一種x-str基因座螢光標記複合擴增體系及其應用的製作方法

2023-06-04 05:14:51

專利名稱：：一種x-str基因座螢光標記複合擴增體系及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及檢測人體基因組中具有多態性的遺傳標記，尤其涉及X染色體遺傳標記技術，具體涉及一種X-STR基因座螢光標記複合擴增體系及其應用。
背景技術：
：短串聯重複序列(shorttandemr印eats，簡稱STR)是由27個鹼基對作為核心單位，串聯重複形成的一類微衛星DNA序列，其片段可採用PCR技術擴增。STR主要由於核心重複單位數目的變化形成了STR基因位點的遺傳多態性，其等位基因可用銀染、螢光標記和放射自顯影等技術分型。人類基因組中，平均每610kb就存在有一個STR基因位點，為法醫個人識別和親子鑑定提供了高信息基因位點的豐富來源。X染色體是人類性染色體，X染色體短串聯重複(X-chromosomalShortTandemR印eat，X-STR)是性染色體上一類多態性遺傳標記，男性的X-STR以單倍型形式存在只能從其母親中得到，且只能遺傳給女兒，因此同父所生的姐妹在X-STR基因座上有l個相同的等位基因，孫女X-STR基因座有1個等位基因與其祖母相同。X染色體這種獨特的遺傳方式，使得X-STR在親緣鑑定中有特殊的應用價值。在親緣鑑定中，有些沒有父母雙親參與檢測的特殊案件，如姐妹認親、同父異母的半同胞姐妹認親、隔代認親(祖母-孫女)等，用常染色體、Y染色體或線粒體的遺傳標記無法排除或認定，此時只有依靠X染色體STR才能起到直接排除或認定的作用。此外在有先天性缺陷的遺傳病中，可通過檢測X染色體STR來診斷有無X染色體多倍體、X染色體重複、X-STR重複序列長短等，同時，X染色體STR檢測可應用於X連鎖遺傳病、X染色體單親二倍體、X染色體失活的親源性等鑑定。從而為伴X染色體遺傳病提供產前診斷方法。因此，可以通過分析X染色體上的STR基因座的等位基因分型來確定親緣關係和用於伴X染色體遺傳病的產前診斷。X染色體STR位點廣泛存在真核細胞基因組中，高度穩定且具有較高的遺傳多態性，然而與常染色體和Y染色體STR相比，迄今發現和應用的X-STR位點數量較少，群體分布、突變率、連鎖平衡、基因結構等方面的信息尚不夠豐富，在法醫學、醫學等領域的應用受限，遠不及其他DNA遺傳標記廣泛。X染色體遺傳標記的研究在國內還處於初期，目前國際上商品化檢測試劑盒僅有德國ArgusX-8和Mentype⑧ArgusX_12，該類試劑盒在法醫學應用實踐中存在以下問題(1)採用這類試劑盒需要增加遺傳標記時遇到困難；(2)這些X-STR基因位點都是基於中國群體以外的群體(主要是白人群體)資料而開發的，其中有些基因位點，在中國群體的基因頻率分布較差，個人識別能力較低；(3)國外商品化試劑盒價格昂貴。這些缺點限制了X染色體遺傳標記在國內的應用，不利於進一步在基層推廣。
發明內容本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供一種適合於中國人群的，可以快速、方便針對常染色體STR、Y-STR難以排除或認定親緣關係的特殊檢案(姐妹認親、同父異母的半同胸姐妹認親、隔代認親等)進行鑑定的X-STR基因座螢光標記複合擴增體系。本發明的另一個目的在於提供上述X-STR基因座螢光標記複合擴增體系在為伴X連鎖遺傳病、X染色體單親二倍體、X染色體失活的親源性鑑定等提供產前診斷，以及姐妹認親、同父異母的半姐妹認親、隔代認親等親緣鑑定中的應用。本發明的上述目的是通過如下方案予以實現的—種X-STR基因座螢光標記複合擴增體系，該複合擴增體系共包含14個基因座DXS7133、DXS6801、DXS981、DXS6809、DXS7424、DXS6789、DXS9898、DXS7132、GATA165B12、DXSIOI、DXS10075、GATA31E08、DXS10074和DXS10079。本發明對上述14個X-STR基因座進行了研究，表明這14個基因座在中國人群中有高度的遺傳多態性和良好的等位基因頻率分布。—、本發明複合擴增體系中14個基因座的選擇(1)位於同一連鎖群內作為位於同一染色體的基因座，必須考慮到連鎖遺傳的問題。各基因座位於同一個連鎖群之內，呈連鎖遺傳，便於以單倍型觀察多態性。除GATA31E08外其餘13個基因座DXS7133、DXS6801、DXS981、DXS6809、DXS7424、DXS6789、DXS7132、GATA165B12、DXSIOI、DXS10075、DXS10074和DXS10079均位於第二連鎖群內，應呈連鎖遺傳。本發明的14個基因座分布於同一染色體上不同的位置，既有緊密連鎖者，也有遺傳距離相距較遠者。緊密連鎖的DXS7132-DXS10075-DXS10074-DXS10079;DXS7133-DXS7424-DXS101和DXS6801-DXS6809-DXS6789。它們分別位於Xql2、Xq21和Xq22區。緊密連鎖的基因座構成單倍型，在親緣鑑定中有利於分析親代與子代之間的遺傳關係。(2)易於擴增除上述14個基因座外，實驗初期發明人還選擇了另外一些位於X染色體第二連鎖群內的基因座，如ARA、DXS6800、DXS9905、DXS7130、DXS6797、DXS9895等。但單基因座擴增結果發現，這些基因座的擴增存在著一些問題，有的擴增的產物量少，顯帶過淺，甚至有時很難得到擴增產物，如DXS7130;有的很容易出現非特異帶(如影子帶)，如DXS6797;而上述14個基因座易於擴增穩定性好，結果清晰，非特異性帶很少。因此最後選擇了DXS7133、DXS6801、DXS981、DXS6809、DXS7424、DXS6789、DXS9898、DXS7132、GATA165B12、DXSIOI、DXS10075、GATA31E08、DXS10074和DXS10079這14個易於擴增，分型較好的基因座進行複合擴增。(3)擴增產物片段長度不重疊複合擴增各基因座片段大小的差距應大於20bp，各基因座的等位基因之間才不會發生重疊，幹擾分型。本發明的X-STR基因座複合擴增體系根據各基因座擴增產物片段長度大小，用同一螢光標記不同擴增產物片段長度(相差大於20bp)的基因座，保證複合擴增各基因座的等位基因之間不會發生重疊，不會干擾分型。用四種不同顏色的螢光標記多個基因座的引物，保證同一反應體系能同時擴增多個基因座，而不影響各基因座的分型。本發明的14個基因座引物分別用FAM、HEX、TAM、ROX四種不同顏色的螢光標記。體系中14個X-STR基因座其螢光組合方式為FAM螢光素標記DXS7133、DXS6801、DXS981和DXS6809，HEX螢光素標記DXS7424、DXS6789、DXS9898和DXS7132，TAMRA螢光素標記DXS165B12、DXS101和DXS10075，ROX螢光素標記GATA31E08、DXS10074和DXS10079。本發明提供一種同時分析多個X染色體STR基因座的螢光標記複合擴增體系，包括用於複合擴增分析的14個X-STR基因座的引物，全部14個基因座的引物混合在一個試管內。複合擴增體系中的基因座被位於該基因座兩側的一對引物擴增，其中每對引物中的引物正鏈的5'端用相應的螢光素標記。二、本發明複合擴增基因座的擴增本發明的X-STR基因座螢光標記複合擴增體系是採用複合PCR技術在同一反應管中同時擴增14個X-STR基因座。(l)PCR反應體系反應總體積為25iU:PCR反應緩衝液5.0iil，引物混合物5.0ii1，DNA聚合酶0.3iil，模板DNA2.0iil，消毒純淨水12.7ill。上述DNA聚合酶可選用本領域技術人員常用的DNA聚合酶，如金牌DNA聚合酶T叫Gold.)。(Ampl〗(2)PCR擴增參數:95°Cllmin94°C1min，^30個循環61°Clmin72°C1min60°C45min(3)ABIPRISM3100遺傳分析儀電泳分型擴增產物a.樣品準備GeneScanTM-500LIZsizestandard0.25pinkx樣品數去離子甲醯胺9.75^1混勻後瞬時離心，每管加10.0ill混合物，再加PCR產物1.0ii1，瞬時離心。95°C變性4min，放置冰盒中冷卻3min，取10.0變性後的樣品轉移至96孔樣品板，裝載入ABIPRISM3100遺傳分析儀進行電泳。b.電泳條件:14.7kV，130iiA，14.8mW。c.結果分析GeneM即perlDv3.1軟體。本發明的14個基因座已在發明人實驗室應用於群體學調查並獲得中國群體的分型結果，結果證明這些基因座多態性較高，適合於中國人群的檢測，並應用於實際檢案取得理想的結果。本發明的X-STR基因座螢光標記複合擴增體系也可以製成試劑盒，為姐妹認親和5隔代認親提供新的檢測系統，為X染色體相關性遺傳病進行產前診斷。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果1.靈敏度高本發明的X-STR基因座螢光標記複合擴增體系在模板量為0.lng時可檢出全部14個基因座；2.個體識別率高本發明的X-STR基因座螢光標記複合擴增體系中的14個X-STR基因座單倍型個體識別率達到0.9999992;3.本發明的X-STR基因座螢光標記複合擴增體系已在發明人實驗室用於檢測多代家系和多個小孩家系的樣本。結果在120例姐妹樣本中14個X-STR基因座分型均有1個相同等位基因。58例祖母-父親-孫女的三代家系中祖母的X-STR均通過父親穩定地傳遞給孫女。這結果表明本研究所選的基因座穩定性好，突變率低，分型結果準確，能滿足實際檢案的需要；4.本發明在國內首先研製出一組14個X-STR基因座同時在單一反應管中的複合擴增的五色螢光標記X-STR複合擴增檢測體系，達到目前國際上螢光標記X-STR基因座複合擴增試劑盒的最高水平；5.本發明的螢光標記引物複合擴增技術快速、方便，PCR產物可用310、377、ABIPRISM3100、3130等遺傳分析儀電泳，結果自動分析，能標準化、國際化，保證不同實驗室數據比較的正確性；6.本發明可製備一套試劑盒，可進行商品化，可以填補國內沒有X-STR基因座螢光複合擴增試劑盒的空白，也可補充國際X-STR基因座螢光複合擴增試劑盒的不足，作為具有中國特色的X-STR基因座複合擴增試劑盒，可用於親子鑑定、個體識別、性別鑑定、X連鎖遺傳病的基因定位，特別是用於產前診斷和姐妹認親、同父異母的半姐妹認親、隔代認親等親緣鑑定；7.本發明的X-STR基因座螢光標記複合擴增體系可以為伴X連鎖遺傳病、X染色體單親二倍體、X染色體失活的親源性鑑定等提供產前診斷方法，也為解決僅靠常染色體STR、Y-STR難以排除或認定親緣關係的某些特殊檢案(姐妹認親、同父異母的半同胞姐妹認親、隔代認親等)的親緣鑑定提供新的鑑定方法，具有廣泛的應用前景。圖1為實施例中祖母樣本的14個X-STR基因座複合擴增圖譜；圖2為實施例中孫女樣本的14個X-STR基因座複合擴增圖譜。具體實施例方式實施例1應用含有14個基因座的X-STR基因座螢光標記複合擴增體系進行姐妹認定和祖母與孫女的鑑定。原理X染色體是人類性染色體，X-STR是性染色體上一類多態性遺傳標記，男性的X-STR以單倍型形式存在只能從其母親中得到，且只能遺傳給女兒，因此同父所生的姐妹在X-STR基因座上有l個相同的等位基因。如果可疑姐妹樣本中所有X-STR基因座中有1個相同的等位基因，則不能排除其來自同一父親，如果有3個以上的X-STR基因座中無相同等位基因，則可以排除其來自同一父親。同樣孫女X-STR基因座有1個等位基因與其祖母相同，故可疑奶奶與孫女樣本中所有X-STR基因座中有1個相同的等位基因，則不能排除她們的親緣關係，如果有3個以上的X-STR基因座中無相同等位基因，則可以排除她們的親緣關係。操作步驟l.DNA提取Chelex-100法剪取4X4mm的血痕或唾液斑，加200ii110%Chelex-100，56。C烤箱過夜，置於PCR儀中IO(TC10min，振蕩30sec，10000r/min離心2min，4。C保存備用。2.PCR擴增PCR擴增反應總體系為25iil:PCR反應緩衝液(Buffer)5.0iU，引物混合物(PrimerPairMix)5.0ii1，金牌DNA聚合酶(AmpliTaqGold)0.3ii1，模板DNA2.0iil，消毒純淨水12.7iU。上述PCR緩衝液的配方為dNTP200iimol/L，MgCl21.5mmol/L，1XBuffer。上述引物混合物中，各個基因座的引物序列及其螢光標記如表1所示。表l14個X-STR基因座引物序列和螢光標記基因座引物序列螢光標記DXS7133F，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示麗R，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示DXS6801F，其核苷酸序列如SEQIDN0:3所示麗R，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示DXS981F，其核苷酸序列如SEQIDN0:5所示麗R，其核苷酸序列如SEQIDN0:6所示DXS6809F，其核苷酸序列如SEQIDN0:7所示麗R，其核苷酸序列如SEQIDN0:8所示DXS7424F，其核苷酸序列如SEQIDN0:9所示HEXR，其核苷酸序列如SEQIDNO:IO所示DXS6789F，其核苷酸序列如SEQIDNO:11所示HEXR，其核苷酸序列如SEQIDN0:12所示DXS9898F，其核苷酸序列如SEQIDN0:13所示HEX7tableseeoriginaldocumentpage8把注射器、毛細管、Buffer糟等拆下，用純水清洗，晾乾，灌膠注射器裡注入相當體積的P0P-4膠，排出空氣。Buffer糟裡盛lXBuffer溶液。雙擊Run3100DataCollectionVersion2.0軟體一點擊菜單欄中的Wizards—點擊FillCapillarywizards,對毛細管注膠一毛細管定位和樣品編輯。3)樣品準備GeneScan1M-500LIZ1Msizestandard0.25^1n}x樣品數去離子甲醯胺9.75(il混勻後瞬時離心，每管加10.0iil混合物，再加PCR產物1.0ia，瞬時離心。95t:變性4min，放置冰盒中冷卻3min，取10.0變性後的樣品轉移至96孔樣品板，裝載入3100遺傳分析儀進行電泳。4)電泳條件:14.7kV，130iiA，14.8mW。5)結果分析用GeneM即perlDv3.1軟體進行基因分型。分析結果如圖1和2所示，從圖中可以看出孫女樣本14個X-STR基因座的分型均有1個等位基因與爭議祖母相同，故支持爭議祖母與女孩存在祖母與孫女關係。具體案例案情2009年12月，某女士帶1個小女孩進行鑑定，檢點是否為她的孫女。具體鑑定過程採用前述的操作步驟DNA提取——PCR擴增——PCR擴增產物電泳——結果分析。結果解析如圖1和2所示，從圖可知，爭議祖母與女孩樣本DXS7133、DXS6801、DXS981、DXS6809、DXS7424、DXS6789、DXS9898、DXS7132、GATA165B12、DXSIOI、DXS10075、GATA31E08、DXS10074和DXS1007914個X-STR基因座的分型均有1個相同等位基因。即孫女樣本14個X-STR基因座的分型結果均有1個等位基因能從爭議祖母中找到，且14個基因座(DXS7133/DXS6801/DXS981/DXS6809/DXS7424/DXS6789/DXS9898/DXS7132/GATA165B12/DXS101/DXS10075/GATA31E08/DXS10074/DXS10079)的單倍型9/11/13/36/15/15/12/14/10/23/17/10/16/18或9/11/13/36/15/19/12/14/10/23/17/10/16/18尚未見報導，在本實驗室檢測500個無關個體仍未出現，故其頻率小於0.2X，LR值〉500。支持爭議祖母與女孩存在祖母與孫女關係。9權利要求一種X-STR基因座螢光標記複合擴增體系，該複合擴增體系共包含14個基因座DXS7133、DXS6801、DXS981、DXS6809、DXS7424、DXS6789、DXS9898、DXS7132、GATA165B12、DXS101、DXS10075、GATA31E08、DXS10074和DXS10079。2.根據權利要求1所述X-STR基因座螢光標記複合擴增體系，其特徵在於所述14個基因座是在一個複合擴增體系中同時擴增。3.根據權利要求1所述X-STR基因座螢光標記複合擴增體系，其特徵在於所述14個基因座引物分別用FAM、HEX、TAM或ROX四種螢光素標記。4.根據權利要求3所述X-STR基因座螢光標記複合擴增體系，其特徵在於所述複合擴增體系中，FAM螢光素標記DXS7133、DXS6801、DXS981和DXS6809，HEX螢光素標記DXS7424、DXS6789、DXS9898和DXS7132，TAMRA螢光素標記DXS165B12、DXS101和DXS10075，ROX螢光素標記GATA31E08、DXS10074和DXS10079。5.權利要求14所述的任一X-STR基因座螢光標記複合擴增體系在認定特殊的親緣關係檢案中的應用。6.權利要求14所述的任一X-STR基因座螢光標記複合擴增體系在作為檢測試劑對X染色體相關性遺傳病進行產前診斷中應用。全文摘要本發明公開一種X-STR基因座螢光標記複合擴增體系及其應用，該複合擴增體系共包含14個基因座DXS7133、DXS6801、DXS981、DXS6809、DXS7424、DXS6789、DXS9898、DXS7132、GATA165B12、DXS101、DXS10075、GATA31E08、DXS10074和DXS10079。本發明的14個X-STR基因座是在一個複合擴增體系中同時擴增，快速、方便，PCR產物經遺傳分析儀電泳，結果自動分析，能標準化、國際化，保證不同實驗室數據比較的正確性。文檔編號G01N21/64GK101787396SQ20101013637公開日2010年7月28日申請日期2010年3月26日優先權日2010年3月26日發明者劉秋玲,呂德堅,趙虎申請人:中山大學