一種埃裡希氏菌的螢光定量pcr檢測和分型的引物、探針及試劑盒的製作方法

2023-06-19 10:01:41

專利名稱：一種埃裡希氏菌的螢光定量pcr檢測和分型的引物、探針及試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及埃裡希氏菌感染的分子診斷的螢光定量PCR檢測和分型的引物、探針及試劑盒。
背景技術：
埃裡希氏菌是生存在單核白細胞和嗜中性白細胞的胞漿內的專性細胞內寄生菌。埃裡希氏菌病經蜱蟲傳播，在世界範圍內廣泛存在，引起人和多種動物(牛、狗、羊)以發熱和貧血為主要特徵的疫病。此病的臨床診斷主要依賴於流行病學和發病症狀，結合血液塗片的顯微鏡觀察法檢出埃裡希氏菌。臨床診斷的靈敏度較低，現有的血清學診斷方法不能區分感染後的康復者和臨床感染者。感染人畜的埃裡希氏菌的重要的種包括犬型E. canis,人型E. chafeensis和E. ewingii,牛型E. ruminatium,羊型E. ovina,鼠型E. muris。不同種的埃裡希氏菌感染宿主的專一性不強，而現有的分子診斷技術僅可以檢測單一種的埃裡希氏菌。本發明建立了一套高靈敏度和高特異性、快速的檢測埃裡希氏菌的、適合臨床使用的分子診斷方法。

發明內容
為了解決現有分子診斷技術只能檢測單一種埃裡希氏菌的不足，本發明提供一種快速、特異性強、靈敏度高、適合臨床使用的定量PCR檢測所有種的埃裡希氏菌的引物、探針及試劑盒。本發明的原理和核心是科學地設計擴增和檢測埃裡希氏菌的特異、高效的引物和探針。在保證設計的引物高效擴增埃裡希氏菌、設計的探針特異檢測埃裡希氏菌的同時，確保此引物和探針不擴增和檢 測其它類似的微生物(anaplasma無形體、Bartonella巴爾通體、Rickettsia立克次氏體、Neorickettsia新立克次氏體、Coxiella考克斯氏菌、Mycoplasma支原體)。此外，本發明設計的探針和不同種的埃裡希氏菌的基因序列有不同程度的差異(有1-3個鹼基的差異)，高解析度熔點曲線技術會顯示不同種埃裡希氏菌的熔解溫度的差異，這可以方便的用於基因分型。從GenBank (www. ncb1. nlm. nih. gov)獲取如下埃裡希氏菌以及相關細菌的16SrDNA的序列後,用Clustal Multiple Alignment Algorithm的方法對所有序列進行對齊無形體(基因序列號Anaplasma equi AF172167, Anaplasma platys M82801, AnaplasmaphagocytophiIum AY055469, Anaplasma bovis HQ913646, Anaplasma marginale AF309866和 AF414873),巴爾通體(Bartonella henselae AY513504),立克次氏體(Rickettsiarickettsia L36127)，考克斯氏菌(Coxiella burnetii D89798)，支原體(FR869692)，新立克次氏體(Neorickettsia helminthoeca U12457, Neorickettsia rickettsiaNR_029162),牛型埃裡希氏菌(Ehrlichia orCowdria ruminatium U03776, U03777, CR925678, DQ647616),鼠型埃裡希氏菌(Ehrlichia muris AB013008, AB196302),羊型埃裡希氏菌(Ehrlichia ovina AF318946),犬型埃裡希氏菌(Ehrlichia canis (GU810149),人型埃裡希氏菌(Ehrlichia chafeensis AF147752, ECU60476 ；Ehrlichia ewingiiM73227, U96436)。引物和探針的選擇基於對齊序列的保守區和變異區。附圖1、2、3、和4顯示設計的引物和探針上遊引物5』-GAGGATTTTATCTTTGTATTGTAGCTAA-3』 (SEQ ID NO.1)；下遊引物5』-TGTAAGGTCCAGCCGAACTGACT-3』 (SEQ ID NO. 2)；探針-1:5，-ACGCGAAAAACCTTACCACTTTTTGAC-6-FAM-3，(SEQ ID NO. 3)；探針-2:5『-LCred640 GAAGGTCGTATCCCT CTTAACAGG-phos (磷酸)_3』 (SEQ IDNO. 4)本發明還公開了埃裡希氏菌的螢光定量PCR檢測和分型試劑盒，該試劑盒由下列組成(I) 5x定量PCR反應液；22 ill ; (2) 22 ill的5x的探針和引物混合液有濃度為5 u M的上遊引物、5 ii M下遊引物、I ii M的探針-1、I ii M的探針-2。本發明進一步提供了一種埃裡希氏菌分型方法，該方法包括以下步驟(I)用上述引物和探針PCR擴增待測菌，擴增出210bp條帶，且螢光檢測在640nm波長增強的為埃裡希氏菌陽性樣本；(2) PCR完成後，對步驟(I)埃裡希氏菌陽性樣本擴增產物進行高解析度熔解曲線分析，根據熔解溫度對埃裡希氏菌進行分型，分型標準是E. chaffensis熔解溫度為一57. 5°C, E. ruminatium 溶解溫度為一56°C, E. canis/chafeensis/ovina/muris 的溶解溫度一63。。。

本發明能有效地檢測所有埃裡希氏菌的種，並基於高解析度熔點曲線技術，方便地區分 E. canis/ovina/muris/E. chafeensis, E. ewingii 和 E. ruminatium。和現有的傳統和分子診斷技術相比，本發明的技術優勢明顯，具有很高的特異性和敏感，且可以方便的檢測所有種的埃裡希氏菌，可廣泛的用於人和各種動物(牛、狗、羊)和人的埃裡希氏菌病的確診和治療判定，將會產生很好的經濟效益。


圖1 :埃裡希氏菌螢光定量PCR的上遊引物。上遊引物(5 』 -GAGGATTTTATCTTTGTATTGTAGCTAA-3 』)和重要種的埃裡希氏菌的 16S rDNA 序列顯不 100% 的吻合E. canis, E. chafeensis, E. ewingii, E. muris andE.ruminatium。圖2 :埃裡希氏菌螢光定量PCR的下遊引物。下遊引物(5，-TGTAAGGTCCAGCCGAACTGACT-3』)和重要種的埃裡希氏菌的16S rDNA序列顯示100%的吻合E. canis, E. chafeensis, E. ewingii, E. muris and E. ruminatium.下遊引物的序列和顯示的序列成反義關係。圖3 :埃裡希氏菌螢光定量PCR的6-FAM探針。此PCR 系統的 6-FAM 探針(5 』 -ACGCGAAAAACCTTACCACTTTTTGAC-6-FAM-3 』)和重要種的埃裡希氏菌的16S rDNA序列顯不100%的吻合E. canis, E. chafeensis, E. ewingii, E.muris and E. ruminatium。
圖4 :埃裡希氏菌螢光定量PCR的LCred640探針。此PCR 系統的 LCred640 探針(5 』 -LCred640 GAAGGTCGTATCCCTCTTAACAGG-phos-3』 )和重要種的埃裡希氏菌的16S rDNA序列顯示不同程度的吻合一個喊基的不同(E. canis, E. muris, E. chafeensis), 二個喊基的不同(E. ewingii)和三個喊基的不同(E. ruminatium)。圖5 :埃裡希氏菌的熔解溫度PCR完成後，對不同種的埃裡希氏菌(E. canis, E. chaffensis and E. ruminatium)的核酸的擴增產物進行高解析度熔解曲線分析，觀察不同種埃裡希氏菌的熔解溫度。LCRed640 探針和 E. canis/chafeensis/ovina/muris, E. chaffensis and E. ruminatium 的16S rDNA的序列顯示不同程度的差異。因此，高解析度熔解曲線分析顯示，E. chaffensis(—57. 5°C )和 E. ruminatiumC — 56°C )的溶角軍溫度低於 E. canis/chafeensis/ovina/muris的熔解溫度(一 63 °C)。
具體實施例方式本發明引物和探針(即埃裡希氏菌PCR特異性的確定)從三個方面保證本發明的PCR系統的特異性i)從GenBank獲取相關埃裡希氏菌及相關細菌的16S rDNA序列，用於埃裡希氏菌的科學合理設計。設計的二個引物和二個探針，被用於GenBank的BLAST搜尋，確認本發明的引物和探針擴增所有種的埃裡希氏菌，而不擴增其它類似的細菌；ii)用本發明的技術對不同株的埃裡希菌和其他細菌的DNA進行擴增，觀察不同擴增對象在PCR過程中螢光強度(640nm)的變化，和PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳的條帶的大小。結果顯示，僅埃裡希氏菌的DNA被有效的擴增，螢光在640nm波長增強，顯示陽性；而其它類似的細菌的PCR擴增的F2/F1螢光呈水平趨勢，沒有顯示隨著PCR循環的增加而出現螢光強度的增加；此外，埃裡希氏菌的16S rDNA的擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳顯示預期的210bp的條帶，其他類似的細菌核酸的擴增產物在`電泳沒有上述條帶；iii)對擴增的PCR產物進行進行測序，測序的結果和GenBank的序列進行比較。如上所述，合理設計的埃裡希氏菌螢光qPCR被實驗證實為，擴增所有種的埃裡希氏菌，而不擴增其他類似的細菌，具有極高的特異性。本發明的埃裡希氏菌螢光FRET-qPCR檢測方法所用引物和探針的核苷酸序列如下上遊引物5』-GAGGATITTATCTTTGTAITGTAGCTAA-3』 ；下遊引物5，-TGTAAGGTCCAGCCGAACTGACT-3，；探針-1:5』 -ACGCGAAAAACCTTACCACTTTTTGAC-6-FAM-3』 ；探針-2:5 『-LCred640 GAAGGTCGTATCCCT CTTAACAGG-phos-3J使用上述引物和探針進行檢測的過程如下1.製備 PCR 用的標準定量試劑(standard)。由 Intergrated DNA Technology 合成犬型埃裡希氏菌(E. canis)的16S rDNA的序列，此序列涵蓋PCR的2IObp的擴增區域。依據合成物的分子量和絕對重量以及PicoGreen的DNA定量技術，計算合成物所含的16SrDNA的基因拷貝數目。隨後，對合成物進行稀釋，製備每10 u I合成物的稀釋試劑含10000拷貝、1000拷貝、100拷貝、10拷貝的16SrDNA，作為PCR用的標準定量試劑。2.製備待檢樣品的DNA模板。疑似埃裡希氏菌感染者的全血(400 ill)保存在EDTA試管中用於 DNA 提取，純化的 DNA 洗脫在 IOOiil TltlEtll (含 IOmM Tris-HCl1O.1mM EDTA,PH8. 5)用於PCR模板。3. PCR擴增體系。20 U I的擴增體系包含10 U I的樣品DNA模板或者定量標準試劑(standard)、IxPCR緩衝液、Iii M上遊引物、Iii M下遊引物、0. 2 ii M的探針-1和0. 2 y M探針-2、2個單位的商業化Taq酶、200 ii M dNTP。4. PCR擴增循環參數。PCR擴增包括18個溫度遞減的高嚴謹循環(high-stringency step-down)和 25 個欠嚴謹的突光獲得循環(relaxed-stringencyfluorescence acquisition)。18個溫度遞減的高嚴謹循環6xl5sec@95° C, 60seci74° C;9xl5seci95° C, 60seci72° C; 3xl5seci95° C, 10seci70° C, 15seci72° C. 25個欠嚴謹的螢光獲得循環25xl5sec@95° C，8sec@58。C, 10seci65° C, andl5seci72° C。5.高解析度熔解曲線分析。PCR擴增結束後，立即實施高解析度熔解曲線分析，溫度從38° C上升到75° C，以每秒0.2° C/秒的速度遞增。數據分析是分析640nm:530nm(F2/Fl)的螢光強度的比例。F2/F1的第一衍生值(_d(F2/F1)/dt)被讀為該DNA的熔解溫度。6. PCR結果的判定和定量分析。DNA模板的製備過程均設有DNA提取的陰性和陽性對照，隨後的PCR擴增對象包括待測樣品的DNA模板、DNA提取的陰性和陽性對照、定量的標準試劑(每10 ill standard含104，103，102，IO1拷貝的埃裡希氏菌16S rDNA)。本發明的PCR擴增效率高，有效地擴增含IO1拷貝的埃裡希氏菌16S rDNA的standard。實施例1 :埃裡希氏菌的分子鑑定對經過臨床診斷、血塗片的顯微鏡觀察和血清學確診的10個患埃裡希氏菌的犬進行分子診斷。操作的流程如上所述，400 Ul的EDTA全血提取DNA用於PCR擴增。所有10個樣品均為埃裡希菌PCR 陽性，具有特徵的63-64° C熔解溫度(如圖5所示)。基因測序證實PCR的結果。實施例2 :犬埃裡希氏菌感染的分子流行病學調查對279隻來自加勒比海島國(St. Kitts)的犬進行體檢(血常規、生化試驗)、臨床檢測、血清學檢測(IDEXX SNAP4DX)和本發明的埃裡希氏菌PCR檢測。僅4%的犬的血塗片顯微鏡檢查為陽性，而本發明檢測犬的陽性率約為19%。SNAP4DX檢測表明，約24%的犬有抗埃裡希氏菌的抗體。通過對犬的健康狀況和不同診斷方法的對比表明，血塗片顯微鏡觀察法的靈敏度有限，不能檢測相對健康但是血常規異常的埃裡希氏菌的亞臨床感染者；血清學檢測方法不能區分感染後經治療後的康復犬和感染犬。本發明的埃裡希氏菌的螢光定量PCR技術，能準確地診斷臨床和亞臨床感染者，而且有效的區分感染後經治療後的康復犬和埃裡希氏菌的感染犬。
Unt it led. S T 2 5
SEQUENCE LISTING
揚州大學
一種埃ffl希R:菌的螢光定ftPCR檢測和分型的引物、探針及Ut劑盒

1(0- 4
PatentIn version 3.3
I
28 DNA 人TJt:列
I
gaggatttta tctttgtatt gtagctaa28
223
DNA
人丄序列
2
tglaaggtcc agccgaactg act23
3
27 DNA 人工序列
3
acgcgaaaaa ccttaccact ttttgac27
<2104
24
DNA 人丁序列
權利要求
1.一種埃裡希氏菌的螢光定量PCR檢測和分型的引物及探針，其特徵在於檢測引物為 上遊引物5 』 -GAGGATTTTATCTTTGTATTGTAGCTAA-3，； 下遊引物5』 -TGTAAGGTCCAGCCGAACTGACT -3』 ； 檢測探針為探針-1 :5』 - ACGCGAAAAACCTTACCACTTTTTGAC- 6-FAM -3』 ； 探針-2:5 LCred640 - GAAGGTCGTATCCCT CTTAACAGG-phos -3』。
2.—種埃裡希氏菌的螢光定量PCR檢測和分型試劑盒，包括5倍定量PCR反應液22Ul,以及22 的5倍引物和探針的混合液；所述引物和探針混合液含濃度為5 PM的上遊引物、5 PM下遊引物、I PM的探針-1、I PM的探針-2。
3.一種埃裡希氏菌分型方法，包括以下步驟 (1)用權利要求1所述引物和探針PCR擴增待測菌，擴增出210bp條帶，且螢光檢測在640nm波長增強的為埃裡希氏菌陽性樣本； (2)PCR完成後，對步驟(I)埃裡希氏菌陽性樣本擴增產物進行高解析度熔解曲線分析，根據熔解溫度對埃裡希氏菌進行分型，分型標準是麼chaffensis熔解溫度為一`57. 5°C, E. r 應應溶角軍溫度為一56。。，萬.can is /chafeensis /ovina/muris溫度一63 °C。
全文摘要
一種埃裡希氏菌的螢光定量PCR檢測和分型的引物、探針及試劑盒。所述引物序列如SEQIDNO.1和2所示，所述探針為SEQIDNO.3和4。用上述引物和探針PCR擴增待測菌，擴增出210bp條帶，且螢光檢測在640nm波長增強的為埃裡希氏菌陽性樣本；再根據熔解溫度可對埃裡希氏菌進行分型。本發明的技術優勢明顯，具有很高的特異性和敏感,且可以方便的檢測所有種的埃裡希氏菌,可廣泛的用於人和各種動物(牛、狗、羊)和人的埃裡希氏菌病的確診和治療判定，將會產生很好的經濟效益。
文檔編號C12Q1/10GK103060468SQ20131003437
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月30日 優先權日2013年1月30日
發明者王成明, 王志強, 許傳靈 申請人:揚州大學