一種誘導辣椒疫黴菌產生大量孢子囊的方法

2023-06-04 19:17:16

專利名稱：一種誘導辣椒疫黴菌產生大量孢子囊的方法
技術領域：
本發明屬於農業植物保護技術領域，涉及一種辣椒疫黴孢子囊大量產生的方法， 更具體的說涉及誘發孢子囊形成的材料及產孢條件以便孢子囊產生快、數量多、致病力強。
背景技術：
辣椒疫黴菌(phytophthora capsici Leonian)是引起辣椒疫病的一種世界性病害，除危害辣椒外，還侵染番茄、茄子、黃瓜、西瓜、南瓜等作物。該病1918年在美國首次被發現，現已遍及世界各地的辣椒種植區，我國於1950年首次在江蘇發現此病，現該病已蔓及全國各地。近年來隨著保護地栽培面積的擴大，該病有逐年不斷加重發生的趨勢。一般死株率15 % 30 %，嚴重的高達50 % 60 %，造成了嚴重經濟損失。氣候適宜的條件下， 疫病短期即可爆發，使辣椒生產遭受嚴重的損失。近幾年疫黴根腐病又是辣椒疫黴菌引起的另一種症狀的重要病害，對辣椒等寄主作物同樣可以造成毀滅性損失。辣椒疫病的病原菌是辣椒疫黴菌，是危害辣椒生產的一種毀滅性的病害。該病原菌潛育期短，傳播快， 侵染力強，對植物破壞性大。辣椒疫病的再侵染源是辣椒疫黴菌的孢子囊。辣椒疫病病原菌主要以卵孢子和厚垣孢子在病株殘體上、土壤中和種子上越冬，成為來年病害發生的初侵染源。卵孢子在土壤中可以存活2 3年。土壤中的卵孢子可萌發直接侵染辣椒根頸和莖基部，也可被滴濺傳至植株近地面的莖、葉、果上侵染髮病。重茬年限越長，病菌積累越多，發病越重。P. capsici菌絲生長和孢子囊的形成都要求較高的溫度、溼度，當溫度高於25°C，相對溼度大於90%時，最利於該菌的侵染。引起流行再侵染的接種體是孢子囊和遊動孢子，它們借氣流或流水傳播或接觸傳播。發病後病部產生的孢子囊，借風、雨傳播進行重複侵染，造成田間病害的蔓延和危害。疫黴菌在多種培養基上均能正常生長發育並能產孢，只是有產孢量差異。長期以來疫黴菌產孢量低，產孢時間長是制約辣椒疫病研究的瓶頸。為了順利進行辣椒疫病人工接種抗病性鑑定，關鍵是在短期內繁殖大量的辣椒疫黴孢子囊，因此，掌握辣椒疫黴的孢子囊產生最佳條件是進行辣椒疫病菌研究的先決條件。由於辣椒疫黴不易保存，一般通過頻繁轉接來保存較長時間，試驗結果表明，長時期在同一培養基中培養，對其致病性有影響。辣椒疫黴菌常規培養保存均以菌絲形式， 不斷用菌絲繁殖菌絲連續培養多代，會造成菌株生活力退化，營養條件是致病力分化的重要因子，辣椒疫黴長時間在同一環境條件下生長，其致病性會逐漸發生變異，從而導致致病力的分化。進行抗病性鑑定前，有必要進行復壯，以消除因生活力衰退造成的試驗誤差。 很多的研究利用固體培養基如馬鈴薯瓊脂培養基、玉米粉培養基、胡蘿蔔培養基、燕麥培養基、V8培養基等通過一定時間的光照培養，或菌絲塊加入到無菌水內誘發孢子囊，這樣得到的孢子囊數量少，沒有進行復壯，致病力一般較弱。本發明得到的孢子囊不僅數量多，時間短，且致病力得到加強。

發明內容
本發明的目的是為解決辣椒疫黴菌快速形成大量孢子囊的問題，為此，本發明提供一種誘發辣椒疫黴菌產生大量孢子囊的方法。它是先將辣椒疫黴菌用培養基25-28°C培養4-5天，菌絲生長旺盛時用滅菌的打孔器製備成直徑3-5mm的菌塊，將菌絲塊接種於絲瓜表皮的接種孔5-15mm內，用透明的膠帶包裹，室溫，置於流動水下3_4天，或置於託盤內透明薄膜保溼3-4天。在相對溼度大於90%的條件下，保溼培養3-4天。本發明所述的一定時間的光照指的是室內自然光，或培養箱內具有光照即可。本發明所述的誘導方法，其中的馬鈴薯瓊脂培養基為普遍公開使用的培養基。本發明所述的誘導方法，其中的絲瓜表皮指的是新鮮絲瓜。本發明所述的誘導方法，其中菌絲塊接種於絲瓜孔5_15mm內，用透明的膠帶包裹，室溫，置於流動水下3-4天，或置於託盤內透明薄膜保溼3-4天。本發明所述的誘導方法，其中先將絲瓜用清水衝洗乾淨，採用75%乙醇表面消毒後，用15mm滅菌打孔器在絲瓜表面每隔5cm均勻打孔，孔在一條直線上，將準備好的菌絲塊接種於絲瓜孔內，接種孔周圍絲瓜的表面已附滿匍匐的白色菌絲及大量孢子囊即可。本發明所述誘導辣椒疫黴菌產生大量孢子囊的方法在製備辣椒品種抗病性鑑定或殺菌劑對辣椒疫病藥效測定方面的應用。本發明的誘導方法是先將辣椒疫黴菌(參考徐作班，李林，魏道君，等.大棚辣椒疫病菌的分離培養及藥劑防治[J] ·植物保護，1999，2: 29- 31.)的方法進行病株分離培養得到。培養於適宜菌絲生長的培養基內如馬鈴薯瓊脂培養基(PDA)，25-18°C下培養4-5天，菌絲生長旺盛時用5mm的打孔器準備菌塊。利用新鮮絲瓜，先將絲瓜用清水衝洗乾淨，75%酒精表面消毒後，用滅菌的打孔器(15 mm)在絲瓜表面每隔5cm左右均勻打孔，孔最好在一條直線上，將準備好的菌絲塊接種於絲瓜孔內，用透明的膠帶包裹，室溫，置於流動水下3-4天，或置於託盤內透明薄膜保溼3-4天，接種孔周圍絲瓜的表面已附滿匍匐的白色菌絲及大量孢子囊。新方法誘發形成的孢子囊數量多，時間短，且致病力強。本發明採用的絲瓜誘導方法中非常重要的步驟在於使用材料為新鮮絲瓜，接種菌塊後的保溼及一定時間的光照這是因為
(1)離體植株組織在室溫條件下很容易感染雜菌腐爛。(2)辣椒疫黴菌菌絲侵染絲瓜需要較高的溫、溼度，當溫度高於25°C，相對溼度大於90%時，最利於該菌的侵染。(3)辣椒疫黴菌孢子囊的形成需要一定時間的間歇光照及大於80%的相對溼度。本發明人對誘發辣椒疫黴菌孢子囊的形成進行了多次試驗，試驗結果顯示，固體培養基上誘發形成的孢子囊數量少，形成時間長，釋放遊動孢子接種6葉-7葉的辣椒苗，致病力弱，需要大量的孢子懸浮液，發病時間長，而經過絲瓜誘發的孢子囊，釋放遊動孢子接種6葉-7葉的同一品種辣椒苗，致病力強，需要的孢子懸浮液量少，發病時間短。本發明提供的誘導方法應用範圍為辣椒品種的抗病性鑑定、殺菌劑對辣椒疫病的藥效測定等。本發明提供的方法不僅可以形成大量孢子囊，而且對菌株具有復壯作用。本發明的方法操作簡便，形成大量孢子囊的時間短，可用於大批量接種使用。
具體實施方式

為了簡單和清楚的目的，下文恰當的省略了公知技術的描述，以免那些不必要的細節影響對本技術方案的描述。以下結合試驗實例對本發明做進一步的說明。其中絲瓜為市售。實施例1
將保存的辣椒疫黴菌活化(將保存的狀態轉到馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基)培養至馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基，25 °C下培養5天，菌絲生長旺盛時用5mm的打孔器準備菌塊。將絲瓜用清水衝洗乾淨，75%酒精表面消毒後，用滅菌的打孔器(15mm)在絲瓜表面每隔5cm左右均勻打孔，孔最好在一條直線上，將準備好的菌絲塊接種於絲瓜孔內，用透明的膠帶包裹，室溫，置於託盤內透明薄膜保溼3-4天。馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基(PDA)的 成分及組成如下 馬鈴薯塊200g;葡萄糖20g;瓊脂條20g ；蒸餾水IOOOml
將洗淨去皮的馬鈴薯切碎，加IOOOml蒸餾水煮沸30min，雙層紗布濾掉薯塊並在濾液， 中加入瓊脂條溶化，過濾後加葡萄糖，混合均勻定容IOOOmI，15磅高壓蒸汽滅菌25min。實施例2
將保存的辣椒疫黴菌活化(見實例1)培養至V8培養基，28 °C下培養4天，菌絲生長旺盛時用5mm的打孔器準備菌塊。將絲瓜用清水衝洗乾淨，75%酒精表面消毒後，用滅菌的打孔器(15 mm)在絲瓜表面每隔5 cm左右均勻打孔，孔最好在一條直線上，將準備好的菌絲塊接種於絲瓜孔內，用透明的膠帶包裹，室溫，置於託盤內透明薄膜保溼3-4天。V8培養基的成分及組成如下
白芸豆60g，V8蔬菜汁IOOml ； 1. 4g碳酸鈣，18g瓊脂粉，蒸餾水IOOOml 白芸豆60g粉碎後，50-60°C水浴1小時，過濾後加入V8蔬菜汁100ml，再加入1. 4g碳酸鈣，混合均勻後加入瓊脂粉，定容至IOOOmI，15磅高壓蒸汽滅菌20min。 實施例3
(1)將保存的辣椒疫黴菌活化(見實例1)培養至馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基，28°C下培養 5天，菌絲生長旺盛時用5mm的打孔器準備菌塊。將絲瓜用清水衝洗乾淨，75%酒精表面消毒後，用滅菌的打孔器(15mm)在絲瓜表面每隔5cm左右均勻打孔，孔最好在一條直線上，將準備好的菌絲塊接種於絲瓜孔內，用透明的膠帶包裹，室溫，置於託盤內透明薄膜保溼3-4 天。用無菌水洗下絲瓜表面的白色菌絲，雙層紗布過濾後，置於4°C下靜置30分鐘，誘發遊動孢子的釋放。利用血球計數板於顯微鏡下鏡檢孢子濃度。(2)每個處理準備10株甜椒苗，重複三次，6-7葉灌根接種。用玻璃棒在根附近扎 3cm左右孔，每株接種5ml菌液，清水對照不灌菌液。置於25°C左右，保持一定溼度。3天後開始調查發病情況。接種濃度為IO5個/ml，由於接種濃度大，5天後植株全部發病；濃度為IO4個/ ml，接種3天後，大部分植株已發病，且病指較高；濃度為IO3個/ml，為此方法的適宜接種濃度。表1不同接種量對辣椒疫病發病的影響
權利要求
1.一種誘導辣椒疫黴菌產生大量孢子囊的方法，其特徵在於先將辣椒疫黴菌用馬鈴薯瓊脂培養基2548°C培養4-5天，菌絲生長旺盛時用滅菌的打孔器製備成直徑 3mm-5mm的菌塊，將菌絲塊接種於絲瓜表皮的接種孔5_15mm內，用透明的膠帶包裹，室溫， 置於流動水下3-4天，或置於託盤內透明薄膜保溼3-4天，在相對溼度大於90%的條件下， 保溼培養3-4天。
2.權利要求1所述的誘導方法，其中的絲瓜表皮指的是新鮮絲瓜。
3.權利要求1所述的誘導方法，其中菌絲塊接種於絲瓜孔5-15mm內，用透明的膠帶包裹，室溫，置於流動水下3-4天，或置於託盤內透明薄膜保溼3-4天。
4.權利要求3所述的誘導方法，其中先將絲瓜用清水衝洗乾淨，採用75%乙醇表面消毒後，用15mm滅菌打孔器在絲瓜表面每隔5cm均勻打孔，孔在一條直線上，將準備好的菌絲塊接種於絲瓜孔內，接種孔周圍絲瓜的表面已附滿匍匐的白色菌絲及大量孢子囊即可。
5.權利要求1所述誘導辣椒疫黴菌產生大量孢子囊的方法在製備辣椒品種抗病性鑑定或殺菌劑對辣椒疫病藥效測定方面的應用。
全文摘要
本發明公開了一種誘導辣椒疫黴菌產生大量孢子囊的方法,其特徵在於先將辣椒疫黴菌用固體培養基25℃-28℃培養4-5天,菌絲生長旺盛時用滅菌的打孔器製備成直徑3mm-5mm的菌塊,將菌絲塊接種於絲瓜表皮的接種孔5mm-15mm內，在相對溼度大於90%的條件下，保溼培養3-4天。應用範圍為由辣椒疫黴菌引起的作物病害接種，辣椒疫病或甜椒疫病的抗病性鑑定，防治辣椒疫病的殺菌劑藥效試驗，殺菌劑對孢子囊萌發的抑制試驗等。本發明的方法操作簡便，產孢時間短，產孢量大，致病力強，應用於與疫黴菌的研究有實際的指導意義。
文檔編號C12N3/00GK102154193SQ20111002211
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月20日 優先權日2011年1月20日
發明者劉春豔, 劉曉林, 常彩濤, 王萬立, 郝永娟, 霍建飛 申請人:天津市植物保護研究所