一種抑制聚合酶鏈式反應試劑盒的製作方法
2023-06-04 19:31:46
專利名稱：一種抑制聚合酶鏈式反應試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種聚合酶鏈式反應試劑盒，更具體地說，本發明涉及一種操作簡單、 且能夠提高PCR擴增特異性的、高特異性的DNA體外擴增技術，即抑制聚合酶鏈式反應檢測試劑盒，屬於分子生物學檢測技術中的DNA體外擴增技術領域。
背景技術：
在現有的DNA體外擴增技術中，聚合酶鏈式反應是最主要的也是很有效的常用技術。在常規PCR中，經常遇到引物二聚體和其它非特異性擴增的產生，最易產生引物二聚體和其它非特異性擴增的時段為反應液混合後至溫度升高到設定溫度前，其次為擴增的最初數個循環，因為此時引物濃度最高，最易引發非特異擴增，而一旦產生非特異性模板包括引物二聚體，由於其與特異性擴增的效率相當，並竟爭底物與酶，往往與特異性擴增差不多同時進入擴增的平臺期，這不僅使擴增結果難以判斷，而且使特異性擴增效率降低，尤其在擴增粗提的臨床標本時，常導致臨床基因診斷的假陽性和假陰性結果的產生。用於提高PCR擴增特異性的方法已有熱啟動法、固體石蠟膜法、抗體-酶法等，但這些方法只能部分地達到降低非特異性擴增的目的，而一旦非特異性模板產生，它們均不能有效抑制非特異擴增的繼續進行。
發明內容
本發明的目的在於建立一種操作簡單，且能提高PCR擴展特異性的、高特異性的DNA體外擴增技術，即抑制聚合酶鏈式反應檢測試劑盒，其英文名稱是suppression polymerase chain reaction， 英文縮寫是S-PCR。本發明的技術方案是首先根據待擴增靶DNA序列合成一對特殊的抑制引物，該引物的3』端約15 18個鹼基與模板DNA序列互補，其5』端11 14個鹼基則與其自身序列形成反向互補；然後溶解引物使引物形成部分雙鏈結構；最後將抑制引物加入含有耐熱 DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、鎂離子、PCR緩衝液、超純水等組成的PCR擴增緩衝反應體系中，在熱循環儀上進行高溫、低溫、中溫的反覆熱循環；在溫度較低時(即常規PCR條件下最易產生非特異擴增和引物二聚體)，由於抑制引物主要以雙鏈形式存在，處於失活狀態，故大大降低了非特異擴增和引物二聚體產生的可能性；以使模板DNA變性、引物與模板復性、 引物沿模板DNA延伸反覆進行，而達到靶DNA片段在體外呈2n倍擴增(其中η為熱循環次數)，在擴增的過程中，當溫度降低到退火溫度時，除了與模板特異結合外，還會有大量的抑制引物自身復性成雙鏈引物，從而快速降低有效引物的濃度，抑制非特異擴增的產生；而一旦產生了非特異性擴增的模板，則在後續的熱循環中，由於鏈內復性的優先性，則會使大部分非特異性擴增的單鏈兩端復性產生髮夾結構，失去成為有效PCR模板的活性，因而提高了擴增的特異性。所用擴增緩衝反應體系是由抑制引物、耐熱DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、Mg++、PCR緩衝液、超純水等組成的，各個成分的終濃度分別如下特異的引物每條0. 2-0. 4umol/ L、Taq DNA聚合酶 l-3U/50ul、dNTPs 底物 0. 2-0. 5讓01/1、模板0嫩若干、]\%++1. 5-3. 5mmol/ L、緩衝液 1-1.5XPCR;其中 IXPCR 緩衝液包括 50mmol/L KC1、lOmmol/LTris. HC1PH8. 3、 0.01%明膠。該S-PCR由於不僅能夠抑制非特異性擴增的產生而且能夠抑制非特異性擴增進行，與常規PCR方法和其它常見的提高PCR特異性的方法相比，具有很大的優越性。根據上述S-PCR原理，將上述引物和其他PCR試劑混合後分裝到PCR擴增管中，並配以系列稀釋度的標準DNA模板組裝成S-PCR試劑盒。有鑑於此，我們設計了一種操作簡單、不僅能夠抑制非特異性擴增的產生而且能夠抑制非特異性擴增進行的DNA體外擴增技術即抑制聚合酶鏈式反應試劑盒。
具體實施例方式實施例1.材料用本室常規的鹽析法提取30份正常人外周血DNA，作為待擴增模板。引物設計根據脆性X智力低下1號基因(fragile X mental retardation 1， FMRl)的 5，非翻譯區序列(GenBanK S74494 和 Nature Genet，8 (1) 88-94，1994)合成以下特異的內外側引物，其中非陰影部分為FMRl特異序列，與模板互補，陰影部分為與其自身序列形成反向互補的序列上遊抑制引物Pl :5，-CCA CCG GAA GGT GAT CAC CTT CCG GTG GAG-3，(SEQ ID NO 1)；下遊抑制引物P2 :5，-GGC TGA AGA GAA GCT TCT CTT CAG CCC TG-3，(SEQ ID NO 2)；2.抑制聚合酶鏈式反應檢測試劑盒的反應S-PCR 混合50ul反應體系，內含內、外側引物(PI、P2)各IOpmol，正常人DNA 5-10ng, IX PCR 緩衝液，Taq DNA 聚合酶 2u，Mg++ 終濃度 2mmol/L，然後在 PE9600 上 96°C下變性5分鐘，然後按96°C 20秒，65°C 40秒，72°C 1分30秒熱循環35次。3. 2. 5%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠染色，GelDoclOOO下觀察，灰度掃描分析記錄各聚合酶鏈式反應的結果。4.結果在30個標本的S-PCR反應和對應的常規PCR中都獲得了預期大小的PCR產物條帶，未加DNA標本的陰性對照未見相應擴增產物，並且未發現非特異擴增的產物帶。本發明屬於分子生物學檢測技術中的DNA體外擴增技術領域。
權利要求
1.一種操作簡單、特異性高的DNA體外擴增技術即抑制聚合酶鏈式反應檢測試劑盒， 其英文名稱是suppression polymerase chain reaction英文縮寫是S-PCR ；首先根據待擴增靶DNA序列合成一對特殊的抑制引物，該引物的3』端約15 18個鹼基與模板DNA序列互補，其5』端11 14個鹼基則與其自身序列形成反向互補；然後溶解引物使引物形成部分雙鏈結構；最後將抑制引物加入含有耐熱DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、鎂離子、PCR緩衝液、超純水等組成的PCR擴增緩衝反應體系中，在熱循環儀上進行高溫、低溫、中溫的反覆熱循環。
2.根據權利要求1所述的一種抑制聚合酶鏈式反應檢測試劑盒，其特徵在於所用引物為一對特殊的抑制引物，該引物的3』端約15 18個鹼基與模板DNA序列互補，其5』端 11 14個鹼基則與其自身序列形成反向互補。
3.根據權利要求1所述的一種抑制聚合酶鏈式反應檢測試劑盒，其特徵在於所述擴增緩衝反應體系中各成分及其濃度含量分別如下抑制引物各0. 2-0. 4umol/L、Taq DNA聚合酶 l-3U/50ul、dNTPs 底物 0. 2-0. 5mmol/L、模板 DNA 若干、Mg++1. 5-3. 5mmol/L、緩衝液 1-1.5XPCR;其中 IXPCR 緩衝液包括 50mmol/L KCU10mmol/L Tris. HC1PH8. 3、0. 01 % 明膠。
4.根據權利要求1所述的一種抑制聚合酶鏈式反應檢測試劑盒，根據該技術要求所組裝的抑制聚合酶鏈式反應檢測試劑盒。
全文摘要
本發明涉及一種操作簡單、特異性高的DNA體外擴增技術即抑制聚合酶鏈反應檢測試劑盒，其英文名稱是suppression polymerase chain reaction，英文縮寫是S-PCR，首先根據待擴增靶DNA序列合成一對特殊的抑制引物，該引物的3』端約15～18個鹼基與模板DNA序列互補，其5』端11～14個鹼基則與其自身序列形成反向互補；然後溶解引物使引物形成部分雙鏈結構；最後將抑制引物加入含有耐熱DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、鎂離子、PCR緩衝液、超純水等組成的PCR擴增緩衝反應體系中，在熱循環儀上進行高溫、低溫、中溫的反覆熱循環；在擴增的過程中，當溫度降低到退火溫度時，除了與模板特異結合外，還會有大量的抑制引物自身復性成雙鏈引物，由於鏈內復性的優先性，則會使大部分非特異性擴增的單鏈兩端復性產生髮夾結構，失去成為有效PCR模板的活性，因而提高了擴增的特異性。
文檔編號C12Q1/68GK102251027SQ20111015026
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月7日 優先權日2011年6月7日
發明者劉欽松, 夏慶傑 申請人:劉欽松