神經生長因子蛋白的含量測定方法及其應用的製作方法
2023-06-19 08:40:06 1
專利名稱：神經生長因子蛋白的含量測定方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及神經生長因子蛋白的含量測定方法，具體地說，涉及小鼠神經生長因子的雙抗體夾心酶聯免疫測定方法。
背景技術：
神經生長因子(NGF)是神經系統最重要的生物活性分子之一，也是最早發現和最典型的神經營養因子，它影響外周和中樞神經系統某些神經元的存活和分化。通常NGF由其效應神經元支配的靶組織細胞合成和分泌，它與神經末梢上的相應受體結合後進入軸突，再經逆行軸漿轉運至胞體。在此過程中引起一系列的生物效應，如誘導突起生長，促進某些蛋白和酶的合成等。
雖然對於神經生長因子的測定已經有一些研究成果，但其測定的準確度差。因此，長期以來一直需要提供一種簡便準確的測定方法。本發明的發明人經過長期試驗，在小鼠神經生長因子的成品中，添加了保護劑和穩定劑，採用雙抗體夾心酶聯免疫測定方法，測定了神經生長因子的含量。
發明內容
本發明要解決的問題是提供一種NGF的蛋白含量測定方法，該方法包括(1)用抗體稀釋液稀釋包被抗體，並將所述抗體包被在聚苯乙烯微孔板上作為固相化抗體，其中所述的包被抗體用包被液配製使得其濃度為1～50μg/ml，每孔加10～360μl，0～10℃密封過夜；(2)棄去孔內液體，用洗滌液洗1～10次，除盡孔內殘液；(3)每孔加入封閉液50～360μl，室溫孵育30分鐘～3小時；(4)棄去孔內液體，用洗滌液洗1～10次，除盡孔內殘液；(5)每孔各加入10～360μl樣品或系列稀釋的標準品，室溫孵育30分鐘～5小時；(6)棄去孔內液體，用洗滌液洗1～10次，除盡孔內殘液；(7)每孔各加入10～360μl溶液抗體(0.1～10μg/ml)，室溫孵育30分鐘～5小時；(8)棄去孔內液體，用洗滌液洗1～10次，除盡孔內殘液；(9)每孔各加入10～360μl酶標抗體(1∶2000～1∶5000稀釋)，室溫孵育30分鐘～3小時；(10)每孔各加入10～360μl底物混合液，避光處靜置5～60min；(11)棄去孔內液體，用洗滌液洗1～10次，除盡孔內殘液；(12)每孔各加入5～360μl終止液，3～60min後利用酶聯儀在450nm的波長下測定該標準品的吸收值(OD450值)。
在本發明的一個優選實施方案中，該測定方法是雙抗體夾心酶聯免疫測定方法。
在本發明的一個優選實施方案中，該測定方法是一種mNGF的雙抗體夾心酶聯免疫測定方法。
在本發明的一個優選實施方案中，該測定方法中包被抗體是抗人神經生長因子單克隆抗體；溶液抗體是抗小鼠神經生長因子多克隆抗體。
在本發明的一個優選實施方案中，包被液濃度配製成含包被抗體5～50μg/ml，每孔加入量為100～360μl。
在本發明的一個優選實施方案中，洗滌液的用量為200～300μl/孔，每次洗滌分3～5次進行，以除盡孔內殘液。
在本發明的一個優選實施方案中，封閉液的加入量為200～360μl/孔，室溫孵育60分鐘～3小時。
在本發明的一個優選實施方案中，樣品或系列稀釋的標準品的加入量為100～360μl/孔，室溫孵育60～120分鐘。
在本發明的一個優選實施方案中，溶液抗體的濃度為1～10μg/ml，其加入量為100～360μl/孔，室溫孵育60～120分鐘。
在本發明的一個優選實施方案中，酶標抗體以1∶2000～1∶5000倍稀釋，每孔各加入100～360μl，室溫孵育30～60分鐘。
在本發明的一個優選實施方案中，每孔各加入100～360μl底物混合液，避光處靜置5～10min。
在本發明的一個優選實施方案中，每孔各加入50～360μl終止液，5～60min後測定OD450。
該測定方法可用來定性或定量檢測NGF的存在與否及其含量。
具體實施例方式
下面通過具體實施方式
描述本發明的方法，其用於說明本發明的內容，而非限制其範圍。
本發明方法中所用試劑、材料及設備如下所述包被抗體抗人神經生長因子單克隆抗體(anti hNGF monoclonalantibody)，進口；溶液抗體抗小鼠神經生長因子多克隆抗體(anti mNGF polyclonalantibody)，進口；酶標抗體辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L)，進口分裝；標準品mNGF應用國家藥檢所提供的標準品mNGF標定的工作標準，準確配製所需的各標準品濃度溶液；包被液PBS，pH7.4；封閉液1-3％BSA，5％sucrose，0.05％NaN3in PBS；洗滌液0.1～0.3％Tween20 in PBS，pH7.4；抗體稀釋液0.1％BSA，0.1～0.3％Tween20 in TBS，pH7.3(20mMTrizma base，150mM NaCl)；底物顯色液用前等體積混合底物顯色液A液和B液；終止液1M H2SO4；儀器與設備微孔板可拆卸96孔酶聯板，Costar產品；酶標儀、多道移液器等儀器設備使用前校準。
樣品準備樣品為注射用凍乾粉，測定前每支安瓿準確用注射用生理鹽水1ml溶解，再用抗體稀釋液根據需要稀釋。
實施例11.先用抗體稀釋液稀釋包被抗體後，用包被液配製5μg/ml包被抗體，並將其包被在聚苯乙烯微孔板上，作為固相化抗體，以3個孔做平行實驗，每孔加100μl，4℃密封過夜；2.棄去孔內液體，用洗滌液200-300μl/孔洗3-5次，除盡孔內殘液；3.每孔加入封閉液200μl，室溫孵育60min；4.重複步驟2，300μl/孔洗5次，除盡孔內殘液；5.每孔各加入100μl濃度為12.5ng/ml的標準品，室溫孵育60～120min；6.重複步驟4；7.每孔各加入100μl溶液抗體(1μg/ml)，室溫孵育60～120min；8.重複步驟4；9.每孔各加入100μl酶標抗體(1∶2000～1∶5000稀釋)，室溫孵育30～60min；10.重複步驟4；11.每孔各加入100μl底物混合液，避光處靜置5～10min；12.每孔各加入50μl終止液，5min後利用酶聯儀在450nm的波長下測定該標準品的吸收值(OD450值)。
實施例2-5重複實施例1的操作步驟進行實施例2-5，只是標準品的濃度分別為0ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml。根據各個濃度下標準品所測得的數據計算其平均值，根據得到的平均值繪製標準曲線。
實施例6-8重複實施例1的操作步驟進行實施例6-8，只是將其中的標準品分別替換為所測樣品1-3。利用得到的標準曲線，根據所測結果可以得出樣品中神經生長因子的測定結果。
樣品含量可以通過公式y(樣品濃度)＝a(截距)+b(斜率)×(OD450值)進行計算。實際樣品濃度需要乘以樣品稀釋倍數獲得。樣品1-3中的含量測定結果見下表1。
表1三批樣品測定結果
以上參考具體實施方式
描述了本發明內容，其只用於說明本發明的內容，而非用於限制本發明的範圍。本發明的範圍應當以所附權利要求書為準。本領域的普通技術人員根據本發明的描述進行的多種修改和變動都將落入本發明的精神和範圍內。
權利要求
1.一種神經生長因子的含量測定方法，所述方法包括將一種包被抗體定量包被在微孔板上，作為固相化抗體；向其中加入一定量樣品孵育後，洗去沒有結合的組分；再加入匹配量溶液抗體孵育；洗去沒有結合的組分後，利用酶標抗體與底物的顯色反應顯色；測定樣品吸收值，利用標準曲線，得出樣品含量。
2.一種神經生長因子的含量測定方法，該方法包括下述順序的步驟(1)用抗體稀釋液稀釋包被抗體，並將所述抗體包被在微孔板上作為固相化抗體，其中所述的包被抗體的濃度配製為1～50μg/ml，每孔加10～360μl，0～10℃密封過夜；(2)棄去孔內液體，用洗滌液洗1～10次，除盡孔內殘液；(3)每孔加入封閉液50～360μl，室溫孵育30分鐘～3小時；(4)棄去孔內液體，用洗滌液洗1～10次，除盡孔內殘液；(5)每孔各加入10～360μl樣品或系列稀釋的標準品，室溫孵育30分鐘～5小時；(6)棄去孔內液體，用洗滌液洗1～10次，除盡孔內殘液；(7)每孔各加入10～500μl濃度為0.1～10μg/ml的溶液抗體，室溫孵育30分鐘～5小時；(8)棄去孔內液體，用洗滌液洗1～10次，除盡孔內殘液；(9)每孔各加入10～360μl以1∶2000～1∶5000稀釋的酶標抗體，室溫孵育30分鐘～3小時；(10)每孔各加入10～360μl底物混合液，避光處靜置5～60min；(11)棄去孔內液體，用洗滌液洗1～10次，除盡孔內殘液；(12)每孔各加入5～360μl終止液，3～60min後測定吸收值，根據該吸收值得到樣品含量。
3.權利要求2的測定方法，其特徵在於所述NGF是mNGF。
4.權利要求2的測定方法其特徵在於包被抗體是抗人神經生長因子單克隆抗體；溶液抗體是抗小鼠神經生長因子多克隆抗體。
5.權利要求2的測定方法，其特徵在於用包被液配製的包被抗體的溶液中含有5～50μg/ml的包被抗體，每孔加入100～360μl，4～10℃密封過夜。
6.權利要求2的測定方法，其特徵在於每孔加入封閉液200～360μl，室溫孵育60分鐘～3小時。
7.權利要求2的測定方法，其特徵在每孔各加入100～360μl待測品，室溫孵育60～120分鐘。
8.權利要求2的測定方法，其特徵在每孔各加入濃度為1～10μg/ml的溶液抗體100～360μl，室溫孵育60～120分鐘。
9.權利要求2的測定方法，其特徵在於每孔各加入100～360μl以1∶2000～1∶5000倍稀釋的酶標抗體，室溫孵育30～60分鐘。
10.權利要求2的測定方法，其特徵在於每孔各加入100～360μl底物混合液，避光處靜置5～10min。
全文摘要
本發明涉及神經生長因子的蛋白含量測定方法，具體地說，涉及小鼠神經生長因子的雙抗體夾心酶聯免疫測定方法。該測定方法可用來定性或定量檢測NGF的存在與否及其含量。
文檔編號G01N33/52GK1790024SQ20041010147
公開日2006年6月21日 申請日期2004年12月16日 優先權日2004年12月16日
發明者陸仙芸, 林德君 申請人:浙江永寧製藥廠