核大腸桿菌在DNA複製時沒有甲基化修飾功能，故外源的目的重 組表達質粒在複製增殖時不會被甲基化，而真核細胞的DNA複製時具有甲基化修飾功能， 因此，不能用真核細胞增殖目的質粒。由於在設計構建PcDNA-pIFN-Y-CpG DNA時，專門將 IFN-Y基因放在質粒啟動子的下遊、CpG序列的上遊，並在其序列末端加了表達終止密碼 子，使IFN- γ表達後，不再使下遊的序列表達，因此CpG序列不表達。5、pIFN- y -CpG DNA質粒新型佐劑的免疫增強效果與毒副作用試驗將經大量擴增、提取和純化所得的pIFN- y -CpG DNA質粒在小鼠、豬體上進行重要 疫病疫苗的配伍試驗，確定其免疫效應。1)將提取純化的pIFN- y -CpG DNA質粒100 μ g單獨作為亞洲I型口蹄疫滅活抗 原的佐劑，製備疫苗免疫小鼠，用間接血凝和液相阻斷ELISA法檢測其抗體滴度，並在加強 免疫後第4周處死小鼠，製備脾細胞，利用流式細胞儀檢測脾淋巴細胞增殖反應及CD4+和 CD8+細胞的變化，在加強免疫後第二周，利用流式細胞儀檢測體內CTL殺傷反應，其結果參 見圖1。圖1結果分析表明pIFN-Y-CpG DNA能增強小鼠抗亞洲I型口蹄疫抗原的體液免 疫和細胞免疫應答。實驗表明本發明的佐劑PlFN-γ-CpG DNA誘導的抗體水平較高，而且 由圖1還可見pcDNA-pIFN- y -CpG重組質粒免疫組的抗體滴度遠高於其它各組。本發明的pIFN- y -CPG DNA引起較強的T細胞的增殖情況和細胞毒T淋巴細胞反 應參見圖2和圖3。圖2表明pcDNA-pIFN- y -CpG+Ag組淋巴細胞增殖率顯著高於對照組和空質粒加 抗原組(P < 0. 05)。圖3表明pcDNA-pIFN- y -CpG+Ag組殺傷率為65. 42%而抗原組和pcDNA+Ag殺傷 率分別為20%、20. 01%差異極其顯著(ρ < 0. 01)，說明本發明的重組質粒作為佐劑能夠顯 著增強細胞免疫反應。由以上試驗表明，本發明用pIFN-γ和CpG基序複合分子的重組DNA質粒能誘導 顯著高於(P < 0. 01)pcDNA-CpG+Ag組(單一 CpG基序成分)的中和抗體水平，能夠促進T 淋巴細胞的增殖可達6. 28%顯著高於其它組(P < 0. 01)，而且能夠促進⑶8+T淋巴細胞增 殖可達31. 61%，與其它組相比差異極顯著(ρ < 0. 01)。由圖4可見pcDNA-pIFN- y -CpG組IFN- γ分泌水平顯著高於抗原組和 pcDNA+Ag (ρ < 0. 05)，其能夠促進該細胞因子的分泌。實驗還表明本發明的佐劑能夠促進細胞因子IL-6的分泌，參見圖5。圖5表明 pcDNA-pIFN- y -CpG組IFN- γ分泌水平顯著高於抗原組和pcDNA+Ag (ρ < 0. 05)，說明其能 夠促進該細胞因子的分泌。將提取純化的pIFN- y -CpG DNA質粒與豬Asia I型口蹄疫滅活抗原疫苗(普 通商品苗)配伍後共同免疫試驗豬，同時用該商品疫苗作為陽性標準疫苗，用間接血凝和 液相阻斷ELISA法檢測其抗體滴度，具體應用時以IOOyg質粒和100 μ 1疫苗配伍，用此 「疫苗」免疫後21天經檢測抗體滴度可達1 144，參見圖6，顯示出本發明的複合分子佐 劑有較強的免疫增強作用，表明本發明能明顯增強豬口蹄疫滅活疫苗的免疫效果，其免疫 後21天的抗體滴度可達144，是標準疫苗(普通商品疫苗)的2. 5倍以上。將提取純化的 pIFN-y-CpG DNA質粒按10、20、100、200、1000 μ g的劑量作為小鼠的免疫佐劑進行動物試 驗，發現該佐劑具有劑量小，毒性低等特性，即使在作用劑量為200 μ g至1000 μ g劑量也未發現對小鼠的毒副作用。這些試驗表明本發明具有使用劑量小、毒性低的特性。由圖6可 見pcDNA-pIFN- y -CpG重組質粒免疫組的抗體滴度遠高於其它各組，由此可知加有本發明 的佐劑的疫苗混合物，其免疫效果明顯優於其它各對照組。
權利要求
一種豬口蹄疫苗用的複合分子型佐劑，其特徵在於這種佐劑是由CpG基序和豬IFN γ基因克隆入真核表達載體構成的重組質粒。
2.權利要求1所述的一種豬口蹄疫苗用的複合分子型佐劑，其特徵在於CpG基序為至 少由3個GTCGTT、2個GACGTT和1個AACGTT特殊序列構成的一段基序，其序列為SEQ No 1，用其構建的PcDNA3. 1重組質粒，並在大腸桿菌中增殖。
3.權利要求2所述的一種豬口蹄疫苗用的複合分子型佐劑，其特徵是由CpG基序構建 的重組質粒，其序列為SEQ No :2。
4.權利要求3所述的一種豬口蹄疫苗用的複合分子型佐劑，其特徵在於所用的豬 IFN-y基因為含信號肽的序列，其序列為SEQ No :3，用其構建的PcDNA3. 1重組表達質粒， 使IFN-y基因處在啟動子的下遊、CpG序列的上遊，並能在哺乳動物細胞中表達。
5.權利要求2-4所述的一種豬口蹄疫苗用的複合分子型佐劑的製備方法，其特徵在於 人工設計、合成一段基本骨架由3個GTCGTT、2個GACGTT和1個AACGTT所構成的CpG基序 以及其配對序列，同時在其末端分別設計EcoRI和Xhol酶切位點的部分鹼基，並使其成為 雙鏈DNA，通過基因重組方法構建到經EcoRI和Xhol酶切的真核表達載體中，獲得含CpG基 序的重組質粒；然後利用豬IFN-y特異引物上遊引物5，端CCCAAGCTTACAATGGGTTATAC AACTACTTATTTCT Hid III ；下遊5，端GGAATTCTTATTTTGATGCTCTCTGGCCT EcoR I，以pGEM-T easy-pIFN-y重組質粒為模板克隆pIFN-y基因片段，擴增獲得豬IFN-Y基因，再分別將 含CpG基序的重組質粒和IFN- y基因經相應的酶切後連接，得到PcDNA-pIFN- y -Cp⑶NA 重組質粒。
6.根據權利要求4所述的一種豬口蹄疫苗用的複合分子型佐劑的製備方法，其特徵在 於構建的PcDNA-pIFN- y -CpG DNA重組質粒，先轉化大腸桿菌，用氨苄青黴素抗性篩選陽性 克隆，提取重組質粒測序鑑定後，選擇高拷貝的陽性菌株，接種到含氨苄的LB培養基中大 量增殖，擴增PcDNA-pIFN- y -CpG DNA重組質粒，用SDS鹼裂解法大量提取重組質粒DNA。
7.一種豬口蹄疫苗組合物，其特徵在於豬口蹄疫病毒滅活抗原疫苗與權利要求1至4 所述的任一佐劑配伍而成。
全文摘要
本發明涉及一種豬口蹄疫苗用的、由CpG基序和豬IFN-γ基因克隆入真核表達載體構成的佐劑及其製造方法，以及豬口蹄疫病毒滅活抗原疫苗與這種佐劑配伍而成豬口蹄疫苗組合物。本發明的這種複合分子型佐劑，其CpG基序為至少由3個GTCGTT、2個GACGTT和1個AACGTT特殊序列構成的一段基序，其序列為SEQ No1，用其構建的PcDNA3.1重組質粒，並在大腸桿菌中增殖。
文檔編號C12N15/117GK101954080SQ20101029746
公開日2011年1月26日 申請日期2010年9月21日 優先權日2010年9月21日
發明者房永祥, 才學鵬, 景志忠, 曾爽, 竇永喜, 蒙學蓮, 賈懷傑, 趙娜, 陳國華 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所