凝膠阻滯色譜柱上聚合製備窄分布低分子量聚合血紅蛋白的方法
2023-06-11 13:24:11
專利名稱：凝膠阻滯色譜柱上聚合製備窄分布低分子量聚合血紅蛋白的方法
技術領域：
本發明屬於生物醫學領域，涉及一種用凝膠阻滯色譜柱上聚合平均分子量小於200kD且分子量分布較窄聚合血紅蛋白的製備方法。
背景技術：
輸血是臨床醫學中一種安全可靠的療法，尤其在急救醫學中的作用是任何其他手段無法完全替代的。隨著科學的發展，輸血的用途越來越廣泛，血液需求也日益增加。但實際應用時還存在著許多難題，如血源短缺，有效儲存期短；輸血前必須經過嚴格的血型鑑定和交叉配血試驗，煩瑣費時；同時輸血過程可能發生不良反應和某些傳染病的傳播，如乙型、C型肝炎，愛滋病等。隨著人們對血液製品安全性要求的不斷提高，血液代用品的研究越來越受到重視。尤其是基於血紅蛋白的血液代用品不但可以替代血紅細胞的攜氧功能、儲存方便，而且可以去除如AIDS、肝炎病毒等病原微生物。這些都預示著血紅蛋白修飾物將有很好的市場需求。用它可以救治車禍等事故中大量失血的病人。尤其是在戰爭或其他災難發生時，由於血紅蛋白修飾物不存在血液配型問題，其乾粉只需與生理鹽水混合就可以直接輸血，將挽救很多的生命。
血紅蛋白由四個亞基(α1α2β1β2)組成，是紅細胞中一種負責氧氣傳遞的蛋白。由於其獨特的氧結合特性、正常生理代謝途徑等原因，以血紅蛋白為基礎的血液代用品非常符合人體的生理需要。與紅細胞不同，由於聚合血紅蛋白中沒有膜蛋白、可以巴氏消毒，所以解決了輸血治療中存在的相關傳染病等問題。同時，聚合血紅蛋白可以在室溫下長時間保存，突破了人血保存和運輸條件要求較嚴，災害和戰傷搶救輸血受到限制。然而，未經修飾聚合的血紅蛋白不能作為血液代用品直接使用，這主要是因為(1)未經修飾的血紅蛋白會失去2，3-二磷酸甘油酸的調節，使得血紅蛋白對氧的結合力升高，不能向組織有效供氧。(2)未經聚合的血紅蛋白會使血漿的膠體滲透壓升高。(3)未經聚合的血紅蛋白四聚體在體內的循環半衰期只有2～4小時，會迅速分解成二聚體和單體從腎臟濾過形成血尿。只進行分子內聚合的四聚體會進入血管的內皮細胞，與其中的NO結合引發血壓升高、腹痛等副作用。
1975年Benesch等用5』-磷酸吡哆醛對血紅蛋白的2，3-DPG空穴進行修飾，使P50提高至30mmHg以上。但這種修飾後的血紅蛋白穩定性較差，可以用雙官能團或多官能團的交聯劑進行分子內和分子間的交聯，生成多聚血紅蛋白，以提高穩定性、降低膠體滲透壓和攜氧能力。目前最廣泛使用的交聯劑有戊二醛和開鏈棉子糖。
Northfield公司開發了戊二醛聚合磷酸吡哆醛人血紅蛋白PolyHeme(US Patent No.6,552,173)。PolyHeme中四聚體血紅蛋白濃度低於1％，有效地避免了腎毒性和四聚體血紅蛋白和NO結合而引起副作用。PolyHeme的血紅蛋白濃度為14g/dl，滲透壓為20-25mmHg，P50為28-30mmHg[15]。這些指標均與全血相近。目前，該產品已進入III期臨床試驗。1998年，Biopure公司的戊二醛聚合牛血紅蛋白HemopureTM經FDA批准進入III期臨床試驗(US Patent No.5,955,581)。牛血紅蛋白的優點在於來源廣泛，無需2，3-DPG的修飾就可以達到很大的P50值。HemopureTM中的濃度達13±1g/dl，高鐵血紅蛋白含量小於15％，P50為34mmHg，膠體滲透壓為17mmHg，而粘度只有全血的三分之一。此外，Hemosol公司開發了開環棉籽糖聚合血紅蛋白HemolinkTM。棉籽糖經高碘酸氧化得到含有6個醛基的開環棉籽糖(US Patent No.5,770,727)。開環棉籽糖的醛基可以與血紅蛋白上的2，3-DPG結合空穴中的氨基進行特異性反應，也可以和Hb表面氨基進行非特異性反應。最終產物中約含40％分子內交聯產物聚合血紅蛋白(64kD)和60％的分子間交聯產物(128kD-600kD)[17-18]。HemolinkTM中蛋白含量為10g/dl，P50為34mmHg，膠體滲透壓為24mmHg。
戊二醛是一種同型雙功能交聯劑，它的兩個醛基可以分別和兩個相同或不同的氨基生產希夫鹼。通常，戊二醛交聯可以生成65-85％的聚合血紅蛋白。但由於戊二醛的反應活性高、無特異性反應位點，所以其聚合產物分子量分布寬、平均分子量較大。儘管這種聚合血紅蛋白分子的分子量分布不會改變它的載氧特性，但會降低血漿的膠體滲透壓並增加粘度，進而影響其血液動力學特性。因此，FDA在回復Biopure公司戊二醛聚合牛血紅蛋III期臨床批文中明確要求降低平均分子量。此外，寬的分子量分布也會給後續的分離過程帶來很大麻煩。因此，如何製備窄分布低分子量聚合血紅蛋白降低其粘度和流動性就成為了該領域的研究的重點和難點。一種解決方法是用新型交聯劑，如聚胺類交聯劑等來製備分子量分布較窄的聚合血紅蛋白。但是這些交聯劑價格昂貴、分子量分布仍然較寬、需要進行大量毒理學評價，因而至今還沒有一種產品進入臨床研究。中國科學院北京過程研究所蘇志國、胡濤創造性地提出了另一種解決方法(中國專利No.01136190.5)。其具體方法是將血紅蛋白在pH＝7～9的環境下靜態吸附於陰離子交換介質上用200～500倍戊二醛進行交聯。最終得到分子量專一(128kD)的血紅蛋白。但此方法也存在一些問題如陰離子交換介質的利用率低(0.5-4mg血紅蛋白/ml固相)、使用高摩爾比的戊二醛會使血紅蛋白過度修飾、使用不含氨基的HEPES緩衝體系價格昂貴等。
發明內容
本發明的目的在於提供一種凝膠阻滯色譜柱上聚合製備窄分布低分子量聚合血紅蛋白的方法，它是一種獨有的聚合血紅蛋白的製備方法。
本發明的技術方案一種凝膠阻滯色譜柱上聚合製備窄分布低分子量聚合血紅蛋白的方法，其步驟包括(1)將天然血紅蛋白進行化學修飾或預聚合；(2)將修飾或預聚合的血紅蛋白充分脫氧後用泵加入凝膠阻滯色譜柱中平衡，然後分步加入雙功能交聯劑進行聚合反應，血紅蛋白溶液濃度為1～100mg/ml，血紅蛋白與雙功能交聯劑的摩爾比為1∶10～1∶50；(3)用緩衝溶液將步驟1生成的聚合產物洗脫、收集。收集液用甘氨酸或賴氨酸中止反應，戊二醛與甘氨酸(賴氨酸)的摩爾比為2～10∶1，反應時間1～3小時，最後超濾濃縮；(4)採用硼氫化鈉對得到的聚合血紅蛋白進行還原處理後，再用超濾、層析等方法對該產物進行分離純化，得到窄分布、平均分子量在200kD以下的聚合血紅蛋白。
上述步驟(1)中所用的血紅蛋白來源於人血紅蛋白、牛血紅蛋白、豬血紅蛋白或其它哺乳動物血紅蛋白。
上述步驟(1)中加入適量修飾劑、分子內交聯劑或其他雙功能交聯劑進行預交聯。例如用分子內交聯劑，如1～4倍摩爾比的NFPLP、DBBF或其他雙功能交聯劑如3～8倍摩爾比戊二醛進行預交聯。
上述步驟(2)中加入的雙功能交聯劑為戊二醛、乙二醛、乙醇醛等。
上述步驟(2)中色譜柱填料為凝膠阻滯色譜介質，緩衝液pH值為5.0～9.0。
上述步驟(2)中脫氧方法，包括減壓真空抽氣脫氧與惰性氣體鼓泡式脫氧。
上述步驟(2)所述的反應時間為3～20小時。
上述步驟(2)所述的反應溫度為0～30℃。
上述步驟(2)中血紅蛋白與同型雙功能試劑摩爾比為1∶10～50。
本發明的工作原理為我們提出了自己的原創思想——在色譜柱上創造一個動態的不對稱環境，以達到均一聚合。即在原有反應裝置上加裝一個根據分子尺寸進行分離的凝膠阻滯色譜柱。而當聚合度增大的時候，分子尺寸必然增大。因此，凝膠阻滯色譜柱可以對血紅蛋白四聚體和聚合度不同的聚合血紅蛋白進行分離。當混合液在反應體系中循環時，四聚體和聚合度較低的聚合血紅蛋白會因為保留時間較長，而在色譜柱中富集。如果在色譜柱以外的部分Hb濃度較低且溶液中含有戊二醛，則聚合反應主要在色譜柱中進行。聚合度較高的聚合血紅蛋白在色譜柱中的時間短，抑止了其進一步的聚合，使得聚合反應趨於均一化。我們在此思想基礎上確立了獨有的製備方法。該方法具有收率高(＞60％)、使用低摩爾比的戊二醛不會使血紅蛋白過度修飾、離子交換介質的利用率高(1～100mg/ml血紅蛋白/ml固相)、使用價格便宜的PBS緩衝體系等優點。不但如此，由於緩衝溶液的pH值以及離子強度對凝膠阻滯色譜的分離過程無明顯影響，所以該方法適用於較大的pH(5.0～9.0)和離子強度範圍。進而影響氨基的反應活性以及聚合反應的反應時間。
本發明選用的血紅蛋白可為人血紅蛋白，是從人紅細胞中純化出來的。紅細胞破膜後血紅蛋白丟失了效應劑2，3-二磷酸甘油酸。這使得比人血紅蛋白對氧的結合力明顯上升，必須經過2，3-DPG位點進行化學修飾。另外，本發明也可適用於其它來源的血紅蛋白，如牛血紅蛋白、豬血紅蛋白。使用本發明所述方法以牛血紅蛋白和豬血紅蛋白為原料，與戊二醛反應後，所得結果與人血紅蛋白的製備結果相似。
本發明使用的血紅蛋白是根據標準的已知技術來提取和製備的。首先收集並裂解人紅細胞。通過超速離心、過濾等方法除去細胞碎片和細胞基質。最後，用DEAE纖維素離子交換選擇吸附的方法除去雜蛋白，獲得純化的人血紅蛋白。純化血紅蛋白要經過PLP修飾，在低溫下保存。血紅蛋白在天然狀態下可分為脫氧血紅蛋白和氧合血紅蛋白。脫氧血紅蛋白在構象上處於緊張態(T態)，而氧合血紅蛋白在構象上處於鬆弛態(R態)。由於T態被視為血紅蛋白在紅細胞中天然存在的構象，因而脫氧血紅蛋白的氧結合性能更能滿足人的需要，本發明也利用脫氧血紅蛋白製備聚合血紅蛋白。血紅蛋白脫氧形成脫氧血紅蛋白是在與戊二醛反應之前進行的。本發明採用充入氮氣的方法來完成血紅蛋白的脫氧過程，色譜柱的填料和緩衝液抽去空氣，聚合反應在氮氣保護下進行。
本發明在柱上聚合之前可以使用分子內交聯劑，如1～4倍摩爾比的NFPLP、DBBF或其他雙功能交聯劑，如3～8倍摩爾比戊二醛進行預交聯。
本發明採用柱上聚合法製備聚合血紅蛋白，為了使血紅蛋白四聚體進行較為均一的聚合，我們將在原有反應裝置上加裝一個可以對血紅蛋白四聚體進行富集的色譜柱，這根色譜柱可以對血紅蛋白四聚體和聚合度不同的聚合血紅蛋白進行分離。當混合液在反應體系中循環時，四聚體和聚合度較低的聚合血紅蛋白會因為保留時間較長，而在色譜柱中富集。如果在色譜柱以外的部分Hb濃度較低且溶液中含有戊二醛，則聚合反應主要在色譜柱中進行。聚合度較高的聚合血紅蛋白在色譜柱中的時間短，抑止了其進一步的聚合，使得聚合反應趨於均一化。在製備過程中，吸附的血紅蛋白在固相上的密度以及與參與反應的戊二醛的摩爾比、反應溫度、反應時間、緩衝液的性質及其pH值，對於製備的聚合血紅蛋白的純度及其產率有很大的影響。
本發明採用0～30℃作為反應溫度，填料採用的是凝膠阻滯色譜介質，所使用緩衝液的pH值在5～9之間。反應時間隨pH值減小而增大，所以反應一般為3～20小時。時間再延長，聚合血紅蛋白的產率不再增加。血紅蛋白與色譜填料的比例以及與戊二醛的摩爾比，對於製備的聚合血紅蛋自分子量的均性至關重要。本發明在1～100mg血紅蛋白/ml填料和戊二醛與血紅蛋白摩爾比為10～50∶1的範圍內優化反應物的配比。實驗結果表明在20～60mg血紅蛋白/ml填料和1 5～30∶1(戊二醛與血紅蛋白的摩爾比)的配比下，聚臺血紅蛋白基本上是兩個分子聚合的血紅蛋白，而且產率較高。而高於這一配比，聚合血紅蛋白的產率有所增加，但是有較多聚血紅蛋白生成。因此，本發明採用這一配比製備聚合產物。
圖1為本發明所涉一種凝膠阻滯色譜柱上聚合製備窄分布低分子量聚合血紅蛋白的方法的裝置圖。
其中1、儲液器，2、泵，3、色譜柱。
圖2為本發明所涉一種凝膠阻滯色譜柱上聚合製備窄分布低分子量聚合血紅蛋白的方法的聚合血紅蛋白樣品的SEC-HPLC結果曲線圖。
具體實施例方式以下將通過具體實施方式
的形式再對本發明的上述內容做進一步的詳細說明，但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅局限於以下的具體實施方式
，凡基於本發明上述內容所實現的技術均屬於本發明的範圍。
實施例1取5g濃度為75mg/ml的PLP修飾後的人血紅蛋白溶液(pH＝7.4)在20℃通氮2小時，使血紅蛋白處於脫氧狀態。裝填Φ1.6×30cm Superdex S-300凝膠阻滯交換柱，用脫氧後的10mM PBS(pH＝7.4)緩衝液平衡(裝置圖見圖1)。將血紅蛋白溶液泵入色譜柱中循環，並使儲液器中溶液最終體積為40ml。1小時後，分10次每隔0.5小時，向儲液器中加入7.7ml戊二醛。繼續反應2小時。最後用10mM PBS緩衝液(pH7.4)洗脫。收集物超濾濃縮後，用硼氫化鈉還原。超濾濃縮。收集物用TSK 3000sw凝膠過濾柱，流動相為1/15M PBS+0.1M NaCl(pH7.2)，流速為0.50ml/min，洗脫物在280nm紫外光下檢測。可檢測到3個洗脫峰(色譜圖見圖2)。根據洗脫時間，可確定前兩個洗脫峰的分子量均小於200kD。第三個為未反應的血紅蛋白。
權利要求
1.一種凝膠阻滯色譜柱上聚合製備窄分布低分子量聚合血紅蛋白的方法，其特徵在於它包括以下步驟(1)將天然血紅蛋白進行化學修飾或預聚合。(2)將修飾或預聚合的血紅蛋白充分脫氧後用泵加入凝膠阻滯色譜柱中平衡，然後分步加入雙功能交聯劑進行聚合反應，血紅蛋白溶液濃度為1～100mg/ml，血紅蛋白與雙功能交聯劑的摩爾比為1∶10～1∶50。(3)用緩衝溶液將步驟1生成的聚合產物洗脫、收集。收集液用甘氨酸或賴氨酸中止反應，戊二醛與甘氨酸(賴氨酸)的摩爾比為2～10∶1，反應時間1～3小時。最後超濾濃縮。(4)採用硼氫化鈉對得到的聚合血紅蛋白進行還原處理後，再用超濾、層析等方法對該產物進行分離純化，得到窄分布、平均分子量在200kD以下的聚合血紅蛋白。
2.根據權利要求1所述的凝膠阻滯色譜柱上聚合製備窄分布低分子量聚合血紅蛋白的方法，其特徵在於步驟(1)中所用的血紅蛋白來源於人血紅蛋白、牛血紅蛋白、豬血紅蛋白或其它哺乳動物血紅蛋白。
3.根據權利要求1所述的凝膠阻滯色譜柱上聚合製備窄分布低分子量聚合血紅蛋白的方法，其特徵在於步驟(1)中加入適量修飾劑、分子內交聯劑或其他雙功能交聯劑進行預交聯。例如用分子內交聯劑，如1～4倍摩爾比的NFPLP、DBBF或其他雙功能交聯劑如3～8倍摩爾比戊二醛進行預交聯。
4.根據權利要求1所述的凝膠阻滯色譜柱上聚合製備窄分布低分子量聚合血紅蛋白的方法，其特徵在於步驟(2)中加入的雙功能交聯劑為戊二醛、乙二醛、乙醇醛等。
5.根據權利要求1所述的凝膠阻滯色譜柱上聚合製備窄分布低分子量聚合血紅蛋白的方法，其特徵在於步驟(2)中色譜柱填料為凝膠阻滯色譜介質，緩衝液pH值為5.0～9.0。
6.根據權利要求1所述的凝膠阻滯色譜柱上聚合製備窄分布低分子量聚合血紅蛋白的方法，其特徵在於步驟(2)中脫氧方法，包括減壓真空抽氣脫氧與惰性氣體鼓泡式脫氧。
7.根據權利要求1所述的凝膠阻滯色譜柱上聚合製備窄分布低分子量聚合血紅蛋白的方法，其特徵在於步驟(2)所述的反應時間為3～20小時。
8.根據權利要求1所述的凝膠阻滯色譜柱上聚合製備窄分布低分子量聚合血紅蛋白的方法，其特徵在於步驟(2)所述的反應溫度為0～30℃。
9.根據權利要求1所述的凝膠阻滯色譜柱上聚合製備窄分布低分子量聚合血紅蛋白的方法，其特徵在於步驟(2)中血紅蛋白與同型雙功能試劑摩爾比為1∶10～50。
全文摘要
一種凝膠阻滯色譜柱上聚合製備窄分布低分子量聚合血紅蛋白的方法，它將天然血紅蛋白用泵加入凝膠阻滯色譜中平衡，然後分布加入雙功能交聯劑進行聚合反應，反應溫度為0～30℃，pH值為5.0～9.0反應時間3～10小時；血紅蛋白溶液濃度為1～100mg/ml，血紅蛋白與雙功能交聯劑的摩爾比為1∶10～1∶50。用氨基的緩衝溶液將生成的聚合產物洗脫、收集。收集液用甘氨酸或賴氨酸中止反應，戊二醛與甘氨酸(賴氨酸)的摩爾比為2～3∶1。超濾濃縮。採用硼氫化鈉對得到的聚合血紅蛋白進行還原處理後，再用超濾、層析等方法對該產物進行分離純化，得到窄分布、平均分子量在200kD以下的聚合血紅蛋白。
文檔編號A61P7/00GK1990038SQ20051013602
公開日2007年7月4日 申請日期2005年12月28日 優先權日2005年12月28日
發明者楊成民, 王翔, 黃磊, 李燊, 張鴻輝, 梁偉光, 李洪英, 許麗麗, 王勁峰, 由英才 申請人:天津協和生物科技發展有限公司