重組甲胎蛋白，其製備方法及手段，以其為基礎的組合物及其用途的製作方法

2023-06-04 05:32:41 1

專利名稱：：重組甲胎蛋白，其製備方法及手段，以其為基礎的組合物及其用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及微生物和醫藥行業、遺傳工程學、生物工藝學。根據本發明的重組甲胎蛋白(AFP)保留了從血清獲得的人AFP的活性，希望用於腫瘤學、免疫治療、美容學。
背景技術：
：甲胎蛋白(AFP)是哺乳動物胚胎血清中的主要組分，它在圍產期發育過程中由胚胎肝臟和卵黃囊合成。出生後血清中的AFP水平立即急劇下降並且其表達在正常成人個體中變得無法檢測(DeutschH.F.，1991，Adv.Canc.Res.56，253-312)。在肝臟腫瘤和種系發生的(germinogenic)畸胎細胞瘤惡性發展後AFP合成重新開始並且在肝臟化學和機械損傷的情況下(伴隨再生)，例如，在急性病毒性肝炎或肝硬化過程中可以檢測到較少的程度(MizejewskyG.J.，2002，ExpertRev.Anticancer.Ther.289-115)。人AFP是由590個胺基酸組成的糖蛋白並包括約4％的糖類組分(MorinagaT.，等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.，80，4604-4608；PucciP.等人，1991，Biochemistry30，5061-5066)。AFP的一個主要特性是非共價吸附不同的低分子化學物質，例如多不飽和脂肪酸、類固醇激素、金屬、類視黃醇、疏水性抗生素及其他(AusselS.MasseyeffR.，1994，Biochem.Biophys.Res.Commun.1191122-1127；DeutschH.F.，1994，J.TumorMarkerOncol.，911-14)。在胚胎發育早期，AFP代替白蛋白作為脂肪酸及其他低分子物質的運輸工具(DeutschH.F.，1991，Adv.Canc.Res.56，253-312)。AFP分子由3個球形結構域組成，所述結構域由15個鏈間二硫鍵結合，這顯著增加了蛋白質三級結構裝配過程的複雜性(MorinagaT.，等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80，4604-4608；PucciP.，等人，1991，Biochemistry30，5061-5066)。此外，AFP分子的重要結構元件是糖類組分，它提供了分子的正確接納和功能(DeutschH.F.，1991，Adv.Canc.Res.56，253-312)。除由590個胺基酸殘基組成的多肽鏈之外，依照N型糖基化，血清胚胎AFP或由肝癌細胞分泌的AFP分子結構包括一個與天冬醯胺(asparagin)連接的寡糖基團(YamashitaK.等人，1993，CancerRes.532970-2975)。AFP寡糖鏈的結構是異質的並且取決於不同因素肝癌發展階段或胚胎發育階段。影響AFP分子結構特性的寡糖可以包括在抗原決定簇和受體結合中心中(DeutschH.F.，1991，Adv.Canc.Res.56，253-312)。與血清AFP不同，在細菌細胞中表達的重組AFP不是糖基化的，這是Murgita工作中表徵的產物特徵性差異(美國專利6,331,611；6,627,440；6,416,734)，並且因此具有使其與血清類似物並且也與酵母系統中表達的重組AFP區別開的結構和功能特性。已知異源蛋白在酵母中表達時，其糖基化的進行就胺基酸殘基而言與血清類似物中的相同，但就鏈的組成、長度和分支而言，寡糖自身的結構明顯不同，這也預先確定了相應蛋白質在結構和功能特性方面的必然差異(HardK.等人，1998，FEBSLett.248111)。AFP可以被表達特異性AFP受體(AFPR)的細胞選擇性吸收，所述細胞例如胚胎細胞、幹細胞、活化的免疫細胞、癌細胞或由某些類型的逆轉錄病毒轉化的細胞(UrielJ.等人，1989，inJizejewskyG.I.，JakobsonH.I.(eds)BiologicalPropertiesofAlpha-Fetoprotein.BocaRaton，CRCPress，vol.2103-117)。正常的成熟細胞喪失了吸收AFP的能力並且不表達特異性AFPR。考慮到AFP的這種特性，已提出關於AFP治療用途的方法以便向腫瘤靶向輸送抑制癌細胞生長的細胞抑制劑及其他物質(DeutschH.F.，1994，J.TumorMarkerOncol.911-14；TsukadaY.等人，1994，J.TumorMarkerOncol.999-103)。AFP具有眾多的功能特性，目前所述功能特性正在深入研究。AFP作為胚胎血清白蛋白類似物的傳統概念目前已由關於AFP執行細胞生長、發育和按程序死亡調節能力的數據進行補充(MizejewskyG.J.，2002，ExpertRev.Anticancer.Ther.289-115)。特別是，與血清和培養類似物相似的重組AFP顯示能夠抑制雌激素依賴性腫瘤和正常組織的生長(BennettJ.A.等人，1997，BreastCancerRes.Treat.45，169-179；BennetJ.A.等人1998，ClinicalCancerResearch，4，2877-2884)。近來，確定了AFP的腫瘤抑制活性根據觸發凋亡的機制來實現，所述凋亡的特徵為典型的形態學改變、生長停滯、細胞毒性以及DNA斷裂(SemenkovaL.N.，1997，TumorBiol.18，261-274；DudichE.I.，等人，1998，TumorBiol.19，30-40；DudichE.I.，等人，1999，Eur.J.Biochem.2661-13；SemenkovaL.，等人，2003，Eur.；J.Biochem.704388-4399)。早期研究顯示了AFP調節免疫細胞分化和活化的能力。特別是，AFP能夠抑制由同種抗原或自身抗原激活的免疫細胞並且能夠抑制各種細胞因子基因表達(YamashitaK.，等人，1993，CancerRes.53，2970-2975；美國專利號5,965,528)。另一方面，AFP誘導未成熟的骨髓細胞、幹細胞和胚胎細胞的顯著刺激生長(DudichE.I.，等人，1998，TumorBiol.19，30-40；美國專利號6,627,440)。AFP的這些特性，以及體內癌細胞吸收AFP的增加的選擇性(UrielJ.，等人，1989，inMizejewskyG.I.，JakobsonH.I.，edsBiologicalPropertiesofAlpha-Fetoprotein.BocaRaton，CRCPress，vol.2103-117)，揭示其在自身免疫(美國專利號5,965,528)和腫瘤疾病(美國專利號6,416,734；MizejewskyG.J.，2002，ExpertRev.Anticancer.Ther.289-115)治療中作為治療製劑的藥物用途的基礎。此外，AFP通常被用作關於腫瘤疾病早期診斷和胚胎發育病理的腫瘤胚胎標記(DeutschH.F.，1991，Adv.Canc.Res.56，253-312)。然而，由於原料缺乏，天然AFP用作藥物在技術上是不可能的。獲得AFP的通常來源是孕婦的血清、胚胎臍帶血清或癌症患者的腹水。很明顯這些來源沒有一個適合於生產醫療用途的蛋白物質，因為，首先，原料來源的獲取是非常有限的並且其中的AFP含量很低，其次，存在不斷增長的感染病毒或朊病毒的危險。公開了涉及重組AFP(rAFP)在不同微生物中表達和純化的早期數據(YamamotoR.，等人，1990，LifeSciences，461679-1686；NishiS.，等人，1988，J.Biochem.104968-972；美國專利5,206,153；美國專利6,331,611)。因此，在啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)(YamamotoR.，等人，1990，LifeSciences，461679-1686；美國專利5,206,153)和大腸桿菌(Escherichiacoli)(美國專利6,331,611；BoismenuR.，等人，1997，ProteinExpressionandPurification.1010-26)中進行了人rAFP的細胞內生產。在大腸桿菌中表達的重組AFP顯示保留了胚胎類似物的免疫調節和腫瘤抑制活性(BoismenuR.，等人，1997，ProteinExpressionandPurification.1010-26；BennettJ.A.，等人，1997，BreastCancerRes.Treat.45，169-179)。這些表達系統的主要缺陷是不能分泌異源蛋白及其生產水平極低。此外，從重組生產菌株生物量獲得所需產物需要執行另外的變性和復性操作，這導致產物產量顯著減少並因此實際上增加其成本。同樣地，在使用細菌表達系統的情況下，具有已知的內毒素活性的外殼脂多糖汙染產物的問題同樣重要。與本發明最相似的技術解決方案是參考文獻中所述人AFP生產菌株(YamamotoR.，等人，1990，LifeSciences，461679-1686；美國專利5,206,153)。在這些來源中公開了細胞內生產人AFP的酵母生產菌株啤酒糖酵母，其胺基酸序列包括與大鼠AFP信號肽對應的附加部分。本發明鑑別了酵母菌株的產物分泌，這個產物具有成熟人AFP的特性並且具有SEQIDNO2的原始序列，這對應成熟的人AFP的序列。這個特異性使本發明中描述的產物顯著超過早期所公開的(YamamotoR.，等人，1990，LifeSciences，461679-1686；美國專利5,206,153)。此外，所引用的參考文獻中描述的這種菌株的缺點是缺少細胞內裝配以及將AFP分泌到培養液中的機制，這明顯增加了成本，使得以製備量製備純化的重組AFP的方法更加複雜並且提供了極低水平的AFP產物。此外，所引用工作的作者(YamamotoR.，等人，1990，LifeSciences，461679-1686；美國專利5,206,153)獲得了修飾的重組AFP，其序列也包括信號和連接肽，這限制了其醫療用途的可能性，因為蛋白質結構的修飾導致免疫特異性的改變並且其結果是增加了靜脈內或皮下施用的免疫反應病理危險。在酵母細胞異源分泌生產蛋白的情況下，為了使正確摺疊伴隨二硫鍵形成發生(在它們中AFP)，重要的是生產細胞內酵母二硫化物異構酶(Pdi)的產生水平(ShustaE.V.，等人，1998，Nat.Biotechnol.16773-777)。此外，這種酶的協同作用由增加量的shaperon樣酵母蛋白BiP提供(RobinsonA.S.，等人，1996，J.Biol.Chem.27110017-10022)。儘管事實上酵母通常被認為是不含被分泌的蛋白水解酶的生物(ChungB.H.ParkK.S.，1998，Biotechnol.Bioeng.57245-249)，對於眾多蛋白質，包括——對於HSA，顯示了它們在酵母培養過程中的降解，這涉及與細胞相關的仍未鑑別的蛋白水解酶的存在(ChungB.H.ParkK.S.，1998，Biotechnol.Bioeng.57245-249；KangH.A.，等人，2000，Appl.Microbiol.Biotechnol.53575-582)。所有被列出的因素需要在創建AFP有效地分泌在培養液中的酵母生產者的過程中對它們加以考慮。考慮到目前製備重組AFP的方法中存在的缺點，明顯需要進一步改進關於表達並分泌重組AFP的系統的技術，特別是開發具有較高異源蛋白表達能力的新型重組菌株，提供天然三級結構的細胞內裝配以及隨後所需產物分泌到培養液中。因此，需要開發工業上可用的AFP製備方法，所述AFP就其特性而言將與人血清AFP相同或相似，並且因此將使得它能夠用於人血清AFP通常使用的那些領域中。通過創建微生物的新型菌株可以完成所述目標，所述菌株可以在培養基中生產就其特性而言與人血清AFP相同或相似的多肽。發明概述為了製備其特性將與人血清AFP特性相同或相似的重組AFP，必須開發提供被分泌的可溶形式AFP合成及生產的生產菌株。利用基因工程方法通過用質粒轉化親本菌株獲得生產菌株，所述質粒包括編碼具有成熟的人AFP活性的蛋白的DNA序列。在酵母表達系統中生產的重組被分泌AFP具有與成熟的人AFP相同或相似的特性，這在免疫學分析中以及通過其抑制B細胞淋巴瘤Raji及其他人細胞系細胞生長的能力得到確定，所述細胞在體外培養中對促凋亡作用敏感。這使所獲得的AFP和成熟的人血清AFP具有相同的作用機制，所述獲得的AFP通過常規方法獲得並具有如SEQIDNO2所呈現的胺基酸序列。根據本發明的AFP製備方法的執行條件提供與天然人AFP相比具有最小缺陷的多肽裝配。在酵母中生產的人重組AFP與人血清AFP特性的近似性由質粒組成中包含的表達盒提供，所述表達盒包括編碼成熟的人AFP的DNA序列，其中分離過程不要求變性-復性步驟，並且同時提供所獲得多肽的糖基化以及分子摺疊和二硫鍵的形成。在酵母表達系統中以被分泌的形式生產的重組人AFP與在原核表達系統中生產的重組類似物的不同之處在於前者依照N型進行糖基化，而專利(MurgitaR.A.美國專利6,331,611；6,627,440；6,416,734)中所描述的重組細菌AFP是非糖基化的。在酵母表達系統中以被分泌的形式生產的人重組AFP通過寡糖鏈的組成和結構不同於血清類似物，所述寡糖鏈的組成和結構由酵母菌株和營養培養基中所包括糖類的組成決定。為了從宿主細胞獲得具有所需活性的高產量的分泌蛋白，向編碼AFP基因的質粒中加入幾種另外的基因，所述另外的基因提供高水平的基因轉錄、分泌過程中的蛋白質摺疊以及二硫鍵的正確形成。因此獲得了具有轉化細胞用於表達並分泌AFP能力的pKX質粒。利用上述質粒獲得了具有分泌重組甲胎蛋白能力的真核生產細胞。在優選變異體中，受體菌株啤酒糖酵母YBS723被用作原始細胞，用pKX質粒轉化這種菌株以獲得生產菌株啤酒糖酵母YBS723/pKX，它保存於俄羅斯國立工業微生物保藏中心(RussianCollectionofIndustrialMicroorganisms)(VKPM)，保藏號Y-3115。在轉化菌株的培養過程中，AFP被分泌到培養基中，從所述培養基中它可以利用傳統的生物化學方法以純化的形式被分離。從轉化細胞獲得的被分離的AFP用於抑制腫瘤細胞生長的藥物組合物中，所述藥物組合物包括所獲得的AFP以及藥物學上可接受的載體和賦形劑。被分離的AFP用於抑制腫瘤細胞生長的協同組合物中，所述協同組合物包括所獲得的AFP和化學治療製劑以及藥物學上可接受的載體和賦形劑。利用所分離的AFP，已開發了以其為基礎的藥物組合物或包括其的協同組合物，治療癌症或阻止癌症發展的方法，所述方法設想給患者施用有效量的AFP、藥物組合物或協同組合物。由於所獲得的AFP就特性而言與人血清AFP相似，因此所獲得的AFP用於具有免疫抑制和免疫調節作用的協同組合物中，其中所述組合物包括AFP和環孢菌素C以及藥物學上可接受的載體和賦形劑。已開發了利用被分離的AFP或上述協同組合物治療自身免疫性疾病並調整免疫狀態的方法，所述方法包括給患者施用有效量的AFP或含環孢菌素C的協同組合物。考慮到AFP能夠刺激幹細胞生長，本發明人已提出刺激幹細胞生長的藥物組合物，所述組合物包括所獲得的AFP以及藥物學上可接受的載體和賦形劑，並且還提出了刺激幹細胞生長的協同組合物，這種組合物包括所獲得的AFP和維生素A、E、D的衍生物、抗氧化劑、類固醇激素、植物來源的異黃酮以及藥物學上可接受的載體和賦形劑。提出了利用被分離的AFP、上述藥物或協同組合物在體外刺激幹細胞生長的方法，所述方法包括用有效量的AFP或相應的組合物作用於細胞。此外，提出了在體內刺激幹細胞生長的方法，所述方法包括給患者施用有效量的AFP或上述藥物或協同組合物。在被分離的AFP功能活性的基礎上提出了使皮膚更新並防止皮膚衰老的化妝品組合物，所述組合物包括所獲得的AFP以及美容學上可接受的載體和賦形劑，以及任選的維生素A、E、D的衍生物、抗氧化劑、類固醇激素、植物來源的異黃酮。在本發明的框架內提出了利用所獲得的化妝品組合物使皮膚更新並防止皮膚衰老的方法，所述方法包括在個體皮膚上應用所述組合物。附圖簡述下列圖舉例說明了本發明所提出的主題。附圖1顯示了編碼成熟的人甲胎蛋白序列的pKX質粒的結構，包括含人甲胎蛋白基因的表達盒；細菌質粒pUC18的片段；2-μm酵母質粒的複製起始區；選擇性PGK1酵母標記、編碼二硫化物異構酶的PD11基因和提供蛋白質正確裝配並將所需產物分泌到培養基中的KAR2基因。附圖2顯示了在pKX質粒組成中的表達盒的結構，所述表達盒包括編碼人甲胎蛋白的序列。GAL1酵母基因的啟動子區由斜體字顯示。MFα1酵母基因的分泌前原區(pre-proregion)由黑印刷體顯示。人甲胎蛋白分子的胺基酸序列由大寫字母顯示。附圖3表示編碼AFP並且由最常用的酵母密碼子組成的合成基因的結構。與血清人AFP的胺基酸序列相同的AFP胺基酸序列用黑印刷體指出。附圖4顯示了在一條線上應用的不同量的純化重組甲胎蛋白的SDS-PAGE電泳(A)和免疫印跡分析(B)結果，所述重組甲胎蛋白從酵母培養物啤酒糖酵母YBS723/pKX培養液中獲得。1.標記蛋白(94、67、43、30、20kD)。2.在含抗-AFP-瓊脂糖的柱上親和層析後的rAFP(0.3μg)。3.在含SephacrylS-200的柱上凝膠層析後的rAFP(0.4μg)。4.rAFP(0.1μg)。5.SephacrylS-200後的rAFP(0.6μg)。6.SephacrylS-200後的rAFP(0.5μg)。7.胚胎eAFP(0.4μg)。附圖5顯示了B細胞Raji淋巴瘤細胞對兩種不同純化AFP樣本的AFP濃度的劑量依賴性增殖，所述樣本從胚胎血清eAFP和重組rAFP獲得，所述重組rAFP由酵母生產菌株啤酒糖酵母YBS723/pKX表達。在與AFP一起孵育12小時後的實驗培養物中相對於無添加的對照通過摻入[H3]-胸腺嘧啶核苷測量細胞的增殖並以生長抑制百分比表示。附圖6證明(A)就成髓細胞瘤U937細胞而言，與根據本發明rAFP組合使用的阿黴素腫瘤抑制作用的協同增強作用；(B)與根據本發明rAFP和視黃酸(維生素原A酸)組合使用的一般腫瘤抑制效應的協同增強作用。在與AFP一起孵育12小時後的實驗培養物中相對於無添加的對照通過摻入[H3]-胸腺嘧啶核苷測量細胞的增殖並以生長抑制百分比表示。附圖7顯示根據本發明的rAFP對胚胎幹細胞生長的刺激作用，所述細胞從胚胎肺和視網膜細胞的原代培養中獲得。通過在培養最後4小時內摻入[H3]-胸腺嘧啶核苷的標準方法測量細胞的增殖並以測試培養物中相對於無AFP對照的生長刺激百分比表達。序列表包括序列SEQIDNO1和SEQIDNO2，它們分別為表達盒的核苷酸序列以及成熟的人AFP的胺基酸序列，所述表達盒在pKX質粒的組成中並且包括人甲胎蛋白的編碼序列。表達盒的核苷酸序列包括GAL1酵母基因的啟動子區、MFα1酵母基因的分泌前原區、人甲胎蛋白基因的編碼序列以及CYC1酵母基因的轉錄終止區。這個表達盒包括在pKX質粒中，所述pKX質粒在酵母生產菌株啤酒糖酵母YBS723/pKX系統中編碼成熟的人甲胎蛋白的序列。發明詳述為了實現本發明，主要的技術目標是創建能將所需蛋白有效分泌到培養液中的AFP酵母生產菌株。通過構建編碼調節合成的人AFP的重組DNApKX質粒以及啤酒糖酵母YBS723/pKX菌株來解決這個目標，所述菌株提供以被分泌的溶解形式合成和生產並且表達水平不低於10mg/l的AFP。提供了以被分泌的溶解形式的高水平合成的所需蛋白，其中pKX質粒包括GAL1基因的啟動子與同時擴增的KAR2基因(RobinsonA.S.，等人，1996，J.Biol.Chem.27110017-10022)，所述KAR2基因編碼伴侶重鏈結合蛋白BiP。在受體菌株的基因組中，存在編碼二硫化物異構酶的PD11基因擴增(RobinsonA.S.，等人，1996，J.Biol.Chem.27110017-10022)，所述酶在蛋白質分泌過程中參與形成二硫鍵。重組質粒DNA包括在GAL1啟動子基因控制下的人AFP基因以及編碼伴侶重鏈結合蛋白BiP的KAR2基因，所述GAL1啟動子基因提供高水平的基因轉錄，所述KAR2基因在蛋白質分泌過程中參與蛋白質摺疊，並在培養液中提供高水平的所需蛋白產物。此外，為了提供二硫鍵的正確形成以及蛋白質天然三級結構的形成，使用編碼二硫化物異構酶的PS11基因。編碼人AFP基因的重組pKX質粒DNA(附圖1)具有下述特徵-它是有效分泌人AFP的表達質粒；-它具有13301bp的大小；-它包括編碼成熟人甲胎蛋白的胺基酸序列SEQIDNO2的片段；-它包括細菌質粒pUC18的片段；2-μm酵母質粒的起始區；選擇性酵母標記PGK1；編碼伴侶重鏈結合蛋白BiP的KAR2酵母基因；編碼二硫化物異構酶的PD11基因；含AFP基因組的表達盒；-由核苷酸序列SEQIDNO1呈現的表達盒的結構中包括GAL1酵母基因的啟動子區；MFα1酵母基因的分泌前原區；編碼成熟的人AFP的區域；CYC1酵母基因的轉錄終止區。當這個質粒被導入細胞中時，由於使用了高度有效的GAL1啟動子實現了AFP基因的高水平轉錄。如果編碼區將對應編碼成熟的人AFP的DNA序列，則MFα1分泌前原區的導入為培養液中具有期望的胺基酸序列SEQIDNO2的蛋白質的AFP提供正確的分泌過程以及有效地分泌；-所提出的質粒構建物的顯著特徵在於afp基因在高度有效的GAL1啟動子的控制下，並且為了提供二硫鍵的正確形成以及蛋白質天然三級結構的形成，使用PD11和KAR2基因。對所述質粒轉化敏感的任何真核細胞均可用所創建的質粒轉化。細胞的選擇不是關鍵，因為轉化方法和步驟是本領域技術人員眾所周知的。然而，取決於所獲得的轉化株的細胞類型和培養條件，AFP的表達水平可以改變，但表達所需肽將在親本細胞成功轉化的條件下發生。基因型pgk1/pgk1的受體菌株YBS723用於獲得啤酒糖酵母YBS723/pKX菌株。pgk1/pgk1的純合性使得這種菌株不能在包含任何單一碳源的所有培養基中生長，所述碳源在啤酒糖酵母正常消化範圍之內。gal80∷PD11/gal80∷PD11的純合性導致GAL1基因啟動子的調節改變與PD11基因基因組的同時增殖，所述PD11基因編碼二硫化物異構酶並在蛋白質分泌過程中參與二硫鍵形成。利用根據本方法的pKX質粒轉化YBS723菌株(ItoH.，等人，1983，J.Bacteriol.153163-168)。根據在包括2％葡萄糖作為碳源的全價酵母培養基(細菌用蛋白腖-20g/l，酵母提取物-10g/l，細菌培養用瓊脂-20g/l)上的生長能力選擇轉化株。一種此類克隆被命名為YBS723/pKX。所獲得的二倍體酵母菌株啤酒糖酵母YBS723/pKX具有下述特徵遺傳特徵基因型pgk1/pgk1gal80∷PD11/gal80∷PD11；形態學特徵在含2％葡萄糖作為唯一碳源的固體營養培養基上生長48小時培養物的生長細胞具有橢圓形的形狀，細胞大小為3.6×7.1μm，原生質為均質的，通過出芽生殖進行再生。當在包含酵母提取物和蛋白腖的固體培養基(YEP)上30℃生長72小時後，柱具有下述外觀1)在含葡萄糖的YEP培養基上-白色柱邊緣光滑、表面發亮、錐形輪廓、乳膏樣粘度；2)在含澱粉的YEP培養基上-白色柱邊緣有圖案、表面暗淡、晶狀體樣輪廓以及顆粒粘度；3)在含糖蜜的YEP培養基上-白色柱表面暗淡有皺紋、邊緣有圖案、凸狀輪廓以及乳膏樣粘度；在液體培養物中的生長-在含澱粉的YEP培養基上32℃時在培養開始的24小時內-液體混濁、殘渣為白色、不結塊、不形成側壁薄膜。物理化學特徵兼性厭氧菌。生長溫度23-33℃(最佳溫度31℃)。培養pH值3.8-6.7(最佳pH值5.0)。在pH6.8-7.0時觀察到AFP分泌的最高水平。碳源的同化發酵葡萄糖、半乳糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、糊精、澱粉。氮源的同化同化胺基酸、尿素、硫酸銨、硝酸銨。獨特的特異性在含澱粉(2％)的豐富培養基上培養的情況下，培養皿在+4℃孵育24小時後，澱粉褪色帶被深色邊環繞。病原性啤酒糖酵母YBS723/pKX菌株是非致病的。保存方法菌株在含葡萄糖的瓊脂化(agarized)豐富培養基內+4℃保存3個月。所獲得的啤酒糖酵母YBS723/pKX菌株(分泌形式的AFP的生產者)被存放在俄羅斯國立工業微生物保藏中心(VKPM)，保藏號Y-3115。由申請人提出的重組AFP的細胞生產菌株具有超過已存在原型的眾多優點-所需產物的產生以被分泌到培養液中的形式實現；-最終產物的胺基酸序列對應成熟的人AFP的序列-SEQIDNO2；-與血清胚胎類似物相似，由生產菌株啤酒糖酵母YBS723/pKX生產的rAFP是糖基化的；-由於PD11基因表達以及KAR2基因表達的增加，所需產物的產量顯著增加，所述PD11基因編碼二硫化物異構酶，提供二硫鍵形成，所述KAR2基因編碼伴侶重鏈結合蛋白BiP，提供蛋白質的正確裝配以及所需產物分泌到培養基中。非常明顯編碼DNA的序列可以包括與遺傳密碼簡併性相關的置換，並且還包括就整體而言不會導致得到無活性形式胎蛋白的某些置換、插入、刪除。可能的變異是本領域技術人員已知的。所獲得的多肽還可包括在胺基酸序列框內的保守胺基酸置換，前提是一個胺基酸被另一個具有相似特性的胺基酸置換。然而，在本發明所要求特徵的限制內，只存在具有一級、二級和三級結構的那些多肽，所述結構不會擾亂所獲得多肽的所需活性，特別是-具有與成熟的人AFP特性相同或相似的特性，所述特性在免疫學分析中並且根據其在體外培養中抑制B細胞淋巴瘤Raji細胞生長的能力進行確定。認為所獲得的多肽將具有成熟的人血清AFP特性的功能活性指數根據免疫反應並且根據其體外抑制B細胞淋巴瘤Raji細胞生長的能力在不低於成熟的人血清AFP活性10％的水平進行確定。在所得多肽在組合物中的特殊用途情況下，使用傳統的另外組分，例如賦形劑、稀釋劑、防腐劑、緩衝液、生理溶液、0.9％氯化鈉溶液、在藥物劑型生產過程中使用的工藝添加劑等。組合物可以是用作腸胃外、口服、靜脈內、肌內等施用或供外部使用的流體(溶液、懸浮液、乳膏、乳狀液等)、固體(在使用前重構的凍乾粉劑、吸附在載體上的製劑等)。其中，供外部使用的組合物可以包括促進活性物質在組織中吸收和擴散的添加劑。本發明的協同組合物提供另一種活性物質在組合物中的存在，其中在兩種活性物質同時存在(其中之一為根據本發明的AFP)的情況下，它們的作用效果確實比每種物質分開使用的情況更高。非常明顯，協同組合物是本發明實施方案的一個優選方案，因為對於本領域技術人員來說每種活性組分分開施用是顯而易見的。例如，在抗癌治療的情況下，每種活性組分製劑可以分開施用以及一起同時施用，伴隨時間上或不同施用方式的分開。具體的選擇取決於患者的狀態、疾病的嚴重度、先前的治療等。治療用的治療劑量的選擇可以是0.001-10mg/kg患者體重的廣泛範圍內的任何劑量，附加條件是獲得所需療效。它對應人AFP的常規劑量，因為所獲得的AFP將具有就活性而言相似或接近的特性。根據本發明的AFP的限制劑量對應人AFP的劑量，因為它們具有相似的胺基酸序列，它不會被正常的人免疫系統識別為「外來的」。本發明由下述實施例來舉例說明，所述實施例不是限制性的，但希望證實本發明的實施方案並實現實施方案的最佳改變。實施例1分離總RNA並構建中間體重組質粒DNApTrcafp利用TrizolReagent(GibcoBRL，USA)依照製造商的方法從人肝癌細胞株HepG2中分離出總mRNA。利用FirstStrandcDNASynthesisKit(MBIFermentas)在引物寡聚(dT)18或與基因afp3』末端互補的GAAGTAATTTAAACTCCCAAAGC(3R)的存在下得到cDNA。在下列引物的存在下進行用於後續克隆的所得基質的擴增CTTCAATCGATATGACACTGCATAGAAATG(Cla)CTTCCAAGCTTAAACTCCCAAAGCAG(Hind)，第一個引物序列對應成熟的蛋白基因的5』序列(用黑印刷體指出)並且包括限制性酶ClaI的識別位點，而第二個與基因的3』末端部分互補(用黑印刷體指出)並包括HindIII的識別位點。在100μl的體積中進行基因擴增。反應混合物包括10ngcDNA、引物(1)和(2)每種30pM、dNTP混合物(每種0.2mM)、10mMpH8.8的Tris-HCl、10mMKCl、2.5mMMgSO4、2.5單位PfuDNA-聚合酶(Stratagene公司)以及1單位的TaqDNA-聚合酶(Fermentas公司)。根據下述方案進行25個循環95℃/40秒、39℃/40秒、72℃/1分鐘。通過在1％瓊脂糖凝膠中電泳分析反應產物；切下長度約1790bp的條帶，從凝膠中提取DNA，用限制性酶ClaI和HindIII處理並克隆到質粒pTrcTEGF中，所述質粒pTrcTEGF先前在載體pTrc99A的基礎上得到(AmannE.，等人，1988，Gene，69，301-315)，並且用那些相同的限制性酶處理。從而獲得質粒pTrcafp；其結構通過限制性酶分析並且通過PCR測定所克隆的DNA部分的核苷酸序列進行確認，所述限制性酶分析相對於所得到的克隆利用限制性酶ClaI和HindIII，並且還可利用識別位點在AFP基因內部的SpeI、MunI、SecI和StyI。根據方法並利用CycleReaderTMDNASequencingKit(Fermentas，Lithuania)進行測序。實施例2製備編碼人AFP基因的合成cDNA為了獲得合成的AFP基因，化學合成長度為62-68b的36個寡核苷酸。在這些寡核苷酸的基礎上，通過聚合酶鏈式反應法獲得6個雙鏈片段，將其中的每一個都克隆到載體pUC18中。通過測序確認所有克隆片段的一級結構。隨後通過限制/連接的方法以質粒pUC18片段的形式將具有正確核苷酸結構的片段順次連接為所需基因。以類似方式獲得用於表達修飾形式的AFP的cDNA，所述AFP包括刪除、突變或添加的胺基酸殘基。實施例3構建重組質粒DNApKX在引物的存在下質粒pTrcafp被用作PCR的模板CAACCCTCGAGTTAAACTCCCAAAGCCCAACCCATGGCTAAGAGAACACTGCATAGAAA-TG。限制性位點NcoI和XhoI(有下劃線的)被設定在引物序列中。作為擴增結果獲得的DNA片段在限制性核酸內切酶NcoI/XhoI處理後克隆到載體pUC18/GAL1-pp中，所述載體包括啟動子GAL1以及MFα1的分泌前原區。從而獲得質粒pUC18/GAL1-pp/afp。為了排除PCR可能的錯誤，對質粒的NcoI/XhoI片段進行測序。包括啟動子GAL1、MFα1的分泌前原區以及人AFP基因的編碼部分的質粒pUC18/GAL1-pp/afp的HindIII/XhoI片段(附圖2)轉移到HindIII/XhoI雙複製子(酵母-大腸桿菌)載體pPDX中。從而得到質粒pPDX/GAL1-pp/afp。質粒pPDX/GAL1-pp/afp的ClaI/XhoI片段轉移到pPX的ClaI/XhoI載體中，所述pPX由於KAR2基因的存在而不同於pPDX。從而得到的質粒被命名為pKX(附圖1)。以類似的方式得到質粒pKX-1，它包括由最廣泛使用的酵母密碼子組成的合成人AFP基因(附圖3)。質粒pKX-1與pKX的不同之處在於前者包括成熟的人AFP的合成基因。實施例4獲得人AFP的生產菌株為了獲得啤酒糖酵母YBS723/pKX菌株，依照方法用質粒pPX轉化受體菌株YBS723(ItoH.，等人，1983，J.Bacteriol.153163-168)。根據在包括2％葡萄糖作為碳源的全價酵母培養基(細菌用蛋白腖-20g/l，酵母提取物-10g/l，細菌培養用瓊脂-20g/l)上的生長能力選擇轉化株。一種此類克隆被命名為YBS723/pKX。實施例5測定人AFP生產菌株啤酒糖酵母YBS723/pKX的生產能力生產菌株YBS723/pKX的細胞在管形瓶中26℃在搖床上(250rpm)在下述組成的培養基上生長葡萄糖-2％、甘油-1.5％、酵母提取物-1％、蛋白腖-2％、蒸餾水。通過加入0.1M的磷酸鹽緩衝液使培養基的pH值維持在7.0。細胞的初始滴定度為5×106。在培養物生長72小時過渡到生長平穩期後滴定度為7-8×108時進行取樣。培養物10000rpm離心1分鐘後獲得培養液的樣本並用於下述分析。在含十二烷基硫酸鈉的12.5％聚丙烯醯胺凝膠上通過電泳分析CL樣本。凝膠用CoomassieR-250染色(附圖4)並掃描以確定總蛋白質以及AFP特異性蛋白的相對含量。根據電泳和掃描的數據，CL中的AFP總含量為約10-25％的總蛋白質，但存在蛋白質的部分細胞內降解。在AFP多克隆抗體的存在下通過免疫印跡法確定CL中的AFP相對含量(附圖4)。同樣地，利用一套針對人AFP的單克隆和多克隆抗體通過免疫酶分析(IEA)法確定培養液中的AFP定量含量。根據IEA數據，液體培養基中CL的AFP平均含量達到5mg/l。實施例6測定人AFP生產菌株啤酒糖酵母YBS723/pKX在高密度培養基中的生產能力在發酵罐中在26℃和pH7.0時(自動維持)進行菌株YBS723/pKX的分批補料培養。維持＞20％的溶解氧dO含量。在發酵過程中，進行含下述組成培養基的補充酵母提取物-10g/l、蛋白腖-60g/l、葡萄糖-100g/l。補充物的供應速度是這樣的以至提供μ＝0.03的培養物生長速度。達到與280個光學單位相等的OD50後，分析CL中的AFP含量。如上述實施例4中所述確定YBS723/pKX高密度培養的CL中的AFP相對和總含量。在高密度培養的情況下，根據IFA數據CL中的rAFP含量達到70mg/l。實施例7分離並鑑定來自生產菌株YBS723/pKX的CL的重組人AFP如早先所述(Dudich等人，1999，Biochemistry，3810406-10414)並稍加改變進行來自生產菌株YBS723/pKX的CL的rAFP分離。通過在濃縮室「Millipore」上超濾將培養液從31濃縮至200ml並對pH7.5的0.005MTris-HCl、0.1MNaCl緩衝液在4℃進行透析，並隨後在10000rpm離心0.5小時。離子交換層析。對離心後得到的上清液應用離子交換柱DEAE-SepharoseFastFlow(Pharmacia，27×4cm)，用pH7.5的0.01MTris-HCl、0.1MNaCl平衡該柱。用起始緩衝液從柱上洗去沒有與吸附劑結合的組分，而用pH7.5含0.2MNaCl的Tris-HCl緩衝液以1ml/分鐘的速度進行所需產物的洗脫。親和層析。包含rAFP的級分進行合併，NaCl濃度恢復到0.5M並應用於含與多克隆抗-AFP兔抗體綴合的SepharoseCL-4B的親和層析柱，該柱用pH7.5的0.05MTris-HCl和0.5MNaCl平衡。沒有與蛋白質的抗體結合的蛋白質輸出後，用0.005MHCl洗脫被吸附的rAFP。通過280nm處的吸收確定pH從5.0達到3.5後材料的輸出峰。通過加入pH7.5的2MTris-HCl溶液將rAFP溶液中和至pH7.5。凝膠層析。在含SephacrylS-200的柱(1.8×70cm)上在pH7.0的0.1M磷酸鹽緩衝液和0.15MNaCl中通過凝膠層析以0.5ml/分鐘的速度進行rAFP的進一步純化。純化的rAFP溶液在室「Amicon」(膜YM-30)中在氮壓力下進行濃縮。樣本分析。通過方法控制所獲得的rAFP製劑的性質和純度，所述方法包括根據Lammly在含β-巰基乙醇的12.5％SDS-PAGE中凝膠電泳隨後用Coomassie染色(附圖4A)，用滴定度為第一抗體1∶500和第二抗體1∶5000在PVDF膜上的Western印跡分析，在HybondECL-硝化纖維膜上的斑點印跡(附圖4B)，IFA。依照Bredford法，利用胚胎AFP標準溶液作為對照，並且還在278nm處用分光光度計進行測量，考慮消光係數E1％，278nm＝0.53，進行溶液中蛋白質濃度的測定。實施例8測定重組人AFP在體外的生物學活性如早先所述(SemenkovaL.N.，1997，TumorBiol.18，261-274；DudichE.I.，等人，1998，TumorBiol.19，30-40)根據其在體外培養中抑制B細胞淋巴瘤Raji細胞生長的能力來確定rAFP及其修飾形式的功能活性。預先用新鮮培養基洗滌，在0.1ml的RPMI-1640培養基中在10％胎牛血清的存在下按照5×103將Raji細胞放置在96孔板的每個孔中，隨後加入不同劑量的AFP12小時。通過在培養的最後4小時內摻入[H3]胸腺嘧啶核苷的標準方法測量細胞的增殖。為了比較，研究胚胎起源的embrAFP和酵母rAFP的兩種AFP樣本的劑量依賴性反應(附圖5)。很明顯兩種製劑均顯示關於這些細胞的抑制細胞生長活性。類似地，為了測定以AFP為基礎的製劑的體外活性，對AFP抑制作用敏感的任何其他癌細胞株均可使用，例如人肝癌HepG2、乳腺癌MCF-7、前列腺癌LnCap、成髓細胞瘤U-937及其他(SemenkovaL.N.，1997，TumorBiol.18，261-274；DudichE.I.，等人，1998，TumorBiol.19，30-40)。實施例9重組AFP作為抗癌製劑的用途以rAFP及其修飾形式為基礎的抗癌製劑可以用於抑制惡性腫瘤的生長，所述惡性腫瘤例如原發性或轉移性肝癌、血癌(白血性增生、成髓細胞瘤、淋巴瘤)、乳腺癌、前列腺癌。為了確定這種類型的腫瘤細胞對AFP的敏感性，在體外並且同樣在體內可以使用不同的方法。測定體外活性的方法在前述實施例8中得到描述。為了測定以AFP為基礎的製劑在體內的腫瘤抑制作用，可以使用動物模型，例如使用皮下或腹膜內植入人癌細胞株的裸鼠，所述細胞株例如Raji、HepG2、LnCap、MCF-7及其他。例如，以1-5×106/小鼠的量皮下施用B細胞淋巴瘤Raji細胞。在腹膜內或靜脈內植入腫瘤細胞前7天以1-10mg/kg的量開始施用AFP及其衍生物。使用生理學緩衝液(PBS)作為對照。利用測微計通過每天測量來評估腫瘤的大小。表1rAFP對植入B細胞淋巴瘤Raji細胞的裸系小鼠的測試結果以酵母rAFP或其衍生物為基礎的製劑的給藥方法可以包括在其中同時或順次施用化學治療製劑。下述可以被提出作為此類化學治療製劑的實例阿黴素、長春新鹼、氟尿嘧啶、metatrexate、放線菌素D、絲裂黴素C、它莫西芬、氟他胺、長春新鹼、長春鹼、環孢菌素、類視黃醇、類胡蘿蔔素及其他。通常地，化學治療製劑可以以標準劑量或以通常治療之下的亞最佳劑量施用。在附圖6中作為一個實例展示了rAFP與阿黴素(A)以及rAFP與全反式維甲酸(tRA)的組合作用效果。在製劑同時施用的情況下，觀察到亞最佳劑量使用情況下的協同腫瘤抑制作用。實施例9重組AFP刺激幹細胞生長的用途通過用0.2％胰蛋白酶溶液處理合法流產後得到的5-10周的胚胎組織獲得肺和人視網膜的胚胎成纖維細胞的原代培養物。細胞在10％胎牛血清(CFS)的存在下在RPMI-1640培養基中進行培養。如早先所述(SemenkovaL.N.，1997，TumorBiol.18，261-274；DudichE.I.，等人，1998，TumorBiol.19，30-40)測量AFP抑制細胞生長的活性。細胞以每0.15ml培養基4×104的量用新鮮培養基徹底洗滌並放置在96孔板的每個孔中，隨後加入不同劑量的AFP並培養24小時。通過在培養的最後4小時內摻入[H3]胸腺嘧啶核苷的標準方法測量細胞的增殖。還對人胚胎成纖維細胞的原代培養物進行AFP對細胞生長的劑量依賴效應研究。AFP對這些細胞具有刺激效應，其達到對照的50-90％(附圖7)。實施例10重組AFP在美容學中的用途考慮到AFP具有刺激幹細胞生長的能力並且是胚胎細胞的生長因子的事實，提出其可以用於製備化妝品面膜、乳膏和洗劑。rAFP可以用作脂質體、微粒體和納米體(nanosome)的賦形劑。考慮到AFP能夠結合疏水性配體的事實，所述配體特別是脂溶性維生素、類固醇、異黃酮類(isoflavinoid)、多不飽和脂肪酸(DeutschH.F.，1991，Adv.Canc.Res.56，253-312)；AusselC.MasseyeffR.，1994，Biochem.Biophys.Res.Commun.1191122-1127；DeutschH.F.，1994，J.TumorMarkerOncol.911-14)，顯示了rAFP與脂溶性維生素例如類視黃醇、類胡蘿蔔素、tokoferol、維生素D的衍生物，與類固醇例如雌激素和雄激素的衍生物的組合用途。雌二醇及其他也可用作此類類固醇的實例。REFERENCESAmannE.，OchsB.，AbelK.-J.(1988)TightlyregulatedtacpromotervectorsusefulfortheexpressionofunfusedandfusedproteinsinEscherichiacoli.Gene.69(2)301-15.Aussel，C.Masseyeff，R.(1994)Interactionofretinoidsandbilirubinwiththebindingofarachidonicacidtohumanalpha-fetoprotein.Biochem.Biophys.Res.Commun.119，1122-1127.Bennett，J.A.，Semeniuk，D.J.，Jacobson，H.I.Murgita，R.A.(1997)Similaritybetweennaturalandrecombinanthumanalpha-fetoproteinasinhibitorsofestrogen-dependentbreastcancergrowth.BreastCancerRes.Treat.45，169-179Bennet，J.A.，Zhu，S.，Pagano-Mirarchi，A.，Kellom，T.A.Jacobson，H.I.(1998)α-Fetoproteinderivedfromahumanhepatomapreventsgrowthofestrogen-dependenthumanbreastcancerxenografts.ClinicalCancerResearch，4，2877-2884.BoismenuR.，SemeniukD.，MurgitaR.A.(1997)Purificationandcharacterizationofhumanandmouserecombinantalpha-fetoproteinsexpressedinEcherichiacoli.ProteinExpressionandPurification.1010-26.ChungB.H.，ParkK.S.(1998)AsimpleapproachtoreducingtheproteolysisduringthesecretoryproductionofhumanparathyroidhormoneinSaccharomycescerevisiae.Biotechnol.Bioeng.57245-249.Deutsch，H.F.(1991)Chemistryandbiologyofα-fetoprotein.Adv.Cane.Res.56，253-312.DeutschH.F.(1994)Theuptakeofadriamycin-arachidonicacidcomplexesbyhumantumorcellsinthepresenceofα-fetoprotein.J.TumorMarkerOncol.911-14.Dudich，E.I，Semenkova，L.N.，Gorbatova，E.A.，Dudich，I.V.，Khromykh，L.M.，Tatulov，E.B.，Grechko，G.K.Sukhikh，G.T.(1998)Growth-regulativeactivityofalpha-fetoproteinfordifferenttypesoftumorandnormalcells.TumorBiol.19，30-40.DudichE.I.，SemenkovaL.N.，DudichLV.，GorbatovaE.A.，Tokhtamysheva，N.，TatulovE.B.，NikolaevaM.A.SukhikhG.T.(1999)α-FetoproteincausesapoptosisintumorcellsviaapathwayindependentofCD95，TNFR1andTNFR2throughactivationofcaspase-3-likeproteases.Eur.J.Biochem.，2661-13Dudich，I.V.，Tokhtamysheva，N.，Semenkova，L.，Dudich，E.，Hellman，J.andKorpela，T.(1999)Isolationandstructuralandfunctionalcharacterizationoftwostablepepticfragmentsofhumanalpha-fetoprotein.Biochemistry，3810406-10414.ItoH.，FukudaY.，MurataK.，KimuraA.(1983)Transformationofintactyeastcellstreatedwithalkalications.J.Bacteriol.1983，153163-168.HardK，BitterW，KamerlingJP，VliegenthartJF.(1989)O-mannosylationofrecombinanthumaninsulin-likegrowthfactorI(IGF-I)producedinSaccharomycescerevisiae.FEBSLett.248111-4.QuirkA.Y.，GeisowM.J.，WoodrowJ.R.，BurtonSJ.，WoodP.C.，SuttonA.D.，LohnsonR.A.，DodsworthN.(1989)ProductionofrecombinanthumanserumalbuminfromSaccharomycescerevisiae.Bitechnol.Appl.Biochem.11273-287.KangH.A.，ChoiE.S.，HongW.K.，KimJ.Y.，KoS.M.，SohnJ.H.，RheeS.K.(2000)ProteolyticstabilityofrecombinanthumanserumalbuminsecretedintheyeastSaccharomycescerevisiae.Appl.Microbiol.Biotechnol.53575-582.MizejewskyGJ.(2002)Biologicalroleofα-fetoproteinincancerprospectsforanticancertherapy.ExpertRev.Anticancer.Ther.289-115.Morinaga，T.，Sakai，M.，Wegmann，T.G.，andNamaoki，T.(1983)Primarystructuresofhumanα-fetoproteinanditsmRNA.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80，4604-4608.MurgitaR.，Recombinanthumanalpha-fetoproteinasanimmunosuppressiveagent.USpatent5,965,528C07K14/47，1999.MurgitaR.，Recombinanthumanalpha-fetoproteinasacellproliferativeagentUSpatent6,627,440C12N005/00，2003.MurgitaR.，Recombinantalpha-fetoproteinfortreatinganddiagnosingcancers6,416,734，A61K051/00，2002.MurgitaR.A.Expressionandpurificationofclonedhumanalpha-fetoprotein.USPatent6,331,611C07K014/00，2001.NishiS.，KoyamaY.，SakamotoT.，SodaM.，KairiyamaC.B.(1988)Expressionofratα-fetoproteincDNAEsherichiacoliandinyeast.J.Biochem.104968-972.Pucci，P.，Siciliano，R.，Malorni，A.，Marino，G.，Tecce，M.，F.，Ceccarini，C，andTerrana，B.(1991)Biochemistry305061-5066.UrielJ.，LabordaJ.，NavalJ.，GeuskensM(1989)Alpha-fetoproteinreceptorsinmalignantcells.Anoverview；inMizejewskyG.I.，JakobsonH.I.(eds)BiologicalPropertiesofAlpha-Fetoprotein.BocaRaton，CRCPress，vol.2103-117.RobinsonA.S.，BockhausJ.A.，WittrupK.D.(1996)ReductionofBiPleveldecreasesheterologousproteinsecretioninSaccharomycescerevisiae.J.Biol.Chem.27110017-10022.Semenkova，L.N.，Dudich，E.I.Dudich，I.V.(1997)Inductionofapoptosisinhumanhepatomacellsbyalpha-fetoprotein.TumorBiol.18，261-274.Semenkova，L.，Dudich，E.，Dudich，L，Tokhtamisheva，N.，Tatulov，E.，Okruzhnov，Y.，Garcia-Foncillas，J.，Palop-CubilloJ.-A.，KorpelaT.(2003)Alpha-fetoproteinpositivelyregulatescytochromec-mediatedcaspaseactivationandapoptosomecomplexformation，Eur.J.Biochem.704388-4399.SleepD.，BelfieldG.P.，GoodeyA.R.(1990)ThesecretionofhumanserumalbuminfromtheyeastSaccharomycescerevisiaeusingfivedifferentleadersequences.Biotechnology842-46.ShustaE.V.，RainesR.T.，PluckthunA.，WittrupK.D.(1998)IncreasingthesecretorycapacityofSaccharomycescerevisiaeforproductionofsingle-chainantibodyfragment.NatureBiotechnol.16773-777.TamaokiT.，MorinagaT.，NishiS.(1993)Methodofproducinghuman.alpha.-fetoproteinandproductproducedthereby.USPatent5,206,153，C07K013/00；C12N015/62.TsukadaY.，HibiN.，OhkawaK.，DeutschH.F.(1994)Cytocidaleffectofdaunomycinunsaturatedfattyacidcomplexesonrattumorcelllines.J.TumorMarkerOncol.999-103.Yamashita，K.，Taketa，K.，Nishi，S.，FukushimaK.，andOhkuraT.(1993)Sugarchainsofhumancordserumα-fetoprotein.CancerRes.53，2970-2975.YamamotoR.，SakamotoT.，NishiS.，SakaiM.，MorinagaT.，TamaokiT.(1990)Expressionofhumanα-fetoproteininyeast.LifeSciences，461679-1686.序列表110BENEVOLENSKY，SergeiBladimirovich；MARCHENKO，AlexeiNikolaevich；KOZLOV，DmitryGeorgievich；ZATSEPIN，SergeiSergeevich；SHINGAROVA，LyudmilaNikolaevna；DUDICH，IgorVyacheslavovich；SEMENKOVA，LidiyaNikolaevna；DUDICH，DmitryIgorevich；TATULOV，EduardBorisovich；DUDICH，ElenaIvanovna120重組甲胎蛋白，其製備方法及手段，以其為基礎的組合物及其用途160221012112556212DNA213人工序列4001aagctttagcctaaaaaaaccttctctttggaactttcagtaatacgcttaactgctcat60tgctatattgaagtacggattagaagccgccgagcgggtgacagccctccgaaggaagac120tctcctccgtgcgtcctcgtcttcaccggtcgcgttcctgaaacgcagatgtgcctcgcg180ccgcactgctccgaacaataaagattctacaatactagcttttatggttatgaagaggaa240aaattggcagtaacctggccccacaaaccttcaaatgaacgaatcaaattaacaaccata300ggatgataatgcgattagttttttagccttatttctggggtaattaatcagcgaagcgat360gatttttgatctattaacagatatataaatgcaaaaactgcataaccactttaactaata420ctttcaacattttcggtttgtattacttcttattcaaatgtaataaaagtatcaacaaaa480aattgttaatatacctctatactttaacgtcaaggagaaaaaactaccatgagatttcca540tctatcttcactgcagttttattcgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaacact600acaacagaagatgaaacggcacaaattccggctgaagctgtcatcggttacttagattta660gaaggggatttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaataacgggttattg720tttataaatactactattgccagcattgctgctaaagaagaaggggtatccatggctaaa780aggacactgcatagaaatgaatatggaatagcttccatattggattcttaccaatgtact840gcagagataagtttagctgacctggctaccatattttttgcccagtttgttcaagaagcc900acttacaaggaagtaagcaaaatggtgaaagatgcattgactgcaattgagaaacccact960ggagatgaacagtcttcagggtgtttagaaaaccagctacctgcctttctggaagaactt1020tgccatgagaaagaaattttggagaagtacggacattcagactgctgcagccaaagtgaa1080gagggaagacataactgttttcttgcacacaaaaagcccactccagcatcgatcccactt1140ttccaagttccagaacctgtcacaagctgtgaagcatatgaagaagacagggagacattc1200atgaacaaattcatttatgagatagcaagaaggcatcccttcctgtatgcacctacaatt1260cttctttgggctgctcgctatgacaaaataattccatcttgctgcaaagctgaaaatgca1320gttgaatgcttccaaacaaaggcagcaacagttacaaaagaattaagagaaagcagcttg1380ttaaatcaacatgcatgtgcagtaatgaaaaattttgggacccgaactttccaagccata1440actgttactaaactgagtcagaagtttaccaaagttaattttactgaaatccagaaacta1500gtcctggatgtggcccatgtacatgagcactgttgcagaggagatgtgctggattgtctg1560caggatggggaaaaaatcatgtcctacatatgttctcaacaagacactctgtcaaacaaa1620ataacagaatgctgcaaactgaccacgctggaacgtggtcaatgtataattcatgcagaa1680aatgatgaaaaacctgaaggtctatctccaaatctaaacaggtttttaggagatagagat1740tttaaccaattttcttcaggggaaaaaaatatcttcttggcaagttttgttcatgaatat1800tcaagaagacatcctcagcttgctgtctcagtaattctaagagttgctaaaggataccag1860gagttattggagaagtgtttccagactgaaaaccctcttgaatgccaagataaaggagaa1920gaagaattacagaaatacatccaggagagccaagcattggcaaagcgaagctgcggcctc1980ttccagaaactaggagaatattacttacaaaatgcgtttctcgttgcttacacaaagaaa2040gccccccagctgacctcgtcggagctgatggccatcaccagaaaaatggcagccacagca2100gccacttgttgccaactcagtgaggacaaactattggcctgtggcgagggagcggctgac2160attattatcggacacttatgtatcagacatgaaatgactccagtaaaccctggtgttggc2220cagtgctgcacttcttcatatgccaacaggaggccatgcttcagcagcttggtggtggat2280gaaacatatgtccctcctgcattctctgatgacaagttcattttccataaggatctgtgc2340caagctcagggtgtagcgctgcaaacgatgaagcaagagtttctcattaaccttgtgaag2401caaaagccacaaataacagaggaacaacttgaggctgtcattgcagatttctcaggcctg2460ttggagaaatgctgccaaggccaggaacaggaagtctgctttgctgaagagggacaaaaa2520ctgatttcaaaaactcgtgctgctttgggagtttaa25562102211590212PRT213智人4002ThrLeuHisArgAsnGluTyrGlyIleAlaSerIleLeuAspSerTyr151015GlnCysThrAlaGluIleSerLeuAlaAspLeuAlaThrIlePhePhe202530AlaGlnPheValGlnGluAlaThrTyrLysGluValSerLysMetVal354045LysAspAlaLeuThrAlaIleGluLysProThrGlyAspGluGlnSer505560SerGlyCysLeuGluAsnGlnLeuProAlaPheLeuGluGluLeuCys65707580HisGluLysGluIleLeuGluLysTyrGlyHisSerAspCysCysSer859095GlnSerGluGluGlyArgHisAsnCysPheLeuAlaHisLysLysPro100105110ThrProAlaSerIleProLeuPheGlnValProGluProValThrSer115120125CysGluAlaTyrGluGluAspArgGluThrPheMetAsnLysPheIle130135140TyrGluIleAlaArgArgHisProPheLeuTyrAlaProThrIleLeu145150155160LeuTrpAlaAlaAgrTyrAspLysIleIleProSerCysCysLysAla165170175GluAsnAlaValGluCysPheGlnThrLysAlaAlaThrValThrLys180185190GluLeuArgGluSerSerLeuLeuAsnGlnHisAlaCysAlaValMet195200205LysAsnPheGlyThrArgThrPheGlnAlaIleThrValThrLysLeu210215220SerGlnLysPheThrLysValAsnPheThrGluIleGlnLysLeuVal225230235240LeuAspValAlaHisValHisGluHisCysCysArgGlyAspValLeu245250255AspCysLeuGlnAspGlyGluLysIleMetSerTyrIleCysSerGln260265270GlnAspThrLeuSerAsnLysIleThrGluCysCysLysLeuThrThr275280285LeuGluArgGlyGlnCysIleIleHisAlaGluAsnAspGluLysPro290295300GluGlyLeuSerProAsnLeuAsnArgPheLeuGlyAspArgAspPhe305310315320AsnGlnPheSerSerGlyGluLysAsnIlePheLeuAlaSerPheVal325330335HisGluTyrSerArgArgHisProGlnLeuAlaValSerValIleLeu340345350ArgValAlaLysGlyTyrGlnGluLeuLeuGluLysCysPheGlnThr355360365GluAsnProLeuGluCysGlnAspLysGlyGluGluGluLeuGlnLys370375380TyrIleGlnGluSerGlnAlaLeuAlaLysArgSerCysGlyLeuPhe385390395400GlnLysLeuGlyGluTyrTyrLeuGlnAsnAlaPheLeuValAlaTyr405410415ThrLysLysAlaProGlnLeuThrSerSerGluLeuMetAlaIleThr420425430ArgLysMetAlaAlaThrAlaAlaThrCysCysGlnLeuSerGluAsp435440445LysLeuLeuAlaCysGlyGluGlyAlaAlaAspIleIleIleGlyHis450455460LeuCysIleArgHisGluMetThrProValAsnProGlyValGlyGln465470475480CysCysThrSerSerTyrAlaAsnArgArgProCysPheSerSerLeu485490495ValValAspGluThrTyrValProProAlaPheSerAspAspLysPhe500505510IlePheHisLysAspLeuCysGlnAlaGlnGlyValAlaLeuGlnThr515520525MetLysGlnGluPheLeuIleAsnLeuValLysGlnLysProGlnIle530535540ThrGluGluGlnLeuGluAlaValIleAlaAspPheSerGlyLeuLeu545550555560GluLysCysCysGlnGlyGlnGluGlnGluValCysPheAlaGluGlu565570575GlyGlnLysLeuIleSerLysThrArgAlaAlaLeuGlyVal580585590權利要求1.一種SEQIDNO1的表達盒，其包括GAL1酵母基因的啟動子區；MFα1酵母基因的分泌前原區；編碼具有成熟的人甲胎蛋白活性的蛋白質的DNA序列，以及CYC1酵母基因的轉錄終止區。2.根據權利要求1的表達盒，其中編碼具有成熟的人甲胎蛋白活性的蛋白質的所述DNA序列是編碼成熟的人甲胎蛋白(SEQIDNO2)或其具有一個或多個胺基酸殘基刪除、添加或置換的修飾形式的合成基因，所述修飾導致形成修飾的人甲胎蛋白，其序列至少80％對應成熟的人甲胎蛋白(SEQIDNO2)的胺基酸序列，在含修飾結構的所述產物中保留了成熟的人甲胎蛋白的功能生物學活性。3.一種重組的pKX質粒，其包括根據權利要求1或2的表達盒；細菌質粒pUC18的片段；2-μm酵母質粒的複製起始區；提供蛋白質正確裝配並將所需產物分泌到培養基中的KAR2基因；提供二硫鍵正確形成的PD11基因；選擇性的URA3和選擇性的PGK1酵母標記。4.一種通過用根據權利要求3的pKX質粒轉化的真核生產細胞，其具有分泌人重組甲胎蛋白的能力。5.一種生產細胞菌株啤酒糖酵母YBS723/pKX，其具有分泌人重組甲胎蛋白的能力，被保藏在俄羅斯國立工業微生物保藏中心(VKPM)，保藏號為Y-3115。6.一種製備重組甲胎蛋白的方法，所述重組甲胎蛋白具有血清來源的成熟人甲胎蛋白的生物學活性，其包括培養根據權利要求4的真核細胞，所述細胞具有將重組甲胎蛋白分泌到培養基中的能力，以及從所述培養基中分離所述重組甲胎蛋白的步驟。7.根據權利要求6的方法，其特徵在於真核細胞是酵母細胞。8.根據權利要求7的方法，其特徵在於酵母細胞是啤酒糖酵母菌株YBS723/pKX的細胞，所述菌株被保藏在俄羅斯國立工業微生物保藏中心(VKPM)，保藏號為Y-3115，並具有分泌重組甲胎蛋白的能力。9.根據權利要求8的方法，其特徵在於培養在23-33℃下在培養基中進行，所述培養基包括葡萄糖-2％、甘油-1.5％、酵母提取物-1％、蛋白腖-2％、蒸餾水；通過另外的緩衝作用使培養基的pH維持在4.5-7.0並加入可溶氧至p0＞20％。10.一種根據權利要求6的方法製備的重組甲胎蛋白，其具有成熟的人血清AFP的特性，所述特性根據免疫反應及其體外抑制B細胞Raji淋巴瘤細胞生長的能力在不低於成熟的人血清AFP活性的10％的水平上而進行確定。11.一種抑制腫瘤細胞生長的藥物組合物，其包括根據權利要求10的重組甲胎蛋白以及藥物學上可接受的載體和賦形劑。12.一種抑制腫瘤細胞生長的協同組合物，其包括根據權利要求10的重組甲胎蛋白和化學治療製劑以及藥物學上可接受的載體和賦形劑，所述化學治療製劑例如阿黴素、長春新鹼、氟尿嘧啶、metatrexate、放線菌素D、絲裂黴素C、它莫西芬、氟他胺、長春新鹼、長春鹼、環孢菌素C、視黃酸衍生物、類胡蘿蔔素、類固醇激素。13.一種治療癌症或阻止癌症發展的方法，其包括對有此需要的患者施用有效量的根據權利要求10的重組甲胎蛋白、根據權利要求11的藥物組合物或根據權利要求12的協同組合物。14.一種具有免疫抑制和免疫調節作用的協同組合物，其包括根據權利要求10的重組甲胎蛋白，和環孢菌素C，以及藥物學上可接受的載體和賦形劑。15.一種治療自身免疫性疾病並糾正免疫狀態的方法，其包括對有此需要的患者施用有效量的根據權利要求10的重組甲胎蛋白以及藥物學上可接受的載體和賦形劑或施用根據權利要求14的組合物。16.一種刺激幹細胞生長的藥物組合物，所述組合物包括根據權利要求10的重組甲胎蛋白以及藥物學上可接受的載體和賦形劑。17.一種刺激幹細胞生長的協同組合物，所述組合物包括根據權利要求10的重組甲胎蛋白，和維生素A、E、D的衍生物，抗氧化劑，類固醇激素，植物來源的異黃酮，以及藥物學上可接受的載體和賦形劑。18.一種在體外刺激幹細胞生長的方法，其包括用有效量的根據權利要求10的重組甲胎蛋白、根據權利要求16的藥物組合物或根據權利要求17的協同組合物作用於細胞。19.一種在體內刺激幹細胞生長的方法，其包括對有此需要的患者施用有效量的根據權利要求10的重組甲胎蛋白、根據權利要求16的藥物組合物或根據權利要求17的協同組合物。20.一種使皮膚更新並防止皮膚衰老的化妝品組合物，其包括根據權利要求10的重組甲胎蛋白，美容學上可接受的載體和賦形劑，以及任選的維生素A、E、D衍生物，抗氧化劑，類固醇激素，植物來源的異黃酮。21.一種利用根據權利要求20的化妝品組合物使皮膚更新並防止皮膚衰老的方法，其包括在個體皮膚上應用所述組合物。全文摘要本發明涉及微生物和醫藥行業、遺傳工程學、生物工藝學。在構建重組質粒DNA的基礎上獲得啤酒糖酵母酵母菌株，所述重組質粒DNA包括在調節啟動子控制下的人甲胎蛋白(AFP)的結構基因，所述菌株提供以被分泌的溶解形式合成和生產的AFP，這種AFP具有與人AFP活性相同或相似的活性。所獲得的重組AFP可以用作製備治療劑的活性物質，所述治療劑用於腫瘤學、免疫治療、美容學並且還用於癌症和胚胎病理診斷。文檔編號C12N15/12GK1993469SQ200580026165公開日2007年7月4日申請日期2005年7月7日優先權日2004年7月14日發明者S·V·別涅沃連斯基,A·N·馬爾琴科,D·G·科茲洛夫,S·S·扎採平,L·N·辛加洛娃,I·V·杜迪奇,L·N·謝冕科娃,D·I·杜迪奇,E·B·塔圖洛夫,E·I·杜迪奇申請人:生物系統股份有限公司