使用hplc-dad同時測定丹紅注射液中6種有效成分含量的方法
2023-06-20 01:50:06 1
專利名稱：使用hplc-dad同時測定丹紅注射液中6種有效成分含量的方法
技術領域：
本發明屬於中藥質量檢測領域，具體是一種使用HPLC-DAD同時測定丹紅注射液中6種有效成分含量的方法。
背景技術：
丹紅注射液是由傳統的活血化瘀中藥丹參、紅花提取的複方製劑，具有活血化瘀，改善微循環，降低血液黏度，加快血液流速，清除氧自由基，保護細胞免受氧化損傷，抑制動脈粥樣硬化等作用。在臨床上廣泛用於冠心病、心絞痛、心肌梗死、急性腦梗死、慢性肺心 病、血栓閉塞性脈管炎、萎縮性胃炎以及高血壓腎病等。丹紅注射液的君藥丹參主要含丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A等水溶性成分。《國家中成藥標準彙編、內科、心系分冊》中關於丹紅注射液的國家藥品標準(試行)頒布件中僅對丹參素鈉和原兒茶醛2種有效成分進行質量控制。由於丹紅注射液中所含成分比較複雜，難以將6種有效成分與其他成分很好的分離，達到HPLC定量測定的要求。鑑於這一原因，故建立一種同時測定丹紅注射液中6種有效成分含量的方法具有重要的現實意義。
發明內容
為了解決上述技術問題，本發明提供了一種使用HPLC-DAD同時測定丹紅注射液中6種有效成分含量的方法。可以有效解決以丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A作為指標性成分，同時進行含量測定，為丹紅注射液質量標準奠定基礎的問題，實現本發明的具體技術方案是
一種使用HPLC-DAD同時測定丹紅注射液中6種有效成分含量的方法，其特徵在於包括如下步驟
1)精密吸取丹紅注射液，加超純水稀釋，搖勻，經濾膜濾過，即得供試品溶液；
2)精密稱取對照品丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A，分別置容量瓶中，加超純水溶解，稀釋，混勻，作為對照品儲備溶液，於4°C冰箱內冷藏備用；
3)再分別精密吸取6種對照品儲備溶液，加超純水稀釋，準確配製丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A的混合對照品溶液；
4)用以下色譜條件進行HPLC-DAD法檢測色譜柱EclipseXDB-C18 4.6X 150 mm, 5U m ;流動相包括流動相A 乙腈和流動相B :體積百分含量0. 05% - 0. 1%的磷酸水溶液；採用梯度洗脫方式，乙腈佔流動相的體積比在下述範圍內隨著時間的增加而增加0-6 min,5%-5% ；6-16 min, 5%-15% ； 16-30 min, 15%-26% ；35-40 min, 26%_27% ;DAD 檢測器檢測波長檢測丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A使用270-290 nm，檢測咖啡酸、迷迭香酸使用 320 -340nm ;柱溫25_35°C ;流速:0. 7-1. 2 mL mirT1 ；
5)取混合對照品溶液，分別用超純水稀釋不同的倍數，取上述稀釋混合對照品溶液與原混合對照品溶液各進樣10 u 1，記錄色譜圖和峰面積，分別以6種有效成分色譜峰的峰面積Y為縱坐標，以濃度X，y g mL-1為橫坐標進行線性回歸，得標準曲線的回歸方程和相關係數； 6)分別取不同批號的丹紅注射液，按供試品溶液的製備方法配製樣品溶液，分別進樣10 u L，測定峰面積，每批樣品測定3次，計算得到不同批號丹紅注射液中丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A的含量。所述的方法，其特徵在於步驟I)中精密吸取丹紅注射液2mL，置IOmL容量瓶中，力口超純水稀釋至刻度，搖勻，經0. 45 um濾膜濾過，即得供試品溶液。所述的方法，其特徵在於步驟2)中精密稱取對照品丹參素鈉6. 55mg、原兒茶醛
5.05mg、咖啡酸I. 55mg、迷迭香酸5. 45mg、丹酚酸BIO. 95mg、丹酚酸A5. 60mg，分別置5mL容量瓶中，加超純水溶解，稀釋至刻度，混勻，作為對照品儲備溶液，於4°C冰箱內冷藏備用。所述的方法，其特徵在於步驟3)中再分別精密吸取一定量的6種對照品儲備溶液，加超純水稀釋，準確配製丹參素鈉I. 310 mg mL'原兒茶醒0. 101 mg mL'咖啡酸
0.0041 mg .mL'迷迭香酸0. 109 mg .mL'丹酌 酸B 0. 219 mg .mL'丹酌 酸A3. 360 mg .mL-1的混合對照品溶液。所述的方法，其特徵在於步驟4)中流動相B磷酸水溶液的體積百分含量為0. 1%。所述的方法，其特徵在於步驟4)中DAD檢測器檢測波長檢測丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A使用280 nm，檢測咖啡酸、迷迭香酸使用330nm。所述的方法，其特徵在於步驟4)中柱溫是30°C。所述的方法,其特徵在於步驟4)中流速是I. 0 mL mirT1。所述的方法，其特徵在於步驟5)中取混合對照品溶液，分別用超純水稀釋I. 25，5，10，20，100倍，取上述5種稀釋混合對照品溶液與原混合對照品溶液各自進樣10 yl，記錄色譜圖和峰面積，分別以6種有效成分色譜峰的峰面積Y為縱坐標，以濃度X，y g mL—1為橫坐標進行線性回歸，得標準曲線的回歸方程和相關係數。本發明採用HPLC - DAD法，運用梯度洗脫測定了丹紅注射液中丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A 6種有效成分的含量。計算得丹紅注射液中6種有效成分的線性關係，結果見表I。表I 6種有效成分的線性關係fc=6)
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本發明的方法簡便、靈敏度高，重現性好，解決了目前丹紅注射液的質量評價不能全面地反映丹紅注射液質量的問題，以對丹紅注射液的質量進行多指標的控制，為科學評價和有效控制丹紅注射液的質量提供更科學的依據。
圖1是丹參素鈉對照品的紫外可見吸收光譜 圖2是原兒茶醛對照品的紫外可見吸收光譜 圖3是咖啡酸對照品的紫外可見吸收光譜 圖4是迷迭香酸對照品的紫外可見吸收光譜 圖5是丹酚酸B對照品的紫外可見吸收光譜 圖6是丹酚酸A對照品的紫外可見吸收光譜 圖7是混合對照品溶液在280nm的色譜 圖8是混合對照品溶液在330nm的色譜 圖9是供試品溶液(No. 110934)在280nm的色譜 圖10是供試品溶液(No. 110934)在330nm的色譜 圖7至圖10中，I.丹參素鈉；2.原兒茶醛；3.咖啡酸；4.迷迭香酸；5.
丹酚酸B ;6.丹酚酸A。
具體實施例方式材料
Agilent 1200型高效液相色譜系統(包括G1311A四元梯度泵、G1316A柱溫箱、G131 二極體陣列檢測器、G1315D DAD檢測器、G1322A在線脫氣機和化學工作站)。超純水儀(美國Milipore公司)；XS105DualRange分析天平(梅特勒-託利多儀器有限公司)；超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)。丹紅注射液(菏澤步長製藥有限公司，規格10 mL/支)；丹參素鈉對照品(批號110855-200809)、原兒茶醛對照品(批號110810-201007)、咖啡酸對照品(批號20120211)、迷迭香酸對照品(批號111871-201102)購於中國藥品生物製品檢定所；丹酚酸B對照品(批號20110822)、丹酚酸A對照品(批號20120207)購於上海源葉生物科技有限公司。乙腈(批號102489)、甲醇(批號101437)購於美國Fisher公司，均為色譜純；磷酸，(批號76643827，國藥集團化學有限公司)為分析純；水為超純水。方法與結果
2.I供試品溶液的製備精密吸取丹紅注射液2 mL，置10 mL容量瓶中，加超純水稀釋至刻度，搖勻，經0. 45 um濾膜濾過，即得供試品溶液。混合對照品溶液的製備精密稱取對照品丹參素鈉6.55 mg、原兒茶醛5.05 mg、咖啡酸1.55 mg、迷迭香酸5.45 mg、丹酚酸B 10.95 mg、丹酚酸A 5. 60 mg，分別置5 mL容量瓶中，加超純水溶解，稀釋至刻度，混勻，作為對照品儲備溶液，於4°C冰箱內冷藏備用。再分別精密吸取一定量的6種對照品儲備溶液，加超純水稀釋，準確配製丹參素鈉 I. 310 mg ml/1、原兒茶醒 0. 101 mg mL4、咖啡酸 0. 0041 mg mL'迷迭香酸 0. 109mg mL'丹酹酸B 0. 219 mg mL'丹酹酸A 3. 360 mg mL-1的混合對照品溶液。色譜條件 Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6X150 mm, 5 u m);流動相採用二元體系，A為乙腈，B為0. 1%磷酸水溶液，梯度洗脫方式為0-6 min，5%A ;6_16 min，5%A_15%A ；16-30 min, 15%A-26%A ；30-40 min, 26%A-27%A ;柱溫為 30°C ;流速為 I. 0 mL .mirT1 ;結果得到如圖I-圖6所示的6種對照品的紫外-可見光譜，由圖I及供試品溶液色譜圖確定檢測波長為280 nm (測定丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A)，330 nm (測定咖啡酸、迷迭香酸)。在所選擇的色譜條件下，樣品液中6種成分與其他共存峰得到很好的分離，混合對照品溶液及供試品溶液的色譜圖見圖7-圖10。
2.4線性關係考察取混合對照品溶液，分別用超純水稀釋1.25，5，10，20，100倍。取上述5種稀釋混合對照品溶液與原混合對照品溶液各進樣10 yl，記錄色譜圖和峰面積，分別以6種有效成分色譜峰的峰面積⑴為縱坐標，以濃度(X，y g mL-1)為橫坐標進行線性回歸，得標準曲線的回歸方程和相關係數，結果見表I。表I 6種有效成分的線性關係(/7=6)
權利要求
1.一種使用HPLC-DAD同時測定丹紅注射液中6種有效成分含量的方法，其特徵在於包括如下步驟 · 1)精密吸取丹紅注射液，加超純水稀釋，搖勻，經濾膜濾過，即得供試品溶液； ·2)精密稱取對照品丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A，分別置容量瓶中，加超純水溶解，稀釋，混勻，作為對照品儲備溶液，於4°C冰箱內冷藏備用； ·3)再分別精密吸取6種對照品儲備溶液，加超純水稀釋，準確配製丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A的混合對照品溶液； ·4)用以下色譜條件進行HPLC-DAD法檢測色譜柱EclipseXDB-C18 4.6X 150 mm, 5U m ;流動相包括流動相A :乙腈和流動相B 0. 05% - 0. 1%(體積百分含量)的磷酸水溶液；採用梯度洗脫方式，乙腈佔流動相的體積百分比在下述範圍內隨著時間的增加而增加0-6min，5%-5% ;6-16 min，5%_15% ; 16-30 min，15%-26% ；35-40 min, 26%_27% ;DAD 檢測器檢測波長檢測丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A使用270-290 nm，檢測咖啡酸、迷迭香酸使用 320 -340nm ;柱溫25_35°C，優選 30°C ;流速:0. 7-1. 2 mL mirT1 ； ·5)取混合對照品溶液，分別用超純水稀釋不同的倍數，取上述稀釋混合對照品溶液與原混合對照品溶液各進樣10 u 1，記錄色譜圖和峰面積，分別以6種有效成分色譜峰的峰面積Y為縱坐標，以濃度X，y g mL-1為橫坐標進行線性回歸，得標準曲線的回歸方程和相關係數； ·6)分別取不同批號的丹紅注射液，按供試品溶液的製備方法配製樣品溶液，分別進樣10 u L，測定峰面積，每批樣品測定3次，計算得到不同批號丹紅注射液中丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A的含量。
2.如權利要求I所述的方法，其特徵在於步驟I)中精密吸取丹紅注射液2mL，置IOmL容量瓶中，加超純水稀釋至刻度，搖勻，經0. 45 um濾膜濾過，即得供試品溶液。
3.如權利要求I所述的方法，其特徵在於步驟2)中精密稱取對照品丹參素鈉6.55mg、原兒茶醒5. 05mg、咖啡酸I. 55mg、迷迭香酸5. 45mg、丹酹酸BIO. 95mg、丹酹酸A5. 60mg,分別置5mL容量瓶中，加超純水溶解，稀釋至刻度，混勻，作為對照品儲備溶液，於4°C冰箱內冷藏備用。
4.如權利要求I所述的方法，其特徵在於步驟3)中再分別精密吸取一定量的6種對照品儲備溶液，加超純水稀釋，準確配製丹參素鈉I. 310 mg 、原兒茶醛0. 101 mg 、咖啡酸 0. 0041 mg mL'迷迭香酸 0. 109 mg mL—1、丹酚酸 B 0. 219 mg mL—1、丹酚酸 A3. 360mg ml/1的混合對照品溶液。
5.如權利要求I所述的方法，其特徵在於步驟4)中流動相B磷酸水溶液的體積百分含量最佳為0. 1%。
6.如權利要求I所述的方法，其特徵在於步驟4)中DAD檢測器檢測波長檢測丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A使用280 nm左右，檢測咖啡酸、迷迭香酸使用330nm左右。
7.如權利要求I所述的方法，其特徵在於步驟4)中流速最佳是I.0 mL mirT1。
8.如權利要求I所述的方法，其特徵在於步驟5)中取混合對照品溶液，分別用超純水稀釋I. 25，5，10，20，100倍，取上述5種稀釋混合對照品溶液與原混合對照品溶液各進樣·10 u 1，記錄色譜圖和峰面積，分別以6種有效成分色譜峰的峰面積Y為縱坐標，以濃度X，u g mL-1為橫坐標進行線性回歸，得標準曲線的回歸方程和相關係數。
全文摘要
本發明涉及一種HPLC-DAD同時測定丹紅注射液中丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A6種有效成分含量的方法。實現本發明的具體技術方案是分別製備供試品溶液和對照品溶液，採用HPLC-DAD法進行梯度洗脫，同時測定丹紅注射液中丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A6種有效成分的含量，本發明方法簡便、靈敏度高，重現性好，解決了目前丹紅注射液中僅控制2種有效成分的含量，不能全面地反映丹紅注射液質量的問題，以對丹紅注射液的質量進行多指標的控制，為科學評價和有效控制丹紅注射液的質量提供更科學的依據。
文檔編號G01N30/02GK102621246SQ20121010725
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月13日 優先權日2012年4月13日
發明者萬海同, 付巍, 何昱, 周惠芬, 張恆義, 張茹萍, 蓋玉權, 趙濤, 邢攀科, 黃翔 申請人:浙江中醫藥大學