一種包含植物乳桿菌和精氨酸的藥物組合物的製作方法

2023-06-19 19:10:56

專利名稱：：一種包含植物乳桿菌和精氨酸的藥物組合物的製作方法
技術領域：
：本發明是關於一種藥物組合物，它包括可移生或粘附於人類腸黏膜的植物乳桿菌菌株和精氨酸。所述組合物可用於急性肝損傷或肝衰竭的預防和治療，也可以用於伴隨黏膜屏障缺損和細菌轉移(franslocatian)增加的相關情況。
背景技術：
：細菌轉移，即微生物或毒性化合物通過穿過腸黏膜屏障或腸壁從腸腔中逃出，在很多疾病的發生中都很重要。例如細菌轉移可發生於免疫妥協病人，疾病危象和多器官衰竭的病人，多創傷及燒傷病人，肝病或感染性腸病，及營養不良病人。病毒性肝炎，爆發性肝功能衰竭，肝硬變，酒精性肝炎，膽管炎和自身免疫性疾病如慢性活動性肝炎都是可發生細菌轉移的肝臟疾病。肝炎，中毒或大的肝手術後發生急性肝功能衰竭時，細菌從腸腔的轉移會增加。這可能可以解釋在這些情況下所發生的某些感染性併發症。急性肝衰竭有很高的死亡率，其中很大比例的死亡可歸結於膿毒症的高發率。疾病危象或免疫妥協病人的大部分感染是由病人自身的微生物區系引起的，許多死於膿毒症或多系統器官衰竭的病人均有腸菌血症，卻沒有發現膿毒症病灶，表明這些感染可能發源於腸。由於爆發性肝衰竭中臨床有意義的細菌性膿毒症有很高的發生率，使預防性治療也很有必要。細菌轉移可導致膿毒症及敗血病，後者使肝衰竭成為可能，也可導致多器官衰竭。細菌感染增加的治療可通過使用抗生素，但抗生素有許多副作用，還能影響腸黏膜屏障和微生物區系。這些發現導致對有益於宿主體內微生物平衡的微生物種類的研究興趣大增，這些微生物通過產生抗微生物組分或競爭性生長來維持宿主體內微生物平衡。其中乳桿菌是研究最多的種類之一，在某些情況中已顯示了對病原體增殖的對抗作用。乳桿菌是構成正常胃腸微生態的必要部分，並參與宿主的代謝。用乳桿菌進行菌療已報導在假膜性及潰瘍性結腸炎中有效。精氨酸對機體的免疫系統，尤其在創傷後有很大的影響。而且，精氨酸是多胺的已知前體，多胺是細胞生長和分化中重要的介質。精氨酸還可刺激局部和系統免疫系統。現有技術SE9501056-7是關於特定的乳桿菌菌株在製備引發免疫反應的藥物組合物及治療完整腸上皮上的致病菌或潛在致病菌的轉移中的應用，這種菌株具有粘附素，使其粘附於人類腸上皮細胞的受體。所述應用尤指植物乳桿菌299，DSM6595，植物乳桿菌299v，DSM9843，及其它屬於所說明的群體的植物乳桿菌菌株的應用。Gianotti，Luca等，外科學年報，217卷，第6期，644-654，考察了飲食的精氨酸對細菌轉移的影響。給予添加精氨酸飲食的動物存活率升高。定量菌落計數和剩餘可存活細菌的百分比計算表明接受精氨酸的動物，其殺死轉移微生物的能力顯著增強。Daly，JohnE.，等，外科學，112卷55-67，1992，顯示手術後病人的腸道營養添加精氨酸，RNA和ω-3-脂肪酸後病人的免疫防禦能力實現了不同的機制的提高。發明詳述目前已驚奇地發現特定乳桿菌菌株和精氨酸的結合可顯著地降低與細菌轉移相關的肝損傷和衰竭的程度。本發明是關於一種藥物組合物，它包括-具有體內移生於人腸黏膜能力的植物乳桿菌菌株；-精氨酸；和-可藥用的載體。本發明尤指一種藥物組合物，其中乳桿菌株具有粘附素，使其粘附於人類腸上皮細胞的受體。糖蛋白受體和粘附素之間的粘附可被糖α-甲基甘露糖苷抑制，提示受體是包含甘露糖的。而這種受體與1型大腸桿菌菌毛的含甘露糖的受體不同，這一點通過血球凝集試驗可顯示。現認為受體包含有甘露糖α1-2甘露糖的序列。本發明尤指一種藥物組合物，其中植物乳桿菌菌株屬於這樣一族，其限制性內切酶譜分析利用Pearson乘積矩相關係數和與算術平均數的非加權對組算法(UPGMA；GelCompare3.0，應用數學，Kortrujk，Beljium)與保藏號為DSM6595的植物乳桿菌299菌株有70％以上相似性。限制性內切酶譜分析，REA，是指對瓊脂糖凝膠電泳上限制性酶所消化的細菌染色體DNA斷裂方式的分析，方法則依照下文基因型確定中所描述。對菌株REA型特徵的確認，可確定所用分離物。本發明特指一種組合物，它包括以下任何菌株植物乳桿菌299DSM6595植物乳桿菌299vDSM9843植物乳桿菌79植物乳桿菌105植物乳桿菌107或REA與植物乳桿菌299有70％以上相似性的其它菌株。優選的植物乳桿菌菌株在我們共同未決的申請SE9501056-7中有描述在此引入作為參考作為參考。組合物中的精氨酸優選L-精氨酸。但用富含精氨酸的蛋白如棉籽蛋白或來自大豆或豌豆的蛋白也是可能的。本發明的藥物組合物除乳桿菌菌株和精氨酸外，還包括可藥用的載體。傳統的載體，例如，被所述細菌發酵的，生理學上可接受的底物及各種食料，尤其是以澱粉或牛奶為基礎的食物，同時還必須是惰性的固體或液體物質，例如鹽水或水。合適的底物應含有在胃腸道不被吸收的液體或固體纖維，當它們與乳桿菌發酵時，形成短的脂肪酸。穀類，如燕麥及小麥，玉米，根類蔬菜如馬鈴薯及某些水果如未熟香蕉等均可作為合適的，含澱粉的底物的例子。根據本發明，組合物可通過任何適當的方式給藥，優選口服或直腸，如灌腸劑。也可以通過經胃插入小腸或直接插入小腸的導管腸道給藥。試驗表明如果提供食物纖維，例如燕麥粥或β-葡聚糖，療效會有所提高。治療應每日一至數次，持續1-2周。與肝外科手術或肝炎等有關的肝衰竭中，肝臟無法行使其正常功能，使得氨，含氮化合物，內毒素和其它細菌產物未經代謝而通過肝臟，而危及人體。在這些情況下，減少肝負荷的一個辦法就是給患者灌腸或促使其腹瀉，以衝洗腸道。但這樣做同時會使腸正常功能所需的許多產物被衝掉。本發明的組合物優選以灌腸劑用於這種情況。藥物組合物中的所用乳桿菌株優選濃度為107-109CFU/ml。人體所用精氨酸的優選劑量為25-20克/天。口服給藥優選的載體為乳酸發酵的食品，如以燕麥為基質的營養液，象WO89/08405中所述，或以牛奶為基質的營養液如奶酪。另一種優選的載體是食物纖維產品，如β-葡聚糖，果料，寡糖，它們均屬於乳酸發酵食品。口服給藥的優選量為每天100-200毫升，1-5次服用。口服用的組合物優選含被保護免於在小腸內被消化的精氨酸組分，例如可通過成膠寡糖將精氨酸預先聚集的方法，當在胃腸道脹起時，就會在表面覆蓋一層保護性膠，直至在結腸中發酵。這種覆蓋膠可採用果膠，瓜耳子粉及Konjac植物中的葡甘露聚糖，如商品Propal(ShimizuCo.，日本)直腸給藥的載體優選一種生理性溶液，使精氨酸，乳桿菌及一種選擇的食物纖維如β-葡聚糖或果膠懸浮於其中。每天用藥1-2次，優選量為20-50毫升。附圖簡述圖1是所檢測的不同乳桿菌菌株相似性的樹狀圖。這些乳桿菌菌株已由基於Pearson乘積矩相關係數和UPGMA的REA法鑑定。菌株的確認從正常人體腸黏膜所分離得到的菌株299和299v，已分別於1991年7月2日和1995年3月16日存放於德國微生物菌種和細胞保藏中心GmbH，保藏號分別為DSM6595(299)及DSM9843(299v)。表型的確定菌株299，299v，79，105及107是在PH5.5下，生長於Rogosa瓊脂上的革蘭氏陽性，過氧化氫酶陰性的菌株。它們可在厭氧條件下由葡萄糖產生乳酸。這些菌株發酵不同的碳水化合物的能力列於表1。所有測試均遵照生產商的建議通過API50CH進行。表1API50CH上，30℃，37℃乳酸桿菌Planterum299，299v，107，105及275的發酵方式碳水化合物植物乳桿菌植物乳桿菌植物乳桿菌植物乳桿菌植物乳桿菌299299v1071057930℃37℃30℃37℃30℃37℃30℃37℃30℃37℃甘油----------赤蘚醇----------D-阿拉白糖----------L-阿拉伯糖++++++++++核糖++++++++++D-木糖----------L-木糖----------阿東糖醇----------β-甲基-----------木糖苷半乳糖++++++++++D-葡萄糖++++++++++D-果糖++++++++++D-甘露糖++++++++++L-山梨糖----------鼠李糖----------衛矛糖----------肌醇----------甘露醇++++++++++山梨醇++++++++++α-甲基-D-++++++++++甘露糖苷α-甲基-D---------葡萄糖胺N-乙醯基-++++++++++葡萄糖胺苦杏仁苷++++++++++熊果苷++++++++++七葉靈++++++++++水楊苷++++++++++纖維素二糖++++++++++麥芽糖++++++++++乳糖++++++++++蜜二糖++++++++++蔗糖++++++++++海藻糖++++++++++菊粉----------松三糖++++++++++D-棉子糖-+-+------澱粉----------糖原----------木糖醇----------β-葡二糖++++++++++D-松二糖++++++++++D-來蘇糖----------D-塔格糖----------D-巖藻糖----------L-巖藻糖----------D-阿拉白--+-+-+-+-糖醇L-阿拉白----------糖醇葡糖酸酯++++++++++2-鯨蠟醇----------葡糖酸酯5-鯨蠟醇----------葡糖酸酯菌株的表型被確定為植物乳桿菌。基因型的確認REA通過限制性內切酶分析-REA-法測試了菌株的染色體DNA的斷裂方式，所用REA法依照StahlM，MolinG，Perss；onA，AhrneS及StahlS.，國際系統細菌學雜誌，1990，40189-193及更進一步為Jahansson，M-L，等發展的，國際系統細菌學雜誌，1995，45670-75。概要地說，REA可描述如下製備並以限制性內切酶切割所研究菌株的染色體DNA。0.75微克的各種DNA均分別以10個單位的HindIII，ClaI及EcoRI在37℃消化4小時；每種內切酶單獨使用。Stahl等，同上，以Asp718代替HindIII，但以Asp718消化產生太多較大的帶，對現有方法不是最佳的。切割所得的DNA片段通過浸沒的水平瓊脂糖厚凝膠電泳按大小分開。凝膠包括150毫升0.9％瓊脂糖(DNA級超純；低電滲；BioRad實驗室，Richmond，USA)，並形成膠塊(150×235毫米)。以0.2微克的高分子量的DNA標準物(Bethesda研究室，BRL)和DNA分子量標準物IV(BoehringerMannheim，德國)作為標準。另外，在每個孔內加入被EcoRI消化的pHC(79分子量為4.2×106；BoehringerMannheim)作為內標。樣品DNA用Ficoll上樣緩衝液(2克Ficoll，8毫升水，0.25％溴酚蘭)可達到最小帶扭曲和最大清晰度。8.5℃，40V穩壓下跑膠18小時。在跑膠過程中循環緩衝液(89mMTris，2mMEDTANa，PH8.3)。然後在溴乙錠(2微克/毫升)染色20分鐘，蒸餾水中脫色，紫外燈(UVPInc.，SanGabriel，USA)302納米觀察，照像。這種跑凝膠電泳的方法可得到分布較好，分離相對好的帶，允許分子量甚至低至1.2×106。底片上的帶圖像用雷射密度掃描儀(UltroScanXL；LKB-ProdukterAB，Bromma，瑞典)掃描。解析度是每行1000點，每行約50毫米長。用LKB2400GelScanXL軟體包(LKB-ProdukterAB)獲得數據。用GelCompar3.0程序的滾盤算法來校正帶型和減除背景噪音。每個菌株三次切割(被HindIII，ClaI及EcoRI)所得數據組合起來(用GelCompar3.0)。數據集用Pearson乘積矩相關係數(r)和形成與算術平均數的非加權配對算法(UPGMA)(Romersburg，H.C.1984，研究用集分析。Lifeimelearning出版，Belmont，California，USA)進行分析。用GelCompar3.0程序計算全數據集的Pearson乘積矩相關係數和UPGMA值。圖1中與植物乳桿菌299有＞70％相似性的集被標記出。質粒圖譜依照Chassy等(1976)所述方法檢測菌株的質粒成分。植物乳桿菌299，299v，79和105具有相同的質粒圖譜，即4，9，15，21和＞30MDa的五個質粒。植物乳桿菌107有三個質粒，4，15，和21Mda。大鼠體內的生物學試驗本試驗的目的在於研究急性肝損傷模型中，直腸補充含精氨酸和不含精氨酸的不同菌株的乳桿菌，對肝損傷和細菌轉移程度的影響。試驗用了五種不同的乳桿菌菌株從大鼠腸黏膜分離得到的L.reuteriR2LC，從人結腸分離得到的鼠李糖乳桿菌DSM6594(菌株271)，從人空腸分離得到的乳桿菌DSM87043(菌株245)，從人空腸分離得到的L.reuteri108及從人空腸和直腸分離得到的植物乳桿菌DSM9843(菌株299v)。所有菌株均由瑞典Lund大學，食品技術系，食品衛生實驗室提供。將體重在200-300克範圍內的雄性Sprague-Dawley大鼠分成13組，每組六隻正常組，急性肝損害對照組(ALI)，補充精氨酸組(SA)，補充乳桿菌reuteriR2CL組(SR)，補充乳桿菌reuteriR2CL+精氨酸組(SRA)，補充鼠李糖乳桿菌271組(SS)，補充鼠李糖乳桿菌271+精氨酸組(SSA)，補充植物乳桿菌299v組(SP)，補充植物乳桿菌299v+精氨酸組(SPA)，補充發酵乳桿菌87043組(SF)，補充發酵乳桿菌87043+精氨酸組(SFA)，補充乳桿菌reuteri108組(ST)，補充乳桿菌reuteri108+精氨酸組(STA)。整個試驗過程中給所有的大鼠以正常的食物(R3，丙氨酸AB，Stockholm)和水adlibitum，12小時光照/黑暗循環及保持22℃室溫。通過直腸插管每天直腸給含和不含精氨酸的不同乳桿菌菌株一次，共8天。乳桿菌菌株的每天補充量為每個動物3毫升，約3×109CFU。第8天時，腹膜內注射D-氨基半乳糖(SigmaChemicalCo.，Stlouis，USA)1.1克/千克體重，這種劑量的D-氨基半乳糖可引起細菌由腸腔向遠處器官洩漏的增加，來誘導急性肝損傷。急性肝損傷對照組8天內每天補充正常鹽水，第8天時誘導肝損傷。誘導肝損傷後24和48小時採樣。乙醚麻醉，無菌條件下進行中線切口剖腹。收集門靜脈血用於細菌學試驗，動脈血用於細菌學和肝酶試驗。肝臟尾葉和腸繫膜淋巴結(MLN)處採到的樣用於細菌學和肝臟的組織學研究。細菌轉移的發生率細菌學分析中，樣品立即放入含EDTA的無菌試管中。組織樣品放入5毫升無菌轉移介質中。超聲浴中超5分鐘後，在Chiltern(Terma-Glas，瑞典)上旋轉2分鐘。將1.0毫升樣品置於腦心擴散瓊脂BHI(Oxoid)上，37℃孵育3天，進行整個需氧平皿計數。將樣品置於BHI上，厭氧條件下37℃培育進行整個厭氧平皿計數。3天後對每個平皿上的克隆計數，並對原組織重量進行校正。每組六隻動物中的每個大鼠的不同部位細菌轉移的發生率見下表1。表124小時後細菌轉移的發生率與急性肝對照組比較，*代表p＜005，**代表p＜0.01上述細菌轉移發生率的計數表明了在大鼠血液或組織中細菌的存在與否；也就是說，如果找到至少一個細菌，該大鼠就得一正值。細菌轉移的發生率用Fisher的準確測試法進行評價。小於0.05的可能性水平就認為是有意義的。正如表1可以看出，與正常對照組相比，急性肝損傷組細菌轉移至血液中的發生率有明顯提高。而補充含和不含精氨酸的植物乳桿菌299v，乳桿菌reuteriR2CL和108，發酵乳桿菌87043的各組，細菌轉移的發生率則均顯著降低。與急性肝損傷組比較，所有組的肝臟和腸繫膜淋巴結的細菌轉移發生率均稍顯降低。血液中的肝酶按照斯堪的那維亞臨床化學和臨床生理學會的酶學委員會推薦(ScanJClinLabInves1974；33291-306)，將血液在Kodak，Echachem700XRC上離心(1000xg，10分鐘)後，進行動脈血中肝酶，血清膽紅素(Bil)，鹼性磷酸酶(ALP)，天冬氨酸氨基轉移酶(ASAT)，丙氨酸氨基轉移酶(ALAT)的水平的測定。血清氨基轉移酶是肝細胞損傷的敏感標誌，對於識別肝細胞損傷最有幫助，它們常被用作肝疾病的測量標識物。肝膽管疾病會導致血清鹼性磷酸酶的上升。肝細胞損傷中，血清膽紅素的水平也較高。血清膽紅素的升高，ASAT或ALAT的升高，及鹼性磷酸酶水平升高，可準確預測肝臟疾病的存在。所有值均為平均值±SEM。結果用所有成對多重比較法進行了統計學評價。表2動脈血肝酶水平*利用Neuman-Keuls全組多重比較法與ALI組相比，p＜0.05從上表可以看出，補充含精氨酸和不含精氨酸的乳桿菌的各組，肝酶水平均下降，在補充以精氨酸和植物乳桿菌的組中，這種下降最為顯著。肝臟的組織形態學將從肝葉取得的樣品置於含4％磷酸緩衝液的甲醛中。將石蠟封藏的樣品進行組織切片，蘇木紫和伊紅染色後在光學顯微鏡下觀察。每種至少觀察3張切片。按照Chojkier，M等，胃腸病學1985；88115-21，和Shiratori，Y.等，肝臟病學1988；8(4)815-21，稍作改進的方法進行肝臟形態學計數。肝細胞壞死程度和感染性細胞浸潤均在Lund大學病理系進行定量如下肓測1小量2中等量3亞大量4大量結果列於下表3。表3*利用Dunn全組多重比較法與ALI組相比，p＜0.05肝損傷後24小時和48小時，補充以植物乳桿菌+精氨酸的組與急性肝損傷對照組顯示出明顯不同的肝形態學。小結不同病因學的，伴有急性肝衰竭的病人腸道細菌的感染發生率很高，約30-40％。細菌向腸外的轉移能誘導肝衰竭，並能導致濃毒症和多器官衰竭。從上述試驗可以看出，本發明的含精氨酸和植物乳桿菌菌株的組合物在預防肝損傷和衰竭及相關細菌轉移方面，比其它的測試菌株優越，這可從其可使肝酶和膽紅素的釋放明顯減少，細菌轉移減少和肝臟形態學計數中得以證實。權利要求1.一種藥物組合物，包括-體內能夠移生於人腸黏膜的植物乳桿菌菌株；-精氨酸；及-可藥用的載體。2.權利要求1的藥物組合物，其中植物乳桿菌菌株具有粘附素，使其粘附於人類腸上皮細胞的受體。3.權利要求1或2的藥物組合物，其中乳桿菌菌株是一類植物乳桿菌，它屬於限制性內切酶譜分析與貯存號DSM6595的植物乳桿菌299菌株，用Pearson乘積矩相關係數(r)和與算術平均數的非加權配對算法(UPGMA；GelCompare3.0，AppliedMaths，Kortrijk，Belgium)分析有70％以上相似性的一族。4.權利要求1-3的任意項的藥物組合物，其中植物乳桿菌菌株選自植物乳桿菌299，DSM6595和植物乳桿菌299v，DSM9843。5.權利要求1-4的任意項的藥物組合物，其中精氨酸是L-精氨酸。6.權利要求1-5的任意項的藥物組合物，用於口服或直腸給藥。7.權利要求1-6的任意項的藥物組合物，用於治療哺乳動物，包括人的急性肝損傷和衰竭及相關的細菌轉移。8.一種用於哺乳動物，包括人的急性肝損傷和衰竭及相關的細菌轉移的，治療性和/或預防性處置的方法，它包括權利要求1-6的藥物組合物的治療有效劑量的給藥。9.一種藥物組合物，包括植物乳桿菌菌株和精氨酸的結合用於治療。10.權利要求1-6和9的任一的組合物，在製造哺乳動物，包括人，的急性肝損傷和衰竭及相關的細菌轉移的治療性和/或預防性處置藥物的應用。全文摘要本發明涉及藥物組合物,其包含有具有體內於人腸黏膜移生的能力的植物乳桿菌菌株,與精氨酸和可藥用載體相組合,本組合物用於哺乳動物,包括人的肝損傷和衰竭以及相關細菌轉移的預防和/或治療。文檔編號A61P31/04GK1190346SQ96195399公開日1998年8月12日申請日期1996年5月8日優先權日1995年5月9日發明者D·阿達維,B·傑普森,G·莫林申請人:普羅比公司