一種採用複合酶法提取金銀花中綠原酸的方法

2023-06-19 09:23:16

專利名稱：：一種採用複合酶法提取金銀花中綠原酸的方法
技術領域：
：本發明屬於中藥材提取
技術領域：
，涉及從具有清熱解毒和抗菌消炎的金銀花中提取藥用有效成分綠原酸的新工藝。更具體的說是通過單因素試驗和正交試驗，優化出複合酶法提取金銀花中綠原酸的最佳工藝。
背景技術：
：金銀花為忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb)的乾燥花蕾或帶初開的花，為常用清熱解毒和抗菌消炎的中藥材之一(蘆緒芳.金銀花的研究現狀[J].時珍國醫國藥，2006，17(5):843-844)。其化學成分為綠原酸、異綠原酸、揮髮油、咖啡酸、黃酮類化合物、三萜皂苷、木犀草素等(吳曉春，楊蘇亞.金銀花的成分及藥理作用分析[J].青海醫藥雜誌，2007，37(5):88-89)。其中綠原酸是金銀花的主要藥效活性成分，用來評價金銀花的質量。綠原酸是胞內物質，其細胞壁主要由纖維素組成，纖維素酶是可將纖維素水解成水溶性糖的複合酶類。(劉翔，何國慶.纖維素酶及相關酶在食品生物技術中的應用[J].糧油加工與食品機械，2006，06:61-63；向智男，寧正祥.金銀花中綠原酸的提取及純化方法比較[J].林產化學與工業，2006，26(1):116-120)。綠原酸的藥理作用綠原酸的主要藥理作用為抗菌消炎和抗病毒，此外還具有保護心血管的活性。金銀花用纖維素酶處理後，細胞壁中的纖維素被水解成水溶性的糖類物質，而細胞壁的水解破裂有利於胞內物質的溶出，因而酶法提取能提高綠原酸的提取率。目前文獻報導的金銀花中綠原酸的提取工藝有主要有水煎法、酸鹼浸提法，乙醇回流法等，利用簡單的物理方法提取金銀花中的有效成分綠原酸，但上述方法存在著提取率較低、成本較高且造成環境汙染等問題；而近來利用超聲波法、超臨界CO2萃取等新型物理儀器提取綠原酸的方法，因提取效率較高而受到廣泛關注，但由於在生產中存在投資過大，操作繁瑣等問題而限制了上述方法在工業生產中的普及使用。
發明內容本發明針對目前金銀花中提取綠原酸工藝中存在的缺點與不足，提出採用纖維素酶與果膠酶的複合酶法新工藝提取綠原酸，考察了酶的用量、酶解時間、酶解溫度及纖維素酶與果膠酶複合比等影響因素，優化出了纖維素酶與果膠酶複合酶法提取最佳工藝條件。採用《中國藥典》2005版HPLC法測定綠原酸含量，計算綠原酸提取率。纖維素酶與果膠酶複合酶新工藝提取金銀花中綠原酸，比傳統水提工藝提高了16.93%的提取率。為達到上述目的，本發明提供如下的技術方案一種採用複合酶法提取金銀花中綠原酸的方法，其特徵在於按如下的步驟進行(1)按照200_400U/g藥材加入複合酶，控制酶解溫度在40°C-45°C，pH值4.5-5.0，酶解時間1-2小時，處理金銀花；其中所述的複合酶為纖維素酶與果膠酶混合物；(2)酶解完成後，按藥材重量10倍量加入70-90°C水，浸提2_3次，每次l_3h小時，合併浸出液，減壓濃縮；(3)將濃縮液溶於50%甲醇溶液中，定容至50mL，精密吸取ImL用50%甲醇溶液定容至IOOmL,以HPLC法測定綠原酸含量，計算綠原酸提取率；其中纖維素酶與果膠酶複合比為1.00.1-0.3。本發明所述的採用複合酶法提取金銀花中綠原酸的方法，其中纖維素酶的最適合酶活力為pH值4.5，最適溫度為40°C，添加量為200U/g藥材；果膠酶的最適合酶活力為pH值5.0，最適溫度為45°C，添加量為400U/g藥材；纖維素酶與果膠酶複合比為1.00.3。本發明的具體試驗方法如下2.方法與結果1.儀器與試劑高效液相色譜儀ShimadzuLC-2010A，包括四元輸液泵、在線真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱，紫外檢測器LCsolution色譜工作站電子天平SartoriusBP211D，精密度萬分之一旋轉蒸發儀無錫市星海王生化設備有限公司，規格R20升恆溫水浴鍋河南豫華儀器有限公司，型號97冊綠原酸標準品中國藥品生物製品檢定所，批號110753_200413酶纖維素酶(40000U)、果膠酶(30000U)天津利華酶製品廠批號20091016金銀花葯材天津中新藥業集團中新製藥廠提供2.1標準曲線的繪製根據《中國藥典》2005版金銀花項下綠原酸含量測定方法，色譜條件為，檢測波長327nm；柱溫35°C；流動相乙腈-0.4%磷酸溶液(1387)。精密稱取綠原酸標準品11.76mg，用50%的甲醇溶液溶解，定容至50mL。精密量取2mL置於IOmL棕色容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，配製成濃度為0.04704mg/mL的溶液，即得(2_8°C下保存)。分別精密吸取標準品溶液2μL，4μL，6μL，8μL，10μL，12μL，14μL，16μL，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積Y為縱坐標，以進樣量X為橫坐標進行回歸分析，得到回歸方程y=146357x+9663，R2=0.9998。表明綠原酸含量在0.0941-0.7526μg範圍內線性關係良好。2.2金銀花葯材中綠原酸含量測定取金銀花葯材，粉碎，精密稱取過四號篩粉末0.5g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50mL，稱定重量，超聲處理(功率250w，頻率35kHZ)30min,放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻濾過，精密量取續濾液5mL，置25mL棕色容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得。精密吸取5-10μL注入液相色譜儀並測定綠原酸含量為2.34%。2.3水提取金銀花中綠原酸工藝試驗精密稱取金銀花葯材5g，加入10倍量的水，70°C回流提取2小時，濾過；再加入8倍量的水，70°C回流提取2小時，濾過，合併兩次水提取液，減壓濃縮，再將濃縮液溶於50%甲醇溶液中，定容至50mL，精密吸取ImL用50%甲醇溶液定容至lOOmL，HPLC法測定綠原酸含量為2.34%，計算水提工藝綠原酸提取率為66.13%。2.4複合酶法提取金銀花中綠原酸工藝試驗2.4.1複合酶法提取工藝條件的單因素考察2.4.1.1酶解溫度對綠原酸提取率的影響精密稱取過四號篩金銀花葯材粉末5g，按照200U/g藥材，加入纖維素酶，將酶溶於10倍量藥材粉末的水溶液中，調節PH5.0的，不同溫度條件下酶解lh，酶解溫度分別為30、35、40、45、50、551，再加水701浸提兩次，111/次，加水量為藥材的10倍，合併浸出液於旋轉蒸發儀減壓濃縮，再將濃縮液溶於50%甲醇溶液中，定容至50mL，精密吸取ImL用50%甲醇溶液定容至IOOmL,以HPLC法測定綠原酸含量為2.34%，計算綠原酸提取率，結果見圖Io試驗結果顯示，酶解溫度為40°C時，綠原酸提取率最高。分析試驗結果隨著酶解溫度從30-35°C的增加，酶的活力逐漸增加，綠原酸的提取率也逐漸增加；40°C是纖維素酶的最適溫度，酶的活力最大，所以40°C綠原酸提取率最高；但是再增加酶解溫度，綠原酸提取率不再增加，反而下降，分析原因是再增加酶解溫度，纖維素酶活力逐漸下降所致。2.4.1.2酶解pH對綠原酸提取率的影響精密稱取過四號篩金銀花葯材粉末5g，按照200U/g藥材，加入纖維素酶，將酶溶於10倍量藥材粉末的水溶液中，40°C條件下，PH分別為4.O、4.5、5.O、5.5、6.O，酶解Ih，再加水70°C浸提兩次，以下操作同2.4.1.1項下，結果見圖2。試驗結果顯示，酶解時pH為5.O時，綠原酸提取率最高，這可能是pH5.O時纖維素酶活力達到最大，PH大於和小於5.0，綠原酸提取率都不高，可能與纖維素酶活力不是最大有關。2.4.1.3酶解時間對綠原酸提取率的影響精密稱取過四號篩金銀花葯材粉末5g，按照200U/g藥材，加入纖維素酶，將酶溶於10倍量藥材粉末的水溶液中，40°C條件下進行酶解，酶解時間分別為0、0.5,1.0,1.5、2.O、2.5、3.Oh，再加水70°C浸提兩次，以下操作同2.4.1.1項下，結果見圖3。試驗結果顯示，酶解時間l_2h綠原酸提取率較高。分析試驗結果酶解少於1小時，可能酶作用不夠充分，對金銀花葯材中綠原酸的釋放效果不明顯；酶解時間達到1-2小時，酶對金銀花葯材粉末的細胞壁中的纖維素進行分解破壞，促進金銀花葯材中綠原酸的釋放，增加綠原酸的傳質速率，綠原酸提取率增加；但是酶解時間2.5-3小時，綠原酸提取率不再增加，反而下降，分析原因，可能是2.5-3小時纖維素酶活力下降所致。2.4.1.4酶用量對綠原酸提取率的影響精密稱取過四號篩金銀花葯材粉末5g，按照80U/g藥材，200U/g藥材，400U/g藥材，600U/g藥材，800U/g藥材，加入纖維素酶，將酶溶於10倍量藥材粉末的水溶液中，溶於10倍量藥材的pH5.O的水中，40°C條件下酶解lh，再加水70°C浸提兩次，以下操作同2.4.1.1項下，結果見圖4。試驗結果顯示，從每g生藥材加入80活力單位(U)的酶開始，是隨著酶用量的增加，綠原酸提取率也明顯增加，酶用量達到每g生藥材200-400活力單位(u)時，綠原酸提取率最高，確定酶的最佳酶用量為200-400U/g。當再增加酶用量時，綠原酸提取率也不再增加了，原因可能是已經把金銀花生藥大部分綠原酸都提取出來了，所以綠原酸含量不再增加。2.4.2正交試驗設計優選工藝條件2.4.2.1正交試驗設計為了考察酶解溫度、酶解pH、纖維素酶與果膠酶複合比以及酶解時間四因素的協同作用，進行L9(34)設計正交實驗，以金銀花中綠原酸提取率為指標，優化複合酶法提取金銀花中綠原酸的工藝條件。由於植物細胞壁之間存在果膠質，果膠酶可以輔助纖維素酶酶解，使綠原酸更易於溶出，所以試驗設計時，除了考慮因素酶解溫度、PH值、時間，還考慮了纖維素酶和果膠酶的比例。在設計複合酶比例時，固定纖維素酶用量為200U/g，正交實驗因素水平安排如表1。表1.L9(34)正交實驗因素水平表tableseeoriginaldocumentpage6直觀分析表明，在所選因素水平範圍內，影響綠原酸提取效果各因素的主次關係為C>D>B>Α，即酶複合比對綠原酸提取效果影響大，其次是酶解時間，pH值，酶解溫度影響最小。分析原因，酶解PH值和溫度相對影響小，是由於本試驗設計的各水平pH值和溫度，距離纖維素酶和果膠酶的最適PH值和最適溫度相差不大，所以在這個條件下，pH值和溫度因素對綠原酸提取率相對影響較小，酶複合比與酶解時間成為主要影響因素。試驗所優化出的複合酶提取金銀花中綠原酸的最佳工藝條件是酶解溫度45°C，pH值4.5，酶複合比1.00.3，酶解時間1.5小時。2.4.2.3重複驗證實驗為進一步考察優選工藝的可靠性及穩定性，取3份藥材按上述最佳提取工藝進行驗證實驗，操作方法同前述，測得實驗結果見表4。表4重複酶法的最佳工藝試驗結果(N=3)tableseeoriginaldocumentpage7試驗結果表明，該工藝重複性好，結果穩定。應用複合酶酶法新工藝提取金銀花中綠原酸，綠原酸提取率可達82.27%。3.結論(1)本試驗優化出複合酶解法新工藝提取金銀花中綠原酸的最佳工藝條件酶解溫度45°C，pH值為4.5，纖維素酶與果膠酶複合比為1.00.3，酶解時間1.5小時。(2)纖維素和果膠酶複合酶法新工藝提取金銀花中綠原酸提取率可達83.06%，與傳統水提法相比，提高了綠原酸的提取率16.93%。金銀花為植物性藥材，應用纖維素酶和果膠酶可有效地破壞金銀花細胞壁，提高綠原酸的提取率。本發明利用複合酶從金銀花葯材中提取綠原酸的方法與現有的提取工藝相比所具有的積極效果在於(1)本發明的試驗結果表明，該工藝重複性好，結果穩定。應用複合酶酶法新工藝提取金銀花中綠原酸，綠原酸提取率可達83.06%。、(2)本發明的提取工藝能耗低，酶解溫度只需45°C，比傳統水提熱回流工藝節能50%以上。(3)本發明的提取工藝生產效率高，比傳統水提熱回流工藝提高效率近一倍。圖1為酶解溫度對綠原酸提取率的影響；圖2為酶解pH對綠原酸提取率的影響；圖3酶解時間對綠原酸提取率的影響；圖4酶用量對綠原酸得率的影響。具體實施例方式為了更充分的解釋本發明的實施，提供下述製備方法實施實例。這些實施實例僅僅是解釋、而不是限制本發明的範圍。其中的金銀花有市售；纖維素酶(40000U)、果膠酶(30000U)購買於天津利華酶製品廠。比較實施例1精密稱取金銀花葯材5g，加入10倍量的水，70°C回流提取2小時，濾過；再加入8倍量的水，70°C回流提取2小時，濾過，合併兩次水提取液，減壓濃縮，再將濃縮液溶於50%甲醇溶液中，定容至50mL，精密吸取ImL用50%甲醇溶液定容至lOOmL，HPLC法測定綠原酸含量為2.34%，計算水提工藝綠原酸提取率為66.13%。實施例1(1)精密稱取過四號篩金銀花葯材粉末5g，然後將複合酶溶於10倍量藥材粉末的水溶液中備用；(2)按照200U/g藥材加入複合酶(U為活力單位)，控制酶解溫度在40°C，pH值4.5，酶解時間1.5小時，處理金銀花；其中纖維素酶與果膠酶複合比為1.00.3。(3)酶解完成後，按藥材重量10倍量加入70°C水，浸提2次，每次2h小時，合併浸出液，減壓濃縮；(4)將濃縮液溶於50%甲醇溶液中，定容至50mL，精密吸取ImL用50%甲醇溶液定容至IOOmL,以HPLC法測定綠原酸含量為2.34%，計算綠原酸提取率可達83%。實施例2(1)精密稱取過四號篩金銀花葯材粉末5g，然後將複合酶溶於10倍量藥材粉末的水溶液中備用；(2)按照400U/g藥材加入複合酶(U為活力單位)，控制酶解溫度在45°C，pH值5，酶解時間2小時，處理金銀花；其中纖維素酶與果膠酶複合比為1.00.28。(3)酶解完成後，按藥材重量10倍量加入75°C水，浸提3次，每次3h小時，合併浸出液，減壓濃縮；(4)將濃縮液溶於50%甲醇溶液中，定容至50mL，精密吸取ImL用50%甲醇溶液定容至IOOmL,以HPLC法測定綠原酸含量為2.34%，計算綠原酸提取率可達82.6%。實施例3(1)精密稱取過四號篩金銀花葯材粉末5g，然後將複合酶溶於10倍量藥材粉末的水溶液中備用；(2)按照400U/g藥材加入複合酶(U為活力單位)，控制酶解溫度在40°C，pH值4.5，酶解時間2小時，處理金銀花；其中纖維素酶與果膠酶複合比為1.03。(3)酶解完成後，按藥材重量10倍量加入70°C水，浸提2次，每次3h小時，合併浸出液，減壓濃縮；(4)將濃縮液溶於50%甲醇溶液中，定容至50mL，精密吸取ImL用50%甲醇溶液定容至IOOmL,以HPLC法測定綠原酸含量為2.34%，計算綠原酸提取率可達82.6%。在詳細說明的較佳實施例之後，熟悉該項技術人士可清楚地了解，在不脫離上述申請專利範圍與精神下可進行各種變化與修改，凡依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均屬於本發明技術方案的範圍。且本發明亦不受限於說明書中所舉實例的實施方式。權利要求一種採用複合酶法提取金銀花中綠原酸的方法，其特徵在於按如下的步驟進行(1)按照200-400U/g藥材加入複合酶，控制酶解溫度在40℃-45℃，pH值4.5-5.0，酶解時間1-2小時，處理金銀花；其中所述的複合酶為纖維素酶與果膠酶混合物；(2)酶解完成後，按藥材重量10倍量加入70-90℃水，浸提2-3次，每次1-3h小時，合併浸出液，減壓濃縮；(3)將濃縮液溶於50％甲醇溶液中，定容至50mL，精密吸取1mL用50％甲醇溶液定容至100mL，以HPLC法測定綠原酸含量，計算綠原酸提取率；其中纖維素酶與果膠酶複合比為1.0∶0.1-0.3。2.權利要求1所述採用複合酶法提取金銀花中綠原酸的方法，其中纖維素酶的最適合酶活力為PH值4.5，最適溫度為40°C，添加量為200U/g藥材；果膠酶的最適合酶活力為pH值5.0，最適溫度為45°C，添加量為400U/g藥材；纖維素酶與果膠酶複合比為1.00.3。全文摘要本發明涉及一種採用複合酶法提取金銀花中綠原酸的方法，本發明研究了纖維素酶與果膠酶複合酶法提取金銀花中主要藥用有效成分綠原酸的新工藝，通過單因素試驗和正交試驗，優化出複合酶法提取金銀花中綠原酸的最佳工藝條件酶解溫度45℃，pH4.5，纖維素酶與果膠酶複合比為1.0∶0.3，酶解時間1.5小時。本發明的試驗結果表明，該工藝重複性好，結果穩定。應用複合酶酶法新工藝提取金銀花中綠原酸，綠原酸提取率可達83.06％，比傳統水提工藝綠原酸提取率提高16.93％。文檔編號C07C69/732GK101830804SQ20101012449公開日2010年9月15日申請日期2010年3月16日優先權日2010年3月16日發明者凌寧生,王巖,鄭麗娜申請人:天津中新藥業集團股份有限公司中新製藥廠