用於檢測環境中類雌激素化合物的雙雜交酵母以及生物測試方法

2023-06-04 20:16:01

專利名稱：用於檢測環境中類雌激素化合物的雙雜交酵母以及生物測試方法
技術領域：
本發明涉及一種用於4金測環境中類雌激素化合物的雙雜交酵母以及生物測試方法，具體的說是涉及一種利用酵母雙雜交技術獲得的包含重組雌激素受體基因的雙雜交酵母，以及利用該酵母來檢測環境中類雌激素化合物的生物測試方法。
背景技術：
環境中的內分泌幹擾物，亦被稱為環境激素，是指人類在生產、生活過程中釋放到環境中的某些有毒化學物質，它們與人體和動物體內的激素具有類似的化學結構，並能夠產生類似激素的作用。它們進入體內，擾亂了激素的正常分泌，使人和動物的生理過程發生紊亂，導致生殖、免疫等
功能發生障礙。環境中的內分泌幹擾物的幹擾效應包括雌激素幹擾效應、雄激素幹擾效應、甲狀腺激素幹擾效應等，特別是雌激素幹擾效應能夠對生物及人類生殖系統造成嚴重影響。儘管具有雌激素幹擾活性的化合物在環境中濃度極小，但是其一旦進入人體和動物體內，可以與特定的雌激素受體結合形成複合物，該複合物進一步結合到細胞核中的雌激素反應元件
(ERE),啟動/抑制下遊基因的表達，幹擾內分泌系統的正常功能。90年代對雌激素受體作用機制的研究進一步發現了雌激素受體的共激活因子
(coactor),並建立了新的受體作用理論(參見，Hong, H.， Kohlit, K.,Trivedit, A., Deborah, L.， Johnson, D丄.和Stallcup， M.R.， 1996， Natl. Acad.Sci. USA. 93:4948-4952)。該理論認為，雌激素(或者環境中類雌激素物質)與相應雌激素受體的配體結合區(LBD)結合後引起構象改變，進一步結合共激活因子，促進轉錄。
對環境中雌激素幹擾效應進行研究，通常採用化學分析和生物測試技術。化學分析需要高分辨色譜/高分辨質譜，除了分析費用高外，對儀器設備條件和人員素質有相當嚴格的要求。另外一種廣泛採用的是利用重組雌激素受體酵母菌(Yeast Estrogen Screen, YES)進行測試，這種測試利用的是重組雌激素受體及受體反應元件構建的單雜交酵母。單雜交酵母方法並未考慮到雌激素受體共激活因子的作用。而且目前國內所用的重組酵母菌抹幾乎都來自國外實驗室，基本上沒有國內實驗室進行菌林的構建工作。因此該重組菌種需要長期冷凍保存， 一旦菌種發生回復突變，性狀就很難回復。利用雙雜交酵母技術將雌激素受體基因或基因片段以及共激活因子基因片段同時導入酵母細胞則可以克服單雜交酵母的缺點，並與新的受體作用理論相一致。已經有證據表明基於新的受體作用理論建立的核受體雙雜交酵母系統更加接近哺乳動物內分泌系統的真實作用情況(參見，
Nishihara, T., Nishikawa, J., 2000, Journal of Health Science. 46 (4):282-298)。而且，通過實驗室直接構建酵母菌抹，能夠有效的控制回復突變的影響，測定環境化合物的雌激素幹擾效應時能夠得到更好的質量控制。
目前，通常採用報導基因的方法指示外界幹擾、如化合物暴露等對基因轉錄的影響。其中，LacZ就是一種常用的編碼(3"半乳糖苷酶的報導基因，其產物P-半乳糖苷酶具有強的酶催化活性，能夠與特定底物反應生成新的有色化合物，易於檢測。因此，通過簡單測定p-半乳糖苷酶的活性，就能夠表徵對基因轉錄的影響。

發明內容
本發明的目的在於克服已有技術使用重組雌激素受體基因單雜交酵母對類雌激素汙染物進行測定時由於缺乏受體共激活因子，因而不能模擬真核細胞真實情況，容易產生假陰性或是假陽性結果的缺陷，從而構建能夠同時表達雌激素受體和受體共激活因子的雙雜交酵母，並在此基礎上建立一種經濟高效的評價環境樣品對雌激素受體幹擾活性的生物測試方法。該檢測方法快速簡便，成本低廉，省時省力，應用廣泛，所需樣品量少，靈敏度高，能夠反映環境樣品中雌激素受體的誘導效應，並且通過標準曲線計算得到樣品中類雌激素汙染物的毒性當量值。
本發明是通過下述技術方案實現的
本發明提供一種用於檢測環境中類雌激素化合物的雙雜交酵母，該酵母包含pGBKT7-ER酵母表達質粒和pGAD424-GRIPl酵母表達質粒，其中所述pGBKT7-ER酵母表達質粒包含雌激素受體基因，所述pGAD424-GRIPl酵母表達質粒包含具有如SEQ ID No.2所示序列的雌激素受體共激活因子基因片段。具體而言，上述雌激素受體基因優選人雌激
6素受體基因或具有如SEQIDNo.l所示序列的人雌激素受體基因片段。所 述類雌激素化合物選自天然雌激素化合物、酚類及經過代謝轉換能夠形成 酚類的化合物、鄰苯二曱酸酯類化合物、有機氯農藥中的一種或幾種。
本發明提供的上述雙雜交酵母具體為一種釀酒酵母(&cc/2aramyces "mWj/m) ER-GRIP1，其已經於2007年12月27日在中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，北京市朝陽區大屯路中國科學 院微生物研究所，郵編100101 )進行了生物材料保藏，保藏編號為CGMCC No.2307。
本發明還提供一種用於檢測環境中類雌激素化合物的雙雜交酵母的 製備方法，其中包括以下步驟
(1 ) 構建包含雌激素受體基因的pGBKT7-ER酵母表達質粒；
(2 ) 純化包含具有如SEQ ID No.2所示序列的雌激素受體共激活因 子基因片段的pGAD424-GRIPl酵母表達質粒；
(3 ) 釆用上述兩種質粒構建雙雜交酵母ER-GRIP1;
(4) 篩選雙雜交酵母ER-GRIP1 。
上述方法中所述雌激素受體基因優選人雌激素受體基因或具有如 SEQ ID No.l所示序列的人雌激素受體基因片段。所述類雌激素化合物選 自天然雌激素化合物、酚類及經過代謝轉換能夠形成酚類的化合物、鄰苯 二曱酸酯類化合物、有機氯農藥中的一種或幾種。所述雙雜交酵母 ER-GRIP1具體為釀酒酵母(6""cc/2arawyc^ cem^y/"e ) ER-GRIP1， 其保 藏編號為CGMCCNo.2307。
在上述步驟(1 )中，包括設計雌激素受體配體結合域ERLBD的PCR 引物，在上、下遊引物的5'端分別引入EcoRI和BamHI單一酶切位點， 並且上遊引物Pl: 5'-TCGCCGGAATTCGCTGGAGACATGAGA-3';下遊 引物P2: 5'-TAACGCGGATCCTCAGACTGTGGCAGG-3';在上述步驟(3) 中，同時用pGBKT7-ER質粒和pGAD424-GRIPl質粒轉化進入釀酒酵母 細胞Y187 ( Sacc/zaramycay cewWw'ae);在上述步驟(4 )中，採用營養缺 陷型篩選和菌落轉移濾膜分析相結合的方法篩選雙雜交酵母。其中，優選 釆用添加雌激素的X-gal緩沖液的菌落轉移濾膜分析，所述雌激素例如 17p-雌二醇；所述X-gal緩沖液為20mg . m1/1 5-溴-4-氯-3-吲哚-13-D-半 乳糖苷的二曱基曱醯胺溶液。所述營養缺陷型篩選中採用的培養基為
SD/-Trp/-Leu,其中包含20 mg . L"腺嘌呤半硫酸鹽，20 mg . L"鹽酸精氨酸，20 mg . L"—水合鹽酸組氨酸，30 mg . L"異亮氨酸，30 mg . L" 鹽酸賴氨酸，20 mg L"曱疏氨酸，50 mg L"苯丙氨酸，200 mg L"蘇 氨酸，30 mg .L"酪氨酸，20 mg丄"尿嘧啶，150 mg 'L"纈氨酸，6.7g -I/1 無胺基酸酵母氮源。
具體而言，在上述方法中，在構建pGBKT7-ER酵母表達質粒時，首 先設計出人雌激素受體配體結合域(hER LBD)的PCR引物，並在上下 遊引物的5'端分別引入EcoR I和BamH I單一酶切位點；以含有hERLBD (SEQIDNo,l所示序列)的pASV3質粒(由英國Nottingham大學Heery 教授惠贈。參見，Pierrat, B.， Heery， D.M., 1992， Gene. 119 (2): 237-245 )作 為模板進行PCR擴增；PCR產物用T4 DNA連接酶連接於T-載體，構建 的T-hER LBD質粒；將pGBKT7(購自Clontech公司)和T-hER LBD質粒 分別用EcoR I和BamH I雙酶切，酶切產物通過瓊脂津唐凝月交電泳分析後切 膠回收，pGBKT7和hER LBD插入片段的回收產物採用T4 DNA連接酶 連接，構建pGBKT7-hER酵母表達質粒。
具體而言，在上述方法中，純化pGAD424-GRIPl酵母表達質粒時， 用pGAD424-GRIP1(美國加州大學Stallcup教授惠贈。參見，Li, H.W.， Kim, J.H.， Koh， S.S., Stallcup, M.R. 2003. J. Biol. Chem. Biol. 279(6):4212—4220.) 轉化感受態大腸桿菌，在含有氨節青黴素的培養基中篩選陽性克隆，提取 質粒並純化。
具體而言，在上述方法中，構建雙雜交酵母ER-GRIP1時，同時加入 pGBKT7-hER質粒和pGAD424-GRIP 1質粒混合均勻，並加入感受態釀酒 酵母細胞Y187 ( Sacc/wra^ycas cerev/w'fle )孵育，得到雙雜交酵母 hER-GRIPl。
具體而言，在上述方法中，篩選雙雜交酵母ER-GRIP1時，採用營養 缺陷型篩選和菌落轉移濾膜分析相結合的方法篩選雙雜交酵母，雙雜交酵 母通過營養缺陷型培養基(SD/-Trp/-Leu )粗篩出陽性菌落，進一步使用 菌落轉移濾膜分析方法，將菌落影印到無菌的1#乾燥濾膜上，液氮反覆 凍融，破碎細胞；將1 #濾膜置於含雌激素的X-gal緩沖液的2#濾膜上， 30。C孵育至出現明顯藍色菌落，將顯色菌落繼續培養備用。
本發明還提供一種^r測環境中類雌激素化合物的生物測試方法，其中 包括如下步驟將上述雙雜交酵母細胞與待測樣品共培養，加入鄰硝基苯 -P-D-吡喃半乳糖苷的反應液進行反應，根據終止反應後檢測到的上清液在420nm處的吸光度值來計算類雌激素化合物的濃度。 上述方法具體包括如下步驟 (1 ) 培養雙雜交酵母ER-GRIP1細胞；
(2) 繪製誘導標準曲線首先將上述雙雜交酵母細胞分別與已知系 列濃度雌激素共培養，加入鄰硝基苯-卩-D-吡喃半乳糖苷反應液進行反應， 終止反應後4企測上清液在420nm處的吸光度值，並以此作為表示p-半乳糖 苷酶活性的參數，繪製系列雌激素濃度相對雙雜交酵母ER-GRIP1細胞的 p-半乳糖苷酶活性誘導的劑量-效應關係標準曲線；
(3) 檢測樣品將上述雙雜交酵母細胞與待測樣品共培養，加入鄰 硝基苯-J3-D-吡喃半乳糖苷的反應液進行反應，終止反應後檢測上清液在 420nm處的吸光度值，對照步驟(2)制定的標準曲線計算出樣品中類雌 激素化合物的含量。
對於上述生物測試方法而言，在步驟(1 )中，將ER-GRIP1細胞接種 時調節菌液600nm處的吸光度值為0.1-0.2, 30。C培養24h後調整菌液 600nm處的吸光度值為0.7 ~ 0.8準備進行測試；所述待測樣品為有機溶劑 提取液，其中雌激素當量濃度為1(T11 10-"moH/;所述類雌激素化合物 選自天然雌激素化合物、酚類及經過代謝轉換能夠形成酚類化合物、鄰苯 二曱酸酯類化合物、有機氯農藥中的一種或幾種。所述雙雜交酵母 ER-GRIP1具體為釀酒酵母(5bcc/^ra^yce;y cwev/wV e) ER-GRIP1,其保 藏編號為CGMCCNo.2307。
具體而言，在上述4企測環境中類雌激素化合物的生物測試方法中，雙 雜交酵母ER-GRIP1細胞的培養方法為將上述重組基因酵母hER-GRIPl 的細胞接種到SD/-Trp/-Leu液體培養基中，檢測菌液600nm處的吸光度值 為0.1 ~ 0.2， 3(TC培養24h後調整酵母菌液600nm處的吸光度值為0.7 ~ 0.8。
繪製誘導標準曲線具體步驟為將17P-雌二醇溶解到二曱基亞碸 (DMSO)中，製備一系列的17 |3-雌二醇標準濃度反應液(濃度範圍 2xl(T12~2xlO-6mol/L)，按照0.5%的比例添加17 P-雌二醇標準濃度反應 液到hER-GRIPl酵母菌液中，製備暴露液；將暴露液接種至96孔板中 (200)iL/孔)；3(TC培養2h後檢測600nm處的吸光度值；再將含有過量鄰 硝基苯-P-D-吡喃半乳糖苷的反應液加入到96孔板中；30。C下充分反應 後，添加1 mol . L"的碳酸鈉溶液終止反應；在420nm處用分光光度計檢測終產物鄰硝基酚鈉的吸光度值，並以此作為表示(3 -半乳糖香酶的參數， 繪製E2 (即雌二醇)對重組基因酵母hER-GRIPl細胞的P -半乳糖苷酶活 性誘導的劑量-效應關係標準曲線。
13-半乳糖苷酶活性u的計算公式如下u = (As-AB)/t .V .D 'ODs， 式中，u為P-半乳糖苷酶活性；t為反應時間(min); V為測試體積(mL); D為稀釋因子；ODs為測試樣品在595nm處的吸光度值；As為測試樣品 在420nm處的吸光度值OD42。； AB為空白對照在420nm處的吸光度。
上述檢測樣品的具體步驟為按照0.5%的比例添加二曱基亞碸 (DMSO)溶解的待測樣品到hER-GRIPl酵母菌液中，製備暴露液；暴露 液接種至96孔板中(200juL/孔)；30。C培養2h後檢測600nm處的吸光度 值；再將含有過量鄰硝基苯-p-D-吡喃半乳糖苷的反應液加入到96孔板 中；30。C下充分反應後，添加lmol L"的碳酸鈉溶液終止反應；在420nm 處用分光光度計;險測終產物鄰硝基酚鈉的吸光度值，來檢測待測化合物是 否具有雌激素受體誘導活性，即將測得的結果與上述標準曲線比較，進而 可以計算出環境樣品中類雌激素化合物的含量，從而評價環境中類雌激素 化合物的毒性效應。
本發明提供的用於檢測環境樣品中類雌激素化合物的雙雜交酵母以 及生物檢測方法的優益之處在於1 ) ER-GRIP1雙雜交酵母細胞能夠同時 表達雌激素受體蛋白、雌激素受體共激活因子蛋白，支持最新的受體作用 理論，最能模擬哺乳動物細胞內雌激素受體的作用機制，且表達基因產生 的卩-半乳糖香酶的酶活性易於檢測，很適合作為化合物毒性篩選、環境樣 品類雌激素效應評價方面的試驗研究；2)酵母細胞試驗快速、簡便可以 對大量環境樣品或化學物質的內分泌幹擾物效應進行前期篩選，為活體試 驗提供基礎數據支持，彌補了活體試驗試驗周期長，費用高的不足；3) 添加17p-雌二醇(lxl(T1(} mol.L")的X-gal緩衝液在菌落轉移濾膜分析中 的應用，大大的縮短了操作時間，相當程度上減輕了假陽性結果乾擾的可 能性；4)利用SD/-Trp/-Leu營養缺陷型培養基進行酵母培養，能夠有效 防止重組酵母細胞的回覆突變，減輕傳代過程中質粒丟失的情況，使得重 組酵母細胞的蛋白表達穩定，試驗測試結果之間的平行性較好；5)利用 重組雌激素受體基因雙雜交酵母進行類雌激素汙染物的篩選和毒性毒理 研究時，操作筒便，省時省力，所需樣品量少，成本低廉；6)本發明克 隆了人的雌激素受體基因，能夠反映環境樣品中的類雌激素化合物可能對人體產生的影響；7 )與Nishihara文獻才艮道克隆鼠的雌激素受體不同的是， 本發明直接複製人的雌激素受體基因或基因片段構建雙雜交酵母，因此在 測定環境化合物的雌激素幹擾效應時能夠直接體外預警化合物對人體內 分泌系統可能存在的風險。在技術上採用了更先進的pGBKT7酵母表達質 粒和釀酒酵母菌抹Y187( 5Wcc/zaram;;cM )，使得構建的ER-GRIP1
菌抹具有更高的靈敏度，其ECs。值為YJxlO-Umol.L-1,而Nishihara報導 為〉3xl0^mol'L—1。


以下，結合附圖來詳細說明本發明，其中
圖1為17卩-雌二醇對重組釀酒酵母ER-GRIP 1 ( CGMCC No.2307 )酶 活性誘導的劑量-效應關係標準曲線。其中橫坐標是17P-雌二醇濃度，縱 坐標是17(3-雌二醇誘導的p-半乳糖苷酶活性；
圖2為利用化學分析、單雜交重組雌激素受體基因酵母和雙雜交重組 釀酒酵母ER-GRIP1 ( CGMCC No.2307 )三種方法測試環境樣品類雌激素 效應的結果；其中橫坐標是化學分析結果，縱坐標是單雜交重組雌激素受 體基因酵母和雙雜交重組釀酒酵母ER-GRIP1 ( CGMCC No.2307 )方法的 測試結果；其中令表示雙雜交酵母細胞抹(釀酒酵母ER-GRIP1 (CGMCC No.2307));圓表示單雜交酵母細胞抹；EEQ表示17(3-雌二醇當量濃度 (pg.L"); YES表示酵母檢測方法。
具體實施例方式
本發明提供的釀酒酵母(Sacc/zaram;;c" ) ER國GRIP1已經於
2007年12月27日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC,北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，郵編100101) 進行了生物材料保藏，保藏編號為CGMCC No.2307。以下結合實施例具 體說明釀酒酵母ER-GRIP1 ( CGMCC No.2307 )的製備及其在檢測環境中 類雌激素化合物的生物測試方法中的應用。
實施例1:釀酒酵母ER-GRIP1 ( CGMCC No.2307 )細胞的製備
1.構建包含雌激素受體基因片段(即SEQ ID No.l所示序列)的 pGBKT7-hER酵母表達質粒。
首先設計出雌激素受體配體結合域(hER LBD)的PCR引物，並在上下遊引物的5'端分別引入EcoRI和BamHI單一酶切位點，即上遊引物 Pl: 5'-TCGCCGGAATTCGCTGGAGACATGAGA-3'(下劃線部分為EcoR
I 的酶切位點)；下遊引物 P2 : 5'-TAACGCGGATCC TCAGACTGTGGCAGG-3'(下劃線部分為BamHI的酶切位點)；以含有 hER LBD ( SEQ ID No.l所示序列)的pASV3質粒(由英國Nottingham 大學Heery教授惠贈)2.5ng作為模板進行PCR擴增；PCR產物(0.3pmo1) 用T4 DNA連接酵(1mL)連接於t-載體，構建的T-hER LBD質粒；將 pGBKT7( lpg,購自Clontech公司)和T-hER LBD (lpg)質粒分別用EcoR
I (lpL)和BamH I (l)LiL)雙酶切，酶切產物通過0.8 %瓊脂並唐凝月交電泳分析 後切膠回收，pGBKT7(0.03pmol)和hER LBD插入片段(0.3pmol)的回收產 物採用T4 DNA連接酶(liiiL)連接，構建pGBKT7-hER酵母表達質粒。對 質粒DNA進行序列測定，測序引物為 5'-TTTTCGTTTTAAAACCTAAGAGTC畫3'。
2. 純化包含雌激素受體共激活因子基因片段(即SEQ ID No.2所示序 列)的pGAD424-GRIPl酵母表達質粒。
用lO(iL靶質粒pGAD424-GRIPl (美國加州大學Stallcup教授惠贈) 轉化lOOiiL感受態大腸桿菌DH5a，在含有氨千青黴素的培養基中篩選陽 性克隆，提取質粒並純化。0.8。/。瓊脂糖凝膠電泳鑑定質粒DNA大小，同 時對質粒DNA進行序列測定，測序引物為pGAD424通用引物(測序工作 由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成)。所述含有氨節青黴素的培養 基包含100mg . L"氨爺青黴素，10g . L"胰蛋白腖，5g . L"酵母提取物， 10g L'1 NaCl， 15g . I/1瓊脂糖。
3. 構建雙雜交的釀酒酵母ER-GRIP1 ( CGMCC No.2307 )。
同時加入0.1|ig pGBKT7-hER質粒和O.lpg pGAD424-GRIPl質粒混合 均勻，並加入O.lmL新鮮製備的感受態釀酒酵母細胞Y187( Sacc/zaramyc" cerev/w'ae), 200rpm, 30。C孵育30min。加入70|iL 二曱基亞碸(DMSO ) 混合均勻後，42。C水浴放置15min;細胞迅速轉移到冰浴，靜置l-2min， 構建雙雜交的釀酒酵母ER-GRIP1 ( CGMCC No.2307 )。
4. 篩選雙雜交的釀酒酵母ER-GRIP1 ( CGMCC No.2307 )。 在上述方法中，篩選雙雜交的釀酒酵母ER-GRIP1 ( CGMCC No.2307 )
時，採用營養缺陷型篩選和菌落轉移濾膜分析相結合的方法篩選雙雜交酵 母，雙雜交酵母通過營養缺陷型培養基(SD/-Trp/-Leu )粗篩出陽性菌落，
12進一步使用菌落轉移濾膜分析方法，將菌落影印到無菌的1 #乾燥濾膜上，
液氮反覆凍融3 ~ 5次，破碎細胞；將1 #濾膜置於含17 |3 -雌二醇(1 x l(T1Gmol L")的X-gal緩沖液的2#濾膜上，30。C孵育直到克隆出現明顯 的藍色。顯色的菌落即為陽性菌落，陽性菌落繼續培養24h後備用。所述 SDATrpALeu包含20 mg . L"腺嘌呤半硫酸鹽，20 mg . I/1鹽酸精氨酸， 20 mg . L" —水合鹽酸組氨酸，30 mg L"異亮氨酸，30 mg . L"鹽酸賴 氨酸，20 mg . L"曱碌b氨酸，50 mg L"苯丙氨酸，200 mg U1蘇氨酸， 30 mg ' L-1酪氨酸，20 mg L-1尿嘧咬，150 mg L-1纈氨酸，6.7g L-1無 胺基酸酵母氮源；X-gal緩衝液為20mg . mL" 5-溴-4-氯-3-吲哚-13-D-半乳 糖苷的二曱基曱醯胺溶液。
實施例2:利用雙雜交的釀酒酵母ER-GRIP1 ( CGMCC No.2307 )測 定17(3-雌二醇(E2)的效應來繪製標準曲線。
酵母細胞培養將製備的雙雜交的釀酒酵母ER-GRIP1 (CGMCC No.2307)細胞接種到SD/-Trp/-Leu液體培養基(組成與實施例1中相同) 中，檢測菌液600nm處的吸光度值(以培養基為空白)，調節吸光度值為 0.1 ~ 0.2， 30。C空氣浴搖床中培養24h後調整菌液600nm處的吸光度值為 0.7-0.8。
繪製標準曲線取菌懸液0.995mL至對應的Eppendorf管中，加入5^L DMSO (空白)或5pL用DMSO溶解的E2;將以上溶液各200iiL依次轉 移到96孔板中。然後於130rpm, 30°C於96孔板搖床振蕩培養2h;培養 結束後，首先檢測600nm處的吸光度值；去除150jliL酵母菌液；加入120pL 測試緩衝液(每lOOmL基礎緩衝液中加入3.33mL濃度為0.1%的SDS溶 液和270pL P-巰基乙醇)和20pL氯仿，在30。C的恆溫搖床上預培養lOmin; 再加入40pL鄰硝基苯-P-D-吡喃半乳糖苷的反應液(0.04g'L"),啟動酶反 應，隨著進一步的培養，可以逐漸看到培養液呈現越來越強的黃色；30°C 下充分反應後(對於17P-雌二醇來說，這樣的過程約需要20min)，添加 100|xL碳酸鈉溶液(1 mol.L")終止反應；取200pL上清液在420nm處用 分光光度計檢測終產物鄰硝基酚鈉的吸光度值，並以此作為表示P-半乳糖 苷酶的參數，繪製E2對重組基因釀酒酵母ER-GRIP1 ( CGMCC No.2307 ) 細胞的P-半乳糖苷酶活性誘導的劑量-效應關係標準曲線(圖1)。
卩-半乳糖苷酶活性u的計算公式如下u = (As-AB)/t'V'DODs,式中，u為p-半乳糖苷酶活性；t為反應時間(min); V為測試體積(mL); D 為稀釋因子；0DS為測試樣品595nm處的吸光度值；As為測試樣品在 420nm處的吸光度值OD42Q; As為空白對照在420nm處的吸光度。
上述含有過量鄰硝基苯-13 -D-吡喃半乳糖香的反應液包含21.51g .L-1 Na2HP04 12H20, 6.22g L-1 NaH2P04 . 2H20, 0.75g L"KC1， 0.25g I/1 MgS04 ' 7H20, 0.04g . L"鄰硝基苯-P-D-吡喃半乳糖苦。
由圖1可知，E2對雙雜交的釀酒酵母ER-GRIP1 ( CGMCC No.2307 ) 細胞P-半乳糖苷酶活性誘導的劑量-效應關係標準曲線的ECs。值為 7.3xl(TUmol丄'1,在2xl0-n-2xl(r" mol丄"範圍內存在線性關係；與國 際報導的E2在重組酵母系統中EQo為lxlO-u 3xl(rViol.L"之間的結果 相符，說明本發明製備的雙雜交酵母對於E2的敏感性與報導的其它方法建 立的系統相近，初步表明雙雜交雌激素受體基因酵母測評體系可以作為環 境中類雌激素化合物的毒性效應的定量分析標準。
實施例3:利用雙雜交的釀酒酵母ER-GRIP1 ( CGMCC No.2307)生 物測試方法評價環境樣品的類雌激素汙染物毒性。
分別採集某市不同水廠進水、出水作為樣品。釆用固相萃取的方法， 加入二氯甲烷、正己烷提取樣品中的類雌激素汙染物，將提取到的有機溶 劑在高純氮氣中吹乾，加入DMSO溶解並製備成在標準曲線線性範圍內任 一濃度的測試用樣品溶液。
利用實施例1中所述的雙雜交的釀酒酵母ER-GRIP1 (CGMCC No.2307)生物測試方法評價環境樣品的類雌激素汙染物毒性，測定結果 與單雜交重組雌激素受體基因酵母方法、質譜分析方法的測定結果進行了 比較，見圖2。
從圖2可以看出，無論是單雜交酵母細胞和雙雜交酵母細胞生物測試， 所得到的結果與質譜分析類雌激素汙染物的毒性當量之間有很好的相關 關係。雙雜交酵母細胞生物測試結果更接近化學分析(即質i普分析)，而 且和國際上目前通常採用的單雜交重組基因酵母細胞測試方法有很好的 可比性。圖2的結果表示可以用本發明提出的方法，判斷環境樣品中類雌 激素汙染物的毒性當量或其潛在生態毒性的大小。序列表
SEQ ID No.l
中國科學院生態環境研究中心
用於檢測環境中類雌激素化合物的雙雜交酵母以及生物測試方法 DIC07110101 2
Patentln version 3.3
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942
DNA
人
1
gctggagaca tgagagctgc caacctttgg ccaagcccgc tcatgatcaa acgctctaag 60
aagaacagcc tggccttgtc cctgacggcc gaccagatgg tcagtgcctt gttggatgct 120
gagcccccca tactctattc cgagtatgat cctaccagac ccttcagtga agcttcgatg 180
atgggcttac tgaccaacct ggcagacagg gagctggttc acatgatcaa ctgggcgaag 240
agggtgccag gctttgtgga tttgaccctc catgatc鄉tccaccttct agaatgtgcc 300
tggctagaga tcctgatgat tggtctcgtc tggcgctcca tggagcaccc agggaagcta 360
ctgtttgctc ctaacttgct cttggacagg aaccagggaa aatgtgtaga gggcatggtg 420gagatcttcg acatgctgct ggctacatca tctcggttcc gcatgatgaa tctgcaggga 480
gaggagtttg tgtgcctcaa atctattatt ttgcttaatt ctggagtgta cacatttctg 540
tccagcaccc tgaagtctct ggaagagaag gaccatatcc accgagtcct ggacaagatc 600
acagacactt tgatccacct gatggccaag gcaggcctga ccctgcagca gcagcaccag 660
cggctggccc agctcctcct catcctctcc cacatcaggc acatgagtaa caaaggcatg 720
gagcatctgt acagcatgaa gtgcaagaac gtggtgcccc tctatgacct gctgctggag 780
atgctggacg cccaccgcct acatgcgccc actagccgtg gaggggcatc cgtggaggag 840
acggaccaaa gccacttggc cactgcgggc tctacttcat cgcattcctt gcaaaagtat 900
tacatcacgg gggaggcaga gggtttccct gccacggtct ga 942
SEQ ID No.2 2 4374 <212〉 DNA 鼠
2
ggagaaaaca cctctgaccc gtccagggca gagaccagaa aacgcaagga atgtcccgac 60
cagctcggac ccagccccaa aaggagcact gagaaaegga accgcgagca ggagaataag 120
tacatagagg agctggccga tctgatcttc gcaaacttta atgatattga caacttcaac 180
ttcaaacctg acaaatgtgc catcctaaaa gaaactgtga agcagatccg ccagatcaaa 240gagcaagaga aagcagcagc tgccaacata gatgaagtgc agaagtcaga tgtgtcgtcc
acggggcagg gtgtcatcga caaggatgca ctggggccca tgatgcttga ggccctcgat
gggttcttct tcgttgtgaa cctggaaggc agtgtggtgt tcgtgtcaga gaatgtgaca
cagtatctac ggtataacea agaagagctg atgaacaaga gtgtctacag catcctgcat
gtcggggacc acactgaatt tgtcaagaac ctgctgccaa agtccatggt gaatggagga
tcctggtctg gagaacctcc caggcggacg agccatacct tcaactgtcg catgctggtg
aagcctttgc cagattcaga agaggaaggc catgatagcc aggaagccca tcagaaatac
gaggcgatgc agtgcttcgc tgtgtctcag cccaagtcca tcaaagagga aggcgaagat
ttgcagtcct gcttgatttg tgtggcacga agagtcccca tgaaggaaag accaactctt
ccctcatcag aaagctttac cacccgccag gacctccaag gcaagatcac ttcactggac
actagcacca tgagagccgc catgaagccg ggctgggaag atctggtaag aagatgcatt
cagaagttcc acacacagca tgaaggggag tctctatcat atgccaagag gcatcaccat
gaagttctga gacaagggtt ggcgttcagt cagatctatc gtttttcttt gtctgatggc
actctcgttg ctgcacaaac caagagcaaa ctcatccgtt ctcagactac taatgagcct
cagcttgtaa tatctttaca catgcttcac agagagcaga atgtatgtgt aatgaatccg
gatctgactg gacaagcgat ggggaagcca ttgaatccaa ttagctctag cagccctgcc
300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 卯O 960 1020 1080 1140 1200caccaggccc tgtgcagtgg gaacccaggt caggacatga ccctcggtag caatataaat 1260
tttcccatga atggcccaaa ggaacaaatg ggcatgccta tgggcaggtt tggtggttct 1320
gggggcatga accatgtgtc aggcatgcag gcaaccactc ctcagggtag taactatgca 1380
ctcaaaatga acagtccctc gcaaagcagc cccggcatga acccggggca agccagctcc 1440
gtgctctccc caaggcagcg catgagcccc ggcgtggctg gcagtcctcg catcccaccc 1500
agtcagtttt cccctgcagg aagcttgcat tcccctgtgg gagtttgcag cagcacagga 1560
aatagccata gttataccaa cagttccctc aatgcactgc aagccctcag cgagggccat 1620
ggggtctcac tcgggtcctc gctggcttca ccggacctaa aaatgggcaa tttgcaaaac 1680
tccccagtta atatgaatcc tcccccactc agcaagatgg gaagcttgga ctccaaagac 1740
tgttttggac tttatgggga gccctcagaa ggtacaactg gacaagcaga ggccagctgc 1800
catcctgaag aacaaaaggg gcccaatgat tccagcatgc cccaggcggc cagcggggac 1860
agggctgagg gacacagccg gctgcatgac agcaaagggc agaccaaact cctgcagctg 1920
ctgaccacca agtccgacca gatggagcct tcacccttgc ccagctcctt gtcggacaca 1980
aacaaggact caacagggag cttgcctggg cctgggtcca cgcatggcac ctcgctcaag 2040
gagaagcata agattttgca cagactctta caggacagca gttcccctgt ggacttggcc 2100
aagctgacag cagaagccac aggcaaagag ctgagccagg agtccagcag cacagctcct 2160gggtcggaag tgactgtcaa acaggagcca gcgagcccca agaagaaaga gaatgcacta 2220 ctgcgctatt tgctcgacaa agatgatact aaagatattg gtttaccgga aataaccccc 2280 aaactcgagc gactggacag taagacagat cctgccagta acacaaagtt aattgctatg 2340 aaaactgtga aggaggaggt gagctttgag cccagtgacc agcctggcag cgagctggac 2400 aacttggaag agattttgga tgatttgcag aacagtcagt taccacagct tttcccagac 2460 acaaggccag gagctcctac tgggtcagtt gacaagcaag ccatcatcaa tgacctcatg 2520
caactcacag ctgacagcag tcccgtccca cctgccggag cccagaaggc agcactgcgc 2580
atgtcacaga gcacttttaa taacccacga ccagggcaac tgggcaggtt attgccaaac 2640
cagaacttac cacttgacat cactttgcaa agcccaactg gtgctggacc tttcccacca 2700
atcagaaaca gtagccccta ctcagtgata cctcagccag gaatgatggg taaccaaggg 2760
atgctaggaa gccaaggaaa cttagggaac aatagcacag gaatgattgg cagcagcact 2820
tcccggccca gcatgccttc tggggaatgg gcaccacaga gtccagctgt gagagtcact 2880
tgtgctgcta ccactggtgc catgaaccga ccagtccaag gaggcatgat tcggaaccca 2940
acagccagca tccccatgcg agccaacagc cagcctggcc aaagacagat gcttcagtct 3000
caggtcatga acataggccc ttctgagtta gagatgaaca tgggaggacc tcagtataat 3060
caacagcagg cccctccgaa ccaaactgcc ccgtggcctg agagcatcct gcctatagac 3120formula see original document page 20ttctcacagc agtccccacc acactttggg caacaagcaa acaccagcat gtatagtaac 4140
aacatgaaca tcagtgtgtc gatggcaacc aacacgggtg gcttgagcag catgaaccag 4200
atgacatgcc agatgagcat gacctcagtg acctccgtgc ctacgtcagg actgccctcc 4260
atgggtcccg agcaggtcaa tgaccctgct ctgaggggag gcaacctttt cccaaaccaa 4320
ctgcctggaa tggacatgat caagcaggag ggagatgcat ctcggaaata ctgc 437權利要求
1. 一種用於檢測環境樣品中類雌激素化合物的雙雜交酵母，其特徵在於，該酵母中含有pGBKT7-ER酵母表達質粒和pGAD424-GRIP1酵母表達質粒，其中所述pGBKT7-ER酵母表達質粒包含雌激素受體基因，pGAD424-GRIP1酵母表達質粒包含具有如SEQ ID No.2所示序列的雌激素受體共激活因子基因片段。
2. 根據權利要求1所述的雙雜交酵母，其特徵在於，所述雌激素受體 基因為人雌激素受體基因或具有如SEQIDNo.l所示序列的人雌激素受體 基因片段。
3. 根據權利要求1或2所述的雙雜交酵母，其特徵在於，所述類雌激 素化合物選自天然雌激素化合物、酚類及經過代謝轉換能夠形成酚類的化 合物、鄰苯二曱酸酯類化合物、有機氯農藥中的一種或幾種。
4. 根據權利要求1至3中任一項所述的雙雜交酵母，其特徵在於，所 述只又雜交酵母為酉良酒酵母(iSacc/2"ramyc&s c^ev^/ae )ER-GRIP1,其保藏 編號為CGMCCNo.2307。
5. —種根據權利要求1至4中任一項所述的雙雜交酵母的製備方法， 其特徵在於，該方法包括以下步驟(1) 構建包含所述雌激素受體基因的pGBKT7-ER酵母表達質粒；(2) 純化包含所述雌激素受體共激活因子基因的pGAD424-GRIPl 酵母表達質粒；(3 ) 採用上述兩種質粒構建雙雜交酵母ER-GRIP1; (4 ) 篩選雙雜交酵母ER-GRIP1 。
6. 根據權利要求5所述的製備方法，其特徵在於，步驟(1)包括設 計雌激素受體配體結合域ER LBD的PCR引物，其中在上、下遊引物的 5'端分別引入EcoR I和BamH I單一酶切位點，並且上遊引物Pl: 5'-TCGCCGGAATTCGCTGGAGACATGAGA-3';下遊引物 P2 : 5'-TAACGCGGATCC TCAGACTGTGGCAGG-3'。
7. 根據權利要求5或6所述的製備方法，其特徵在於，在步驟(3) 中同時用pGBKT7-ER質粒和pGAD424-GRIPl質粒轉化進入釀酒酵母細 胞Y187 (iSacc/^ra附7ees cerev/57'"e )。
8. 根據權利要求5至7中任一項所述的製備方法，其特徵在於，在步驟(4)中採用營養缺陷型篩選和菌落轉移濾膜分析相結合的方法篩選所述雙雜交酵母。
9. 根據權利要求8所述的製備方法，其特徵在於，在步驟(4)中採 用添加雌激素的X-gal緩沖液的菌落轉移濾膜分析。
10. 根據權利要求9所述的製備方法，其特徵在於，所述雌激素為17卩-雌二醇。
11. 根據權利要求9所述的製備方法，其特徵在於，所述X-gal緩衝 液為20mg mL"5-溴-4-氯-3-吲。呆-(3-D-半乳糖苷的二甲基甲醯胺溶液。
12. 根據權利要求8所述的製備方法，其特徵在於，所述營養缺陷型 篩選中釆用的培養基為不添加色氨酸和亮氨酸的SD培養基，其中包含20 mg . L"腺噪呤半硫酸鹽，20 mg . L"鹽酸精氨酸，20 mg . L"—水合鹽酸 組氨酸，30 mg . L"異亮氨酸，30 mg . L"鹽酸賴氨酸，20 mg L"曱碌u 氨酸，50mg L"苯丙氨酸，200mg L"蘇氨酸，30mg'L"酪氨酸，20 mg.L"尿嘧咬，150mg . L"纈氨酸，6.7g L"無胺基酸酵母氮源。
13. —種檢測環境中類雌激素化合物的生物測試方法，其特徵在於， 該方法包括如下步驟將權利要求1至4中任一項所述的雙雜交酵母細胞 與待測樣品共培養，加入鄰硝基苯-P-D-吡喃半乳糖苦的反應液進行反應， 根據終止反應後檢測到的上清液在420nm處的吸光度值來計算類雌激素 化合物的濃度。
14. 根據權利要求13所述的生物測試方法，其特徵在於，所述方法包 括如下步驟(1) 培養雙雜交酵母ER-GRIP1細胞；(2) 繪製誘導標準曲線首先將所述雙雜交酵母細胞分別與已知系 列濃度雌激素共培養，加入鄰硝基苯-(3-D-吡喃半乳糖苷反應液進行反應， 終止反應後4全測上清液在420nm處的吸光度值，並以此作為表示p-半乳泮唐 苦酶活性的參數，繪製系列雌激素濃度相對所述雙雜交酵母ER-GRIP1細 胞的P-半乳糖苷酶活性誘導的劑量-效應關係標準曲線；(3) 檢測樣品將所述雙雜交酵母細胞與待測樣品共培養，加入鄰 硝基笨-P-D-吡喃半乳糖苷的反應液進行反應，終止反應後檢測反應上清液 在420nm處的吸光度值，對照步驟(2)制定的標準曲線計算出樣品中類 雌激素化合物的含量。
15. 根據權利要求14所述的生物測試方法，其特徵在於，在步驟(l)中，將ER-GRIP 1細胞接種時調節菌液600nm處的吸光度值為0.1 ~ 0.2, 3(TC培養24h後調整菌液600nm處的吸光度值為0.7 ~ 0.8準備進行測試。
16.根據權利要求13至15中任一項所述的生物測試方法，其特徵在 於，所述待測樣品為有機溶劑提取液，其中雌激素當量濃度為1O-u l(T10 mol.L-1。
全文摘要
本發明提供一種用於檢測環境樣品中類雌激素化合物的雙雜交酵母及其製備方法，其中該酵母中含有pGBKT7-ER酵母表達質粒和pGAD424-GRIP1酵母表達質粒，其中pGBKT7-hER酵母表達質粒包含雌激素受體基因，pGAD424-GRIP1酵母表達質粒包含具有如SEQ ID No.2所示序列的雌激素受體共激活因子基因片段。本發明還提供了一種檢測環境中類雌激素化合物的生物測試方法，其中包括將上述雙雜交酵母細胞與待測樣品共培養，加入鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反應液進行反應，根據終止反應後檢測到的上清液在420nm處的吸光度值來計算類雌激素化合物的濃度。本發明採用重組雌激素受體基因的雙雜交酵母用於測試，更加接近哺乳動物內分泌系統的真實作用情況，構建的酵母細胞基因性狀穩定，易於培養、篩選，整個類雌激素效應的篩選過程操作簡單，所需樣品量少，成本低廉。
文檔編號C12N1/19GK101469315SQ200710308509
公開日2009年7月1日 申請日期2007年12月29日 優先權日2007年12月29日
發明者劍 李, 王子健, 饒凱鋒, 梅 馬 申請人:中國科學院生態環境研究中心