作為紅細胞生成刺激劑的中鏈長脂肪酸類、甘油酯類和類似物的製作方法

2023-06-20 05:08:01

專利名稱：作為紅細胞生成刺激劑的中鏈長脂肪酸類、甘油酯類和類似物的製作方法
技術領域：
本發明涉及貧血的治療方法。包括與使用化療和放療相關的治療貧血的方法以及治療因慢性腎衰竭導致的貧血的方法或使用AZT(齊多夫定)治療HIV-感染的患者。本發明還涉及減輕藥物毒性和增強藥物功效。本發明特別涉及中鏈長脂肪酸類作為祖紅細胞，特別是紅系爆發集落形成單位(紅細胞)細胞或BFU-E細胞產生的刺激劑的應用，所述的中鏈長脂肪酸類諸如為癸酸、辛酸或其鹽或甘油三酯類或其單酸甘油酯類或二脂醯甘油酯類或其它類似物。
背景技術：
化療指的是應用細胞毒性劑根除癌細胞和腫瘤，所述的細胞毒性劑諸如，但不限於環磷醯胺、多柔比星、柔紅黴素、長春鹼、長春新鹼、博來黴素、依託泊苷、託泊替康、伊立替康、泰索帝、泰素、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、吉西他濱、順鉑、卡鉑或苯丁酸氮芥。然而，這些活性劑是非特異性的且特別在高劑量下，它們對正常和快速分裂的細胞具有毒性。這通常在進行化療和放療的患者中產生各種副作用。骨髓抑制，即在骨髓中血細胞產生嚴重減少是一種這類副作用。其特徵在於貧血、白細胞減少、中性粒細胞減少、粒細胞缺乏和血小板減少。嚴重的慢性中性白細胞減少的特徵還在於循環的中性白細胞數量選擇性減少和對細菌感染的易感性增加。
使用化療藥治療癌症的實質在於將細胞毒性機制與相對宿主細胞呈高度增殖的腫瘤細胞的選擇性機制結合。然而，罕有化療藥具有這類選擇性。化療藥的細胞毒性限制了對癌症患者的給藥劑量、影響其治療周期並嚴重危害其生命質量。
儘管其它正常組織也受到不良影響，但是骨髓對諸如化療或放療這類增殖特異性治療特別敏感。急性和慢性骨髓毒性是癌症化療的常見副作用，它導致血細胞計數下降和貧血、白細胞減少、中性白細胞減少、粒細胞缺乏和血小板減少。這類作用的一個原因在於由細胞毒性劑或放療對這些細胞的殺傷作用和多成熟髓室排空誘導的反饋作用機制引起的幹細胞分化導致的複製造血細胞(例如多能幹細胞和其它先祖細胞)數量減少。第二個原因在於還涉及直接(突變)和間接(幹細胞群老化)作用的幹細胞的自我更新能力下降(Tubiana，M.等《放療與腫瘤學》(Radiotherapy and Oncology)291-17，1993)。因此，癌症治療通常導致紅細胞或體循環中的紅細胞減少。
紅細胞為含有血紅蛋白且主要用於氧的運輸的無核雙凹形盤樣細胞。血紅蛋白是含有用於氧的四個結合位點的四肽。貧血指的是存在當特徵在於紅細胞比容測定的紅細胞數量、血紅蛋白量或血液中紅細胞壓積的低於正常值時的情況。將紅細胞比容或″紅細胞容積″看作貧血的特別可靠的指標。一般來說，在正常成年人中，女性和男性(在海平面上)的紅細胞計數(百萬/mm3)、血紅蛋白(g/100ml)和紅細胞比容或紅細胞壓積(ml/100ml)的平均值為4.8±0.6和5.4±0.9、14.0±2.0和16.0±2.0以及42.0±5.0和47.0±5.0，正如《Harrison內科學原理》(Harrison′s Principles of Internal Medicine)第8版，Appendix-表A-5，McGraw Hill(1977)中所述。在正常人中，紅細胞由骨髓產生且釋放在循環中，其中它們可以存活約120天。它們隨後被單核細胞-吞噬細胞系統除去。
貧血是不同疾病和疾患的症狀。因此，可以根據病因學對貧血分類。例如，再生障礙性貧血的特徵在於缺乏紅細胞再生且對治療有抗性。在這類患者中，存在骨髓樣細胞、紅細胞系和血小板生成幹細胞群明顯下降，導致各類血細胞減少。溶血性貧血因紅細胞存活期縮短和骨髓不能補償其生存期減少所致。它可能是遺傳性的或可能因化療、感染或自身免疫過程所致。缺鐵性貧血指的是特徵在於低鐵儲存或沒有鐵儲存、低血清鐵濃度、低血紅蛋白濃度或紅細胞比容等的貧血形式。鐵缺乏是最常見的貧血原因。最常見影響成年人的惡性貧血因胃黏膜無法分泌足夠的內因子而導致維生素B12吸收不良所致。鐮狀細胞性貧血因遺傳上確定的血紅蛋白合成缺陷所致。其特徵在於血液中存在鐮形的紅細胞。上述情況僅是對醫學而言已知的許多不同貧血中的典型。然而，在本發明的上下文中，特別關註解決與治療癌症中使用化療或放療相關的貧血。
按照《今日生物世界》(BioWorld Today)(第4頁；2002年7月23日)中公開的陳述，今年在美國有約120萬癌症患者進行細胞毒性化療且他們中約800,000或67％發生貧血。另外，貧血還與需要定期透析或腎移植才能存活的患者的腎病晚期有關。這屬於慢性腎衰竭或存在漸進且通常為不可逆的腎功能衰退的臨床情況範圍。
紅細胞生成素(EPO)是腎臟中產生的分子量為34,000的糖蛋白。EPO刺激骨髓中定型的紅細胞系造血祖細胞的分裂和分化(BFU-E細胞)並維持細胞存活力(抑制BFU-E和CFU-E細胞的編程性細胞死亡)。EPO的生物作用是受體介導的。在不同動物中胺基酸的同一性在人EPO與猴子EPO之間為92％且在人EPO與小鼠EPO之間為80％。EPO生物合成的主要刺激為組織低氧。然而，正如從上述觀察到的，EPO具有治療某些貧血的顯著治療潛能。例如EPO可以用於治療因內源性EPO產生減少導致的貧血，所述的內源性EPO產生減少可能因腎損傷或腎臟無功能所致(例如如上所述的慢性腎衰竭)。另一方面，EPO可以用於治療因骨髓損傷和隨後的祖紅細胞細胞(例如BFU-E細胞)增殖下降所致的貧血，所述的祖紅細胞細胞(例如BFU-E細胞)增殖下降可能因使用細胞毒性化療或放療治療癌症患者所致(也如上所述)。各種形式的重組EPO可以從市售得到。它們在用於其製備的表達系統及其位點和蛋白質糖基化程度方面不同。α型紅細胞生成素在CHO細胞中得到表達且購自商品名Procrit、Epogen或Eprex。如EPO，α型紅細胞生成素在天冬醯胺(Asn)殘基上帶有三個N-連接的糖基化位點Asn 19、Asn 33和Asn 78。β型紅細胞生成素在三個位點上N-糖基化，而ω型紅細胞生成素在Asn 24、Asn 28、Asn 83上N-糖基化且部分在絲氨酸(Ser 126)上O-糖基化。近來，已經證實過度糖基化形式的EPO含有五個N-連接的糖基化位點。它是購自Aranespe商品名的α型紅細胞生成素的緩慢或延長釋放形式。這種蛋白質因其血清半衰期延長約3-倍而與天然形式相比表現出增強的生物活性。然而，這些糖基化蛋白質的應用是昂貴的和受限的，因為必須通過重組技術生產它們。如果對患者″化學保護″以防止免疫抑制，那麼這類治療後的改善治療是不必要的。因此，對減輕因化療和放療誘發的骨髓抑制狀態的不理想副作用的新組合物和方法存在需求。
發明概述本發明通過提供刺激哺乳動物，包括人體內的造血系統的新方法滿足了對化學保護劑的需求。本發明還提供了治療化療和放療引起的骨髓抑制作用和刺激造血系統可以具有治療價值，但不限於貧血的任意其它情況的新方法。
按照該方法，可以對哺乳動物，特別是人給予顯著減少化療和放療副作用的有效量的組合物，該組合物包括在藥物上可接受載體中的癸酸、辛酸或金屬鹽(鈉、鉀、鈣、鎂)或其甘油三酯類或其單酸甘油酯或二脂醯甘油酯類或烷基酯類或其它類似物。
因此，本發明的一個目的是提供使用癸酸、辛酸或金屬鹽(鈉、鉀、鈣、鎂)或其甘油三酯類或其單酸甘油酯或二脂醯甘油酯類或烷基酯類或其它類似物的組合物，它們用於生產作為單一活性劑或作為兩種或多種活性劑與和/或不與其它和化療劑或誘導骨髓抑制狀態的這類藥物組合的化學保護藥物組合物。
本發明的另一個目的涉及癸酸、辛酸或鈉鹽或其甘油三酯類或其單酸甘油酯或二脂醯甘油酯類或相關化合物作為血細胞生成刺激因子的應用。
此外，本發明包括含有癸酸、辛酸或鈉鹽或其甘油三酯類或其單酸甘油酯或二脂醯甘油酯類或其它類似物的組合物和這類化合物在治療骨髓抑制和隨後的貧血和免疫抑制中的應用。
本發明的一個目的在於提供對哺乳動物，包括人提供有效化學保護作用的方法。
本發明的另一個目的在於提供有效增加化療和放療在哺乳動物，包括人中的功效的方法。
本發明的另一個目的在於提供使用更常用劑量乃至為獲得更好治療有益性而增加化療組合物劑量，同時避免副作用增加的方法。
本發明的另一個目的在於提供有效減輕或消除哺乳動物，包括人中化療誘發的貧血的方法。
本發明的另一個目的在於提供治療因慢性腎衰竭導致的貧血，尤其是患有晚期腎病的患者中的貧血的方法。
本發明的另一個目的在於提供治療因其它醫療過程，諸如矯形外科或使用諸如AZT這類其它藥物導致的貧血的方法。
最後，本發明的另一個目的在於提供使對接受者的不良作用降至最低或沒有不良作用的方法。
在綜述了如下公開實施方案的詳細描述和待批權利要求後，本發明的這些和其它目的、特徵和優點顯而易見。
發明詳述高劑量化療和放療破壞了骨髓中的造血細胞。患者隨之發生紅細胞、血小板和中性白細胞嚴重耗盡。貧血導致疲勞、缺乏精力和呼吸急促。血小板減少導致凝血時間延長和出血障礙。中性白細胞減少使患者處於感染增加的危險中。骨髓抑制是癌症治療中的劑量限定因素。
本發明涉及恢復患者造血系統的方法。目前用於該目的的方法利用了細胞因子或糖蛋白生長因子。例如，紅細胞生成素可以用於刺激反應性骨髓紅細胞系增殖和成熟。如果合適，批准在人體中使用紅細胞生成素用於治療貧血例如因不能產生足量紅細胞導致的貧血。然而，存在限制紅細胞生成素應用的局限。實際上，這些局限中的許多對重組糖蛋白細胞因子的醫學應用而言是常見的-可用性、毒性和功效，尤其是長期應用。例如，用重組人紅細胞生成素治療的某些患者對糖蛋白發生免疫反應，導致純紅細胞發育不良。當後者發生時，對重組蛋白發生的抗體也攻擊患者等同或內源性蛋白。患者隨之發生比藥物治療前更為惡化的貧血。
可以通過使用帶有碳鏈長為8(C8，辛酸或辛酸)或10(C10，癸酸或癸酸)的脂肪酸酯化甘油製備中鏈甘油三酯(類)(MCT)。MCT通常為C8和C10脂肪酸甘油酯類的混合物；然而，MCT還可含有少量(各自2±1％)的C6(己酸或己酸)和C12(正十二烷酸或月桂酸)甘油酯類。另一方面，長鏈甘油三酯(類)(LCT)由具有大於12個原子的碳鏈長度的脂肪酸酯化的甘油組成。存在於LCT中的典型脂肪酸類包括棕櫚酸(C16)和硬脂酸(C18)。不同於MCT，LCT是膳食脂肪的主要成分。實際上，MCT和LCT具有顯著不同的生物特性。MCT與LCT之間存在的某些生理差異描述在《Harrison內科學原理》(Harrison′s Principles ofInternal Medicine)第8版，1520-1521(1977)；第15版，1668-1669(2001)中。例如，與LCT相反，MCT不需要通過胰脂肪酶水解，這是因為它們被腸上皮細胞吸收。
MCT及其成分中鏈脂肪酸類是用於食品和藥物工業的無毒性物質。例如Traul，K.A.等(《食品與化學毒理學》(Food and ChemicalToxicology)3879-98，2000)描述了MCT已經用於逐步增加的大量食品和營養品應用，因為它們可以提供超過LCT的許多優勢。MCT還主要用作各種人和獸藥製劑和化妝品中的乳化劑。他們涉及了大量支持MCT安全性的毒理學研究。例如，他們注意到已經在臨床試驗中證實了MCT的人膳食消耗安全性至多達1g/kg的水平。C8和C10脂肪酸類具有相似的安全性和應用。例如，在The Mersk Index，第11版，266(1989)中，報導了辛酸具有的LD50(口服，大鼠)＝10.08g/kg，它基本上無毒性。實際上，按照聯邦管理法規(CFR)第184部分，美國食品與藥品管理局(FDA)已經批准了辛酸的GRAS(一般認為是安全的)確認。類似地，按照第172部分(CFR)，將游離脂肪酸類(例如癸酸、辛酸)及其金屬鹽看作用於食品的安全添加劑。正如Dimitrijevic，D.等注意到的(《製藥學和藥理學雜誌》(Journal of Pharmacy andPharmacology)53149-154，2001)，在日本和瑞典批准癸酸(鈉鹽)在人體應用中作為直腸藥物產品的吸收促進劑。美國專利US 4,602,040(1986)中描述了MCT作為藥物賦形劑的應用。更近來，PCT公開號WO01/97799中描述了中鏈脂肪酸類，特別是辛酸和癸酸作為抗菌劑的應用。
然而，直到本文公開的令人意外的發現為止，尚不了解中鏈脂肪酸類，諸如癸酸、辛酸或金屬鹽或其單酸甘油酯、二脂醯甘油酯類或甘油三酯類(MCT)或相關化合物在刺激從紅細胞系造血祖細胞產生紅細胞或紅細胞生成中的有效性。正如本文所述的，MCT可以包括C8(辛酸)和C10(癸酸)脂肪酸的甘油三酯類，它們構成了至少98％的涉及刺激造血作用和紅細胞生成的活性。前一種活性描述在我們的PCT公開號WO 02/83120中，而在上述文獻中並未描述刺激紅細胞生成和治療貧血。實際上，這一發現是完全令人意外的，因為文獻中幾乎沒有報導有關低於糖蛋白的分子量或小分子能夠刺激紅細胞生成。Wrighton，N.C.等描述了紅細胞生成素模擬肽(EMP)的合成二聚化形式(《天然生物技術》(Nature Biotechnology)151261-1265，1997)。儘管明顯小於紅細胞生成素，但是EMP是在每種單體中含有20個胺基酸的多肽。更重要的是，EMP的活性明顯低於紅細胞生成素。更近來，PCT公開號WO 02/19963中描述了合成的紅細胞生成蛋白(SEP)作為具有紅細胞生成素樣生物活性的合成穩定多肽。報導的SEP的優點在於它是通過化學合成而非通過相對更昂貴的重組技術製備的穩定的相對長半衰期的分子。通過引入乙二醇單元(例如PEG)獲得穩定且由此可以將附加水平的複雜性引入SEP製劑。總之，現有技術中教導了刺激紅細胞產生需要應用較大的多肽或蛋白質分子。
本發明涉及中鏈脂肪酸類或其金屬鹽或甘油三酯類或其單酸甘油酯、二脂醯甘油酯類或其它類似物或MCT組合物作為紅細胞生成活化或生長因子，且它具體地說作為祖紅細胞細胞產生刺激劑的應用。當用於化療和放療時，在治療前、過程中和/或之後給予中鏈脂肪酸類或其金屬鹽或甘油三酯類或其單酸甘油酯或二脂醯甘油酯或其它類似物或MCT以縮短貧血期限並加速造血系統補充。此外，能夠在使用化療和放療的多點處(例如在治療前使用脂肪酸和之後使用MCT)使用中鏈脂肪酸類與其金屬鹽或甘油三酯類或其單酸甘油酯或二脂醯甘油酯或其它類似物和/或MCT的組合。另一方面，能夠在使用化療和放療之前、過程中和/或之後同時給予該組合。在因EPO產生減少導致的嚴重貧血中，中鏈脂肪酸類或其金屬鹽或甘油三酯類或其單酸甘油酯或二脂醯甘油酯或其它類似物或MCT用作治療劑。還可以在骨髓移植後使用中鏈脂肪酸類或其金屬鹽或甘油三酯類或其單酸甘油酯或二脂醯甘油酯或其它類似物或MCT以便刺激骨髓幹細胞，由此縮短從貧血中恢復的時間期限。
本文所用的″中鏈脂肪酸類，諸如癸酸或辛酸或其金屬鹽或甘油三酯類或其單酸甘油酯類或二脂醯甘油酯類或其它類似物或MCT組合物″指的是包括所述活性組分和一種或多種藥物上可接受的載體的組合物。
本文所用的術語″藥物上可接受的載體″指的是不會干擾中鏈脂肪酸類，諸如癸酸或辛酸或其金屬鹽或甘油三酯類其單酸甘油酯類或二脂醯甘油酯類或其它類似物或MCT組合物的生理作用且對哺乳動物，包括人無毒性的物質。
可以使用癸酸或辛酸或其鹽或甘油三酯類或其單酸甘油酯類或二脂醯甘油酯類或其它類似物或MCT和藥物上可接受的載體通過本領域技術人員公知的方法配製本發明的癸酸或辛酸或其鹽或甘油三酯類或其單酸甘油酯類或二脂醯甘油酯類或其它類似物或MCT組合物(MerckIndex，Merck Co.，Rahway，NJ)。這些組合物包括，但不限於固體、液體、油、乳劑、凝膠、氣溶膠、吸入劑、膠囊、丸劑、貼劑和栓劑。
所有方法均包括是使活性組分與構成一種或多種輔助組分的載體混合的步驟。
本文所用的術語″化療″指的是使用細胞毒性劑殺傷增殖細胞的過程。術語″化療過程中″指的是給予細胞毒性劑的作用持續的期限。另一方面，術語″化療後″用以包括給予細胞毒性劑後給予組合物的所有情況而與給予的細胞毒性劑的作用持久性無關。
當將本發明的方法應用於化療時，可以在化療前、過程中或之後(即給予細胞毒性劑前、過程中或之後)給予癸酸或辛酸或其鹽或甘油三酯類或其單酸甘油酯類或二脂醯甘油酯類或其它類似物或MCT組合物。
所謂″細胞毒性劑″是指殺傷顯著增殖的細胞的活性劑，所述顯著增殖的細胞例如為腫瘤細胞、病毒感染的細胞或造血細胞。可以用於實施本發明的細胞毒性劑的實例包括，但不限於環磷醯胺、多柔比星、柔紅黴素、長春鹼、長春新鹼、博來黴素、依託泊苷、託泊替康、伊立替康、泰索帝、泰素、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、吉西他濱、順鉑、卡鉑或苯丁酸氮芥和任意上述化合物的激動劑。細胞毒性劑還可以為抗病毒藥例如AZT(即3′-疊氮基-3′-脫氧胸苷)或3TC/拉米夫定(即3-硫胞苷)。
本文所用的術語″化學保護″指的是為防止哺乳動物發生因使用化療劑治療哺乳動物產生的毒性作用的保護作用。最常見的是，化療劑是細胞毒性劑，其治療作用因幹擾或抑制DNA複製、RNA轉錄或隨後的蛋白質翻譯的某些方面的能力而產生。因此，化學保護劑指的是對哺乳動物給予的防止哺乳動物發生因使用化療劑治療哺乳動物產生的毒性作用或有利於動物恢復的任意化合物。
可以診斷貧血且其嚴重程度可以由本領域技術人員確定。術語″貧血″可以指當發生紅細胞數量、血紅蛋白量或紅細胞壓積低於正常值的減少時存在的情況。這類臨床標準可變。不受限制，貧血可以是循環紅細胞量減少的結果。還可以由本領域技術人員確定治療功效。可以提供治標效應。
在一個優選的實施方案中，所述的藥物組合物為任意合適的用於治療貧血的口服、舌下、直腸、局部給藥或吸入(鼻腔噴霧)、肌內、真皮內、皮下或靜脈內給藥的組合物形式。
可以理解用於治療所需的本發明組合物的量將根據給藥途徑、所治療疾病的性質、患者年齡和情況的不同而改變且最終由參與的臨床醫師決定。所需劑量通常可以以單劑量或作為在合適的間隔採用的分次劑量提供，例如根據需要每天兩次、三次或三次以上以進行或開始治療。術語″治療(treatment)″或″治療(treating)″包括對哺乳動物中存在的疾病或疾患的任意療法和預防所述疾病或疾患(例如貧血)。包括(a)預防可能易感疾病但尚未診斷為患有該病的患者發生疾病或疾患；(b)抑制或阻止疾病或疾患發展；和(c)通過使一種或多種症狀消退或改善緩解疾病或疾患。
儘管為用於治療，可以將中鏈脂肪酸類或其金屬鹽或甘油三酯類其單酸甘油酯類或二脂醯甘油酯類或其它類似物或MCT作為原料給藥，但是優選將所述的活性藥物組分製成藥物製劑或組合物。通過混入任意常用的賦形劑製成無毒性組合物，諸如，但不限於甘露糖醇、乳糖、海藻糖、澱粉、硬脂酸鎂、滑石粉、纖維素、羧甲基纖維素、葡萄糖、明膠、蔗糖、甘油、碳酸鎂、檸檬酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉和甘氨酸。
在本發明優選的實施方案中，活性組分給藥量使得在血液中的濃度(游離和/或與血清清蛋白結合的)大於1μm。在其它實施方案中，在血液中的濃度可以大於1mM。在本發明另一個優選的實施方案中，有必要達到足夠的活性藥物組分局部濃度以獲得在靶組織(例如骨髓)中的生物或醫療顯著作用。至少在靶組織上需要相對高濃度的活性藥物組分，因為必需使本發明癸酸或辛酸或其鹽或甘油三酯類或其單酸甘油酯類或二脂醯甘油酯類或其它類似物或MCT組合物形成膠束或聚集物結構以引起生物反應。單劑量可以由約1g-約10g(及其任意中間範圍)的活性組分總量組成。
在另一個實施方案中，所述的藥物組合物可以為適合於腸內、黏膜(包括舌下、肺和直腸)或非腸道(包括肌內、真皮內、皮下和靜脈內)給藥的形式。如果合適，可以將製劑便利地製成分散劑量單位且可以通過任意製藥領域眾所周知的方法製備。所有方法均包括將活性藥物組分與液體載體或固體載體細粉或它們兩者緊密混合且然後如果必要使形成所需形式的步驟。如果需要，可以使用適合於使活性藥物組分緩釋的上述製劑。本領域眾所周知的緩釋製劑包括使用脂質體、生物相容性聚合物、快速濃注或連續輸注。
還可以將中鏈脂肪酸類或其金屬鹽或甘油三酯類其單酸甘油酯類或二脂醯甘油酯類或其它類似物或MCT與其它治療活性劑，諸如細胞毒性抗癌藥或其它抗癌藥(免疫調製或調節藥或治療疫苗或抗血管生成藥等)或免疫抑制藥(包括消炎藥)聯用。可以依次或同時在單獨或組合的藥物製劑中給予這類組合中的各個成分。可以將上述涉及的這種組合呈藥物製劑的所用形式且由此本發明的另一個方面包括了含有上述定義的組合及其藥物上可接受的載體的藥物製劑。
具體實施例方式
實施例下面進一步解釋本發明的實施，但不用來限定本發明。
實施例1化學保護研究MCT對免疫細胞增殖或保護的體內誘導通過用在第0天時靜脈內給予200mg/kg環磷醯胺(CY)或80mg/kg 5-氟尿嘧啶(5-FU)治療使6-8周齡的雌性C57BL/6小鼠免疫抑制。為了檢驗MCT或其它化合物的免疫保護作用，在使用所述化合物的第0天的前3天、前2天和1前1天時經口服預治療小鼠。在第5天時通過心臟穿刺和脫頸椎處死小鼠。然後記錄股骨(作為骨髓細胞來源)的總體病理觀察結果。
表1表示了在有化合物存在或沒有化合物存在下在環磷醯胺免疫抑制動物中獲得的股骨總體病理觀察結果。結果證實正常小鼠的股骨具有鮮紅的顏色，表明定向造血幹細胞及其子代的增殖狀態。當使用環磷醯胺治療時，骨髓的造血細胞貧耗且具有透明的″白色″外觀，表明來源於骨髓的定向造血幹細胞增殖受到抑制。然而，在細胞毒性誘導的免疫抑制情況下，添加MCT、辛酸甘油酯、癸酸甘油酯、癸酸或癸酸鈉使環磷醯胺的作用逆轉。這使股骨產生紅色外觀，表明定向造血幹細胞，特別是紅細胞群擴充。當用5-氟尿嘧啶(5-FU)誘導免疫抑制時，觀察到了相同結果。
表1環磷醯胺(CY)、CY+MCT、CY+辛酸甘油酯、CY+癸酸甘油酯、CY+癸酸和CY+癸酸鈉對來自股骨的骨髓外觀的作用總體病理觀察結果。

實施例2化學保護研究免疫細胞增殖或保護的體內誘導癸酸甘油酯、癸酸和癸酸鈉的比較按照實施例1中所述的方案進行癸酸甘油酯、癸酸和癸酸鈉對體內免疫細胞增殖或保護的誘導的作用。在處死動物後，將組織在PBS緩衝液中攪碎並用血細胞計數器對細胞進行計數。
通過在環磷醯胺治療小鼠中使用癸酸甘油酯、癸酸或癸酸鈉口服預治療觀察到脾紅細胞計數顯著增加(附

圖1)。此外，與未免疫抑制的動物(對照組)相比，某些治療的動物在脾紅細胞計數方面恢復到了″基線水平″。
實施例3化學保護研究免疫細胞增殖或保護的體內誘導癸酸鈉的口服和靜脈內劑量反應按照實施例1中所述的方案進行口服和靜脈內給予癸酸鈉對體內免疫細胞增殖或保護的誘導的作用。在處死動物後，將組織在PBS緩衝液中攪碎並用血細胞計數器對細胞進行計數。通過在環磷醯胺治療小鼠中使用癸酸鈉口服和靜脈內給藥預治療觀察到脾紅細胞增殖計數顯著增加(附圖2)。此外，靜脈內給予癸酸鈉使脾紅細胞計數增加到了對照組小鼠(未免疫抑制)的″基線水平″。
實施例4化學保護研究紅細胞增殖或再生的體內誘導與GM-CSF比較按照實施例1中所述的方案進行口服和靜脈內給予癸酸鈉和GM-CSF對體內免疫細胞增殖或保護的誘導的作用。在處死動物後，將組織在PBS緩衝液中攪碎並用血細胞計數器對細胞進行計數。通過在環磷醯胺治療小鼠中使用癸酸鈉和GM-CSF(高濃度，1μg/kg)觀察到骨髓紅細胞計數顯著增加(附圖3)。此外，當與GM-CSF聯用時，發生骨髓紅細胞計數累積性增加。
另外，當單獨使用癸酸鈉時，它能夠誘導如附圖4中所示的外周血細胞數量顯著增加。
實施例5貧血模型癸酸鈉對骨髓集落形成單位(CFU)增殖/分化或保護的離體誘導為了檢驗癸酸鈉在貧血模型中的免疫保護或免疫恢復作用，使用化合物在前3天、前2天和前1天經靜脈內預治療BALB/c小鼠。通過用在第0天對6-8周齡雌性BALB/c小鼠經腹膜內給予60mg/kg苯肼來誘發貧血。在第6天時通過心臟穿刺和脫頸椎處死小鼠。然後從股骨中獲取骨髓細胞。用PBS衝洗和洗滌細胞。基於活細胞計數，以5×105個細胞/ml的濃度將細胞重新懸浮於補充了2％FBS的IMDM培養基中。將來自這些細胞的兩個一式兩份的3×104個細胞/平皿平板接種在Methocult培養基中，使得可以進行集落形成單位(CFU)形成試驗。在2-3天培養後記錄CFU-E和BFU-E。14-16天培養後記錄CFU-GM和CFU-GEMM。
正如附圖5中解釋的，癸酸鈉增加了正常小鼠的CFU-E和CFU-GEMM數量。在苯肼誘發的貧血小鼠中，癸酸鈉誘導CFU-E、CFU-GM和CFU-GEMM顯著增加。
實施例6癸酸甘油酯和辛酸甘油酯增加體外人骨髓細胞的增殖骨髓細胞獲自癌症患者的胸骨。用PBS洗滌細胞並以2×106個細胞/ml的濃度重新懸浮。將細胞在37℃下和有或沒有癸酸甘油酯或辛酸甘油酯存在下的RPMI/FBS培養基中培養48-72小時。溫育後，用1μCi的[3H]-胸苷將細胞脈衝6小時。用Tomtec收集平板並用Microbeta β-計數器計數。DNA中摻入[3H]-胸苷是細胞增殖中的直接指示。
附圖6表示癸酸甘油酯對骨髓增殖的作用的典型實驗。與對照組相比癸酸甘油酯將骨髓增殖增加了3-4倍。此外，當與紅細胞生成素(EPO)聯用時，分別在48和72小時時出現骨髓增殖的累積或協同增加。
附圖7表示辛酸甘油酯對骨髓增殖作用的典型實驗。與對照組相比辛酸甘油酯將骨髓增殖增加了2倍。此外，當與紅細胞生成素(EPO)聯用時，出現骨髓增殖的協同增加。
實施例7癸酸甘油酯增加體外人骨髓BFU-E(祖紅細胞細胞)集落形成和CFU-GEMM增殖骨髓細胞獲自不同癌症患者的胸骨。用PBS洗滌細胞並以2×106個細胞/ml的濃度重新懸浮。將細胞在37℃下和有或沒有癸酸甘油酯存在下的RPMI/FBS或Myelocult(幹細胞技術，Vancouver)/FBS培養基中培養5天。溫育後，收集、洗滌並計數細胞。基於活細胞計數將細胞以5×105個細胞/ml的濃度重新懸浮於補充了2％FBS的IMDM培養基中。將來自這些細胞的四個一式兩份的2.5×104個細胞/平皿平板接種在Methocult培養基中，使得可以進行集落形成單位(CFU)形成試驗。在14-16天培養後記錄CFU-GM、CFU-GEMM和BFU-E。
表2和3表示癸酸甘油酯對RPMI/FBS培養基中骨髓細胞集落形成的作用的兩次實驗。癸酸甘油酯的存在增加了CFU-GEMM數量(達3倍)和BFU-E集落形成(達13倍)。後一種細胞是紅細胞的先祖細胞。
表4和5表示證實癸酸甘油酯對Myelocult/FBS培養基中骨髓集落形成的作用的兩次實驗，所述的Myelocult/FBS培養基是更富集的培養基(補充了其它生長因子)。癸酸甘油酯的存在增加了CFU-GEMM數量(達2倍)和BFU-E集落形成(達6倍)，它們是紅細胞的先祖細胞。
表2癸酸甘油酯對體外在RPMI/FBS培養基中培養的人定向造血幹細胞(CFU形成)的作用

表3癸酸甘油酯對體外在RPMI/FBS培養基中培養的人定向造血幹細胞(CFU形成)的作用

表4癸酸甘油酯對體外在Myelocult/FBS培養基中培養的人定向造血幹細胞(CFU形成)的作用

表5癸酸甘油酯對體外在Myelocult/FBS培養基中培養的人定向造血幹細胞(CFU形成)的作用

*CFC＝瓊脂集落生成細胞
權利要求
1.包括通式I、II、IIa、III和IIIa的化合物或其組合的組合物在製備用於刺激紅細胞生成的藥物中的應用 R1-CO-OR2II(R1-CO-O)kMIIaR1-Z-SO2-OR2III(R1-Z-SO2-O)kMIIIa其中R1各自獨立為C7-11烷基；A和B獨立為H或CO-R1；R2為H或C1-4烷基；M為金屬一價陽離子(k＝1)或二價陽離子(k＝2)；Y為O或NH；且Z為O、NH、CH2O或鍵。
2.權利要求1的應用，其中所述的組合物包括至少兩種通式I的化合物，它們為中鏈甘油三酯類(MCT)，其中R1各自為直鏈或支鏈飽和或不飽和C7或C9烷基。
3.權利要求2的應用，其中所述的混合物包括帶有R1各自為CH3(CH2)8-的第一種MCT。
4.權利要求2或權利要求3的應用，其中所述的組合物進一步包括各自為0.1％-3％的第三種通式I的化合物，其中R1各自為CH3(CH2)4-；和第四種通式I的化合物，其中R1各自為CH3(CH2)10-。
5.權利要求2的應用，其中所述的混合物包括由如下結構式所述的C8和C10脂肪酸甘油三酯類的四種幾何異構體
6.權利要求1的應用，其中所述的組合物包括通式II的化合物，它帶有的R2為氫且為中鏈脂肪酸。
7.權利要求1的應用，其中所述的組合物包括通式III的化合物，它帶有的R2為氫。
8.權利要求1的應用，其中所述的組合物包括通式IIa的化合物且其中M為選自鈣、鎂、鉀和鈉的金屬抗衡離子。
9.權利要求1的應用，其中所述的組合物包括通式IIIa的化合物且其中M為選自鈣、鎂、鉀和鈉的金屬抗衡離子。
10.任意上述權利要求的應用，其中所述的組合物包括辛酸或癸酸.
11.任意上述權利要求的應用，其中所述的組合物包括辛酸鈉或癸酸鈉。
12.任意上述權利要求的應用，其中所述的組合物包括辛酸鈉或癸酸鈣。
13.任意上述權利要求的應用，其中所述的組合物包括辛酸甘油三酯或癸酸甘油三酯。
14.任意上述權利要求的應用，其中至少一種化合物的存在量使得它在血液中的濃度大於1μM。
15.任意上述權利要求的應用，其中所述的組合物進一步包括人紅細胞生成素。
16.任意上述權利要求的應用，用於治療因化療導致的貧血。
17.任意權利要求1-15中的應用，用於治療因放療導致的貧血。
18.任意權利要求1-15中的應用，用於治療慢性貧血。
19.任意權利要求1-15中的應用，用於治療暫時性貧血。
20.任意權利要求1-15中的應用，用於治療因慢性腎衰竭導致的貧血。
21.任意權利要求1-15中的應用，用於治療因晚期腎疾病導致的貧血。
22.任意權利要求1-15中的應用，用於治療藥物誘發的貧血。
23.任意權利要求1-15中的應用，用於治療因醫療或外科手術導致的貧血。
24.任意權利要求1-15中的應用，用於增加哺乳動物體內的紅細胞產生。
25.任意權利要求1-15中的應用，用於增加哺乳動物體內的血紅蛋白產生。
26.任意權利要求1-15中的應用，用於增加哺乳動物紅細胞比容。
27.任意權利要求1-15中的應用，用於增加哺乳動物體內的紅細胞系造血祖細胞產生。
28.任意權利要求1-15中所述的組合物，用於治療應用。
29.包括如權利要求1-14中任一項定義的任意通式I、II、IIa、III和IIIa中的至少一種化合物和人紅細胞生成素的產品，作為用於療法中分別、同時或依次應用的聯用製劑。
全文摘要
包括通式I、II、IIa、III和IIIa任一項的化合物或其組合的組合物在製備用於刺激紅細胞生成的藥物中的應用，其中R
文檔編號A61K31/20GK1753665SQ200480004978
公開日2006年3月29日 申請日期2004年2月6日 優先權日2003年2月7日
發明者C·賓尼, L·加農, P·勞倫, B·扎克利 申請人:普羅米蒂克生物科學公司