骨化三醇或骨化二醇的生產促進用緩衝液組合物及利用其的骨化三醇或骨化二醇的製造方法

2023-06-11 23:00:46

專利名稱：骨化三醇或骨化二醇的生產促進用緩衝液組合物及利用其的骨化三醇或骨化二醇的製造方法
技術領域：
本申請以2008年12月19日申請的韓國專利申請第10-2008-0130707號為優先， 所述說明書的全部內容為本申請的參考文獻。本發明涉及一種骨化三醇或骨化二醇的生產促進用緩衝液組合物及利用其的骨化三醇或骨化二醇的製造方法，尤其涉及以金屬化合物、有機溶劑、環糊精、三(羥基甲基) 氨基甲烷、琥珀酸鈉、氯化鈉、氯化鎂(magnesium chloride)及水等組成。
背景技術：
骨化三醇通常用於典型的老年疾病-骨質疏鬆的治療上，活性維生素D3的骨化二醇用於骨軟化症等治療上。在肝臟和腎臟中維生素D3作為生物體內的物質可以以口服形式投藥，其由各兩次的羥基失火中生成骨化三醇。在生理學上，促進從胃腸道和腎臟的鈣和磷的吸收，從而具有良好的骨質疏鬆的治療效果而有名。並且，骨化三醇也使用於佝僂病、骨軟化症、甲狀旁腺功能低下症、慢性腎功能衰竭症、血液透析患者的腎性骨營養不良症、皮膚疥瘡症等治療上，並近年來多次報導了前列腺癌或白血病的治療效果。眾所周知，製造骨化三醇或骨化二醇的現有方法有有機化學合成法和通過微生物發酵的生產方法。有機化學合成法要考慮到化學結構上的立體特異性和區域專一性並在碳素源1號或25號的位置上以選定的導入羥基，因此需要高難度技術和高價的反應過程等缺點，但已開發了改善這些缺點的通過微生物發酵的生物轉化生產方法。通過微生物發酵的生物轉化反應已被證明有著立體特異性並區域專一性。因此，活性維生素D3的生產方法可以由通過生物轉化的有經濟效益的方法來代替，其從現有的有機合成法中利用微生物的氫氧化功能。但是，通過微生物發酵的現有的生物轉化方法，發現了如下的幾種缺點。第一，由於通過微生物培養的生產方法，所以有汙染的可能性，並隨著生產規模的變大而其可能性也變大。特別是，培養時間越長其暴露的汙染更加嚴重，並且這些汙染是由於與本培養的同時投入的維生素D3的其後發生，所以汙染的同時會損失前體的費用。第二，通過發酵的生物轉化可能會出現較大的產率變化幅度。因為這是根據微生物特有的培養敏感度，所以是不可避免的事項，為此培養室的內部需要在一定條件下的恆定性維持。第三，相應的生產設施的總體維持管理費用會增加。第四，由於已經達到了最大值的生產率， 所以是沒有更多提高的停滯狀態，因此不能說擁有最高的競爭力。第五，由於據雜質的分離精製的障礙，因此可能會算出過高的分離費用。由於培養液整個兒中只把特定物質進行分離精製，因此分離精製規模要大並且費用也會按比例增加。因此，克服這些缺點開發以高產量生產高純度骨化三醇或骨化二醇的新的生產方法是當務之急。

發明內容
為了克服通過這些發酵的生產方法的缺點，本發明的發明者們研究了作為生物轉化方法的非發酵的方法的全細胞生物催化反應方法，並確認了根據本發明的微生物的假諾卡菌屬自養小球藻ID9302具有生產骨化三醇和骨化二醇的生物催化功能，並開發了優越增加骨化三醇和骨化二醇的生產力的緩衝組合物，由此完成了本發明。因此，本發明的目的在於提供骨化三醇或骨化二醇的生產促進用緩衝液組合物， 其以FeCl2、FeCl3、FeS04、MnCl2、及ZnSO4組成的群中選定的1個以上的金屬化合物為0. 01 M0. 3% (w/v)；以乙醇、甲醇、丙酮及二甲基亞碸(Dimethyl Sulfoxide，DMS0)組成的群中選定的1個以上的有機溶劑為1至10% (w/v)；環糊精為0.1至5% (w/v)；三(羥基甲基) 氨基甲烷(Tris(hydroxymethy 1)aminomethane)為 0.01 至 (w/v)；琥珀酸鈉(sodium sue ι inate)為 0. 01 至 (w/v)；氯化鈉(sodium chloride)為 0. 01 至 (w/v)；氯化鎂(magnesium chloride)為 0. 001 至 0. 5% (w/v)及剩餘的水等組成。本發明的另一目的在於提供骨化三醇或骨化二醇的製造方法，其包含如下步驟 培養步驟，對假諾卡菌屬自養小球藻進行培養；回收步驟，回收所述培養液中的菌體；以及混合步驟，對所述回收的菌體，維生素D3及所述骨化三醇或骨化二醇的生產促進用緩衝液組合物進行混合。為了實現上述目標，本發明提供了骨化三醇或骨化二醇的生產促進用緩衝液組合物，其以FeCl2、FeCl3、FeSO4, MnCl2、及ZnSO4組成的群中選定的1個以上的金屬化合物為 0.01至0.3% (w/v)；以乙醇、甲醇、丙酮及二甲基亞碸(Dimethyl Sulfoxide, DMS0)組成的群中選定的1個以上的有機溶劑為1至10% (w/v)；環糊精為0. 1至5% (w/v)；三(羥基甲基)氨基甲烷(Tris(hydroxymethy 1)aminomethane)為 0.01 至 (w/v)；琥珀酸鈉(sodium sue ι inate)為 0· 01 至 (w/v)；氯化鈉(sodium chloride)為 0· 01 至 (w/v)；氯化鎂(magnesium chloride)為 0.001 至 0.5% (w/v)及剩餘的水等組成。為了實現本發明的另一目標，本發明提供了骨化三醇或骨化二醇的製造方法，其包含如下步驟培養步驟，對假諾卡菌屬自養小球藻進行培養；回收步驟，回收所述培養液中的菌體；以及混合步驟，對所述回收的菌體，維生素D3及所述骨化三醇或骨化二醇的生產促進用緩衝液組合物進行混合。以下，對本發明的內容進行更詳細的說明。本發明的組合物的特徵在於，以金屬化合物、有機溶劑、環糊精、三(羥基甲基)氨基甲燒(Tris (hydroxymethy 1) aminomethane)、琥拍酸鈉(sodium sue ι inate)、氯化鈉 (sodium chloride)、氯化鎂(magnesium chloride)及水等組成。本發明的組合物造成了菌體能夠穩定生存的環境，其以三(羥基甲基)氨基甲烷、 琥珀酸鈉、氯化鈉及氯化鎂為基本結構。本發明的組合物的三(羥基甲基)氨基甲烷、琥珀酸鈉、氯化鈉及氯化鎂在不影響本發明的組合物的骨化三醇或骨化二醇的生產促進功效的範圍內無特殊限制，但優選的可以為，以三(羥基甲基)氨基甲烷為0.01至(w/v)的濃度、琥珀酸鈉為0.01至(w/v)的濃度、氯化鈉為0.01至(w/v)的濃度、氯化鎂為 0.001至0.5% (w/v)的濃度添加，最優選的可以為，以三(羥基甲基)氨基甲烷為0.12至 0. 61% (w/v)的濃度、琥珀酸鈉為0. 16至0.8% (w/v)的濃度、氯化鈉為0. 06至0. 18% (w/v)的濃度、氯化鎂為0. 006 Mo. 05% (w/v)的濃度添加。
本發明的環糊精是多個葡萄糖分子以a_l，4結合的環狀的非還原糖，並由於疏水性的內部和親水性的外部而形成主客體包合物，從而使維生素D3基板穩定於緩衝液內。本發明的環糊精可以為α-環糊精、β-環糊精，Y-環糊精或甲基β-環糊精，最優選的可以為環糊精。本發明的環糊精的濃度在不影響本發明的組合物的骨化三醇或骨化二醇的生產促進功效的範圍內無特殊限制，但優選的可以為0. 1至5% (w/v)，更優選的可以為 0. 25 至 1 % (w/v)。本發明的有機溶劑使不溶性物質的基板的溶解度增加。本發明的有機溶劑可以為乙醇、甲醇、丙酮或二甲基亞碸(DMSO)，最優選的可以為甲醇。本發明的有機溶劑的濃度在不影響本發明的組合物的骨化三醇或骨化二醇的生產促進功效的範圍內無特殊限制，但優選的可以為1至10% (w/v)，更優選的可以為2. 5至10% (w/v) 0本發明的金屬化合物使電子轉移活性化，從而使基板轉換為骨化三醇或骨化二醇的效率增加。本發明的金屬化合物在不影響本發明的組合物的骨化三醇或骨化二醇的生產促進功效，同時是發生金屬離子的化合物就無特殊限制，但優選的可以為FeCl2、FeCl3、 FeSO4, MnCl2、及ZnSO4，最優選的可以為MnCl2。本發明的金屬化合物的濃度在不影響本發明的組合物的骨化三醇或骨化二醇的生產促進功效的範圍內無特殊限制，但優選的可以為 0.01 至 0.3% (w/v)，更優選的可以為 0.01 至 0.03% (w/v)。本發明的骨化三醇或骨化二醇的生產促進用緩衝液組合物具有良好的促進骨化
三醇或骨化二醇生產的效果。一方面，本發明的骨化三醇或骨化二醇的製造方法，其特徵包含如下步驟(a)培養步驟，對假諾卡菌屬自養小球藻進行培養；(b)回收步驟，回收所述培養液中的菌體；(C) 混合步驟，對所述回收的菌體、維生素D3及本發明的骨化三醇或骨化二醇的生產促進用緩衝液組合物進行混合。在所述步驟(a)中培養假諾卡菌屬自養小球藻。本發明的假諾卡菌屬自養小球藻的培養可以利用通常使用的微生物接種及培養方法。接種在培養條件下以便假諾卡菌屬自養小球藻充分的增殖，使所培養的假諾卡菌屬自養小球藻適量的添加至培養基而進行。接種的假諾卡菌屬自養小球藻的量可以使所培養的假諾卡菌屬自養小球藻培養液以1至5% (w/v)左右添加至培養基。假諾卡菌屬自養小球藻的培養可以根據該領域中已知的培養基和培養條件形成。上述過程要是本領域的技術人員就可以根據選定的菌株進行輕易的調整而使用。這些各種方法已公開在各種文獻中，例如為詹姆斯等人(James et al.)、生化工禾呈(Biochemical Engineering)、普倫蒂斯霍爾 15 際片反(Prentice-HallInternational Editions)等。根據細胞的成長方式分為懸浮培養和附著培養，根據培養方法分為分批式培養、流加式培養、連續式培養。培養基可以使用為碳源、氮源、維生素及礦物質組成的培養基。用於本發明的培養物生產的培養基中可作為所述的碳素源為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、乳糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖及其的組合組成的群中選定的1個以上，更優選的為葡萄糖。用於本發明的培養物生產的培養基中可作為所述的氮素源為酵母提取物、大豆蛋白腖(soytone)、蛋白腖、牛肉提取物、胰腖、酪腖及其的組合組成的群中選定的1個以上，更優選的為酵母提取物。所述步驟(a)的假諾卡菌屬自養小球藻凡是同類的微生物就無論是什麼都有可能，並其範圍包含著假諾卡菌屬自養小球藻種的所有亞種或變種。優選的可以為假諾卡菌 MID9302(Pseudonocardia autotrophica ID9302)。根據本發明的生物催化劑的假諾卡菌屬自養小球藻ID9302於2001年6月7日寄託給韓國生物科學研究院的生物資源中心(KCTC)(寄託號KCTC 1029BP)。在所述步驟(b)中回收所述培養液中的菌體。本發明的菌體回收方法如果是通常使用的菌體回收方法就可以無限制使用，其為了使菌體以生存狀態回收。優選的可以為離心分離方法。優選的可以為用於除去培養液內的營養成分而回收的菌體能夠以緩衝清洗， 並所述清洗用緩衝液優選的可以為，本發明的骨化三醇或骨化二醇的生產促進用緩衝液組合物。在所述步驟(C)中混合所述回收的菌體、維生素D3及本發明的骨化三醇或骨化二醇的生產促進用緩衝液組合物。在步驟(c)中所述回收的菌體被本發明的骨化三醇或骨化二醇的生產促進用緩衝液組合物鬆脫，從而執行了使基板維生素D3轉換為骨化三醇或骨化二醇的功能。步驟(c)的混合根據本發明的製造方法，只要在生產骨化三醇或骨化二醇的情況下就能夠使用任何順序或方法，例如先把維生素D3溶解於公知的溶劑後，使其與所述回收的菌體已鬆脫的本發明的骨化三醇或骨化二醇的生產促進用緩衝液組合物中進行混合，或先把促進本發明的骨化三醇或骨化二醇生產的物質與維生素D3—同溶解於公知的溶劑後，使其能夠混合於所述回收的菌體被鬆脫的本發明的骨化三醇或骨化二醇生產促進用緩衝液組合物中。凡是有助於所述公知的維生素D3的溶解就可以使用任何溶劑，例如可以為甲醇、乙醇、丙酮、二甲基亞碸(DMSO)或其的混合物，並促進所述本發明的骨化三醇或骨化二醇生產的物質，例如可以為環糊精、克列莫佛(cremophor)、聚乙二醇、二丙二醇、雙胞胎 85、雙胞胎80或聚乙二醇300.並且，使1次要反映的上述維生素D3的量全部投入或分批投入或適當的維持混合物內的維生素D3的濃度的同時能夠不斷地投入。混合狀態根據所述回收的菌體而考慮維生素D3轉換為本發明的骨化三醇或骨化二醇的效率和菌體的生產率等，從而能夠多種多樣的持續下去，並優選的可以為4日至10日。在維持混合狀態的過程中，為了高效率的骨化三醇或骨化二醇生產或維持菌體的生存，可以維持適當的Ph、攪拌狀態及氣流量，這些過程如果是本領域的技術人員就能夠輕易的進行調整。 在本發明的一實施例中培養了假諾卡菌屬自養小球藻ID9302，並通過離心分離至回收了菌體從而製造了 GAC (生長-停止細胞growth-arrested cells)。用此在各種種類的緩衝組成中測定了利用維生素D3的骨化三醇或骨化二醇各個的生產率。結果，以三(羥基甲基)氨基甲烷為25mM、琥珀酸鈉為25mM、氯化鈉為20mM、氯化鎂為4mM組成的TSSM緩衝液中確認了骨化三醇或骨化二醇各個的生產率為最良好(參照實施例1)。使TSSM緩衝液為基本緩衝液組成，從而為了提高骨化三醇或骨化二醇的生產率進行了添加各種物質的實驗。在本發明的另一實施例中，添加了不同濃度的環糊精，從而測定了骨化三醇或骨
化二醇的生產率變化。結果，確認了環糊精使骨化三醇或骨化二醇生產量增加，特別是，確認了在添加說明書
5/19 頁
β -環糊精時生產量升高(參照實施例2)。在本發明的另一實施例中，添加了各種有機溶劑，從而測定了骨化三醇或骨化二
醇的生產率變化。結果，確認了根據有機溶劑的投入而使骨化三醇及骨化二醇的生產量增加，特別是，確認了在添加甲醇時生產量升高(參照實施例3)。並且，確認了在同時添加環糊精和有機溶劑時的生產量比單獨添加環糊精或有機溶劑時的生產量明顯升高(參照實施例4)。在本發明的另一實施例中，添加了各種不同濃度的金順化合物，從而測定了骨化
三醇或骨化二醇的生產率變化。結果，確認了在與濃度無關投入CuCl2、CuS04、CoCl2、CoS04時骨化三醇及骨化二醇的生產量為減少或者沒有形成，但是，在投入FeCl2、FeCl3、FeSO4, ZnSO4或MnCl2時使骨化三醇或骨化二醇的生產量升高。特別是，確認了在投入21^04或胞(12時生產量的增加為明顯(參照實施例6)。在本發明的另一實施例中，測定了根據pH變化的骨化三醇及骨化二醇的生產率變化。結果，確認了根據pH而骨化三醇或骨化二醇的生產量有了變化，並且當pH為7. 0 至7. 4時顯示為骨化三醇及骨化二醇的高生產量(參照實施例7)。在本發明的另一實施例中，把根據上述過程而決定的本發明的骨化三醇或骨化二醇的生產促進用緩衝液組合物與有機溶劑和金屬化合物進行各種調節後在75L的發酵槽
中大量生產了骨化三醇或骨化二醇。結果，本發明的骨化三醇或骨化二醇的生產促進用緩衝液組合物，在FeCl2、FeCl3、 FeSO4的濃度為0.01%時，各個顯示為53. 12mg/L，60. 8mg/L，62. 42mg/L的骨化三醇的生產量，並在ZnSO4的濃度為0. 01%時，顯示為77. 18mg/L的骨化三醇的生產量。特別是，在 MnCl2的濃度為0. 03%時，顯示為90. 12mg/L的骨化三醇的生產量以及166. 87mg/L的骨化二醇的生產量(參照實施例8)。由此，確認了包含FeCl2、FeCl3、FeS04、ZnS04或MnCl2的本發明的組合物顯示為良好的骨化三醇或骨化二醇的生產量。並且，區別於有機溶劑的種類後大量生產的結果確認了乙醇為48. 45mg/L的骨化三醇的生產量，丙酮和DMSO各個為74. 87mgIL及70. 85mg/L的骨化三醇的生產量和 156. 37mg/L及141. 81mg/L的骨化二醇的生產量。特別是，甲醇為90. 12mg/L的骨化三醇的生產量和166. 87mg/L的骨化二醇的生產量(參照實施例9)。由此，確認了包含甲醇、乙醇、丙酮及二甲基亞碸的本發明的組合物顯示為良好的骨化三醇或骨化二醇的生產率。在本發明的另一實施例中，利用了根據上述組成而決定的本發明的骨化三醇或骨化二醇生產促進用緩衝液組合物，在75L的發酵槽中根據本發明的骨化三醇或骨化二醇的生產方法生產骨化三醇及骨化二醇後，使其進行了分離精製。根據本發明的方法生產骨化三醇或骨化二醇的結果確認了在第7天顯示為 91. 23mg/L的骨化三醇的生產率和168. 24mg/L的骨化二醇的生產率(參照實施例10)。並且，回收上述反應物並除去菌體後，使維生素D3、骨化二醇及骨化三醇進行了分罔精製。結果，獲得了純度為90%以上的骨化二醇7. 6g和純度為99%的骨化三醇2. 2g (參照實施例11)。如上所述，本發明的骨化三醇或骨化二醇的生產促進用緩衝液組合物或製造方法，因除去培養液並在緩衝液狀態下使維生素D3和菌體進行反應，所以在培養環境中發生的其他代謝產物的發生少，因此以所需的目標材料進行生物轉化的產量升高同時生成的雜質量少，從而進行分離精製的效率性非常高，最終，具有使原料的品質升高並減少進行分離精製的費用等效果。並且，通過高濃度反應，可以增大骨化三醇的總生產量，因此有效於骨化三醇或骨化二醇的生產。因此，本發明提供一種骨化三醇或骨化二醇的製造方法，其利用了骨化三醇或骨化二醇的生產促進用緩衝液組合物和所述組合物。本發明的製造方法具有如下優點骨化三醇或骨化二醇的生產率高；因在非微生物培養體系中的酶素反應體系中進行生物轉化， 所以不需要維持無菌狀態，並生物催化反應結束後進行分離精製時也比微生物培養法更乾淨的狀態中進行分離精製，因此分離所需的費用低廉、品質良好。並且，本發明的骨化三醇或骨化二醇的生產促進用緩衝液組合物具有提供骨化三醇或骨化二醇的優秀生產率的效果。


圖1是表示在膽固醇中進行有機合成而生產骨化三醇的工序與通過生物催化劑而在維生素D3中生產骨化三醇的工序相比較的圖。圖2是表示環糊精影響於生物催化劑反應而生物轉化為維生素D3，從而生產骨化三醇和骨化二醇的曲線圖(數字d:開始反應後的時間(日))。圖3是表示特定有機溶劑影響於生物催化劑反應而生物轉化為維生素D3，從而生
產骨化三醇或骨化二醇的曲線圖。圖4是表示β -環糊精和特定有機溶劑的混合條件影響於生物催化劑反應的曲線圖，其為了使維生素D3生物轉化而高生產骨化三醇和骨化二醇(數字d 開始反應後的時間(日))。圖5是表示在75L的發酵槽中通過生物催化劑反應而在維生素D3中生產活性維生素D3誘導體的曲線圖(數字d:開始反應後的時間(日))。圖6是表示金屬化合物影響於生物催化劑反應而生物轉化為維生素D3，從而生產骨化二醇和骨化三醇的曲線圖(D數字開始反應後的時間(日))。圖7是表示在生物催化劑反應中適當的維持pH時骨化二醇和骨化三醇的生產率的曲線圖(D數字開始反應後的時間(日))。圖8是表示在75L的發酵槽中金屬化合物影響於生物催化劑反應而生物轉化為維生素D3，從而生產骨化二醇和骨化三醇的曲線圖(D數字開始反應後的時間(日))。圖9是表示在75L的發酵槽中通過生物催化劑反應而在維生素D3中生產活性維生素D3的骨化二醇和骨化三醇的曲線圖(D數字開始反應後的時間(日))。
具體實施例方式以下，根據實施例對本發明進行詳細說明。但是，下列實施例只是對本發明舉例說明的，本發明的內容不局限於下列實施例。
確定用於骨化三醇牛產的牛物催化劑反應緩衝生物催化劑的GAC(生長-停止細胞(growth-arrested cells))為了具有通過生物催化反應使羥基導入維生素D3的能力，在各種各樣的緩衝中確認了骨化三醇的生產率。假諾卡菌屬自養小球藻ID9302的GAC製造為了使用用於本發明的骨化二醇和骨化三醇生產的生物催化劑，使假諾卡菌屬自養小球藻 ID9302 (Pseudonocardia autotrophicaID9302,以下稱為 『ID9302，)菌體在適當條件的培養基(乾酵母為0. 4%、葡萄糖為1%、澱粉為1%、魚粉為1%、氯化鈉為0. 2%、磷酸二氫鉀為0. 01 %、牛肉提取物0. 1 %、氟化鈉為0. 01 %及碳酸鈣為0. 2%、pH為7. 0%的滅菌液體培養基)中培養，並使其進行圓心分離只回收菌體後，以使用於以下實驗的生物催化反應緩衝(參照表1)各自清洗，從而除去培養液內的營養成分並製造了在下一步步驟中用於要進行生物催化反應的GAC(生長-停止細胞(growth-arrested cells))(以下稱為 『ID9302GAC，)。測定根據緩衝組合的ID9302GAC的骨化三醇及骨化二醇的生產率把以本培養基50ml準備的生物催化劑的GAC溶解於50ml的與[表1] 一樣的各種緩衝液中，其後放進250ml的三角瓶中維生素D3為5%的溶液(in ethanol) 300 μ 1放進同樣的三角瓶中，在同樣的條件下進行了 9天的振蕩反應。在第7天和第9天採取了培養液3ml，添加了抽取溶劑(二氯甲烷/甲醇=1/1 (methylene chloride/methanol = 1/1)) 6ml，混合30分鐘後採取有機溶劑層進行濃縮並以HPLC分析，從而測定了生物催化反應的產量和骨化三醇及骨化二醇各個的生產率。比較分析了與骨化三醇及骨化二醇純品一致的表示UV模式和RT的頂點，從而確認了其生產率。HPLC分析條件是色譜柱為J，sphere0DS-H80(內徑為150x4. 6mm)，流動相為使用了以磷酸PH調整為7. 2 7.3的三(羥基甲基)氨基甲烷(trisQiydroxymethyl) aminomethane,THAM) 450ml與乙腈550ml的混合溶劑並其移動速度為lml/min，檢測為使用了光電二極體陣列檢測器。表1各種種類的緩衝液對生物催化反應涉及的影響
權利要求
1.一種骨化三醇或骨化二醇的生產促進用緩衝液組合物，其特徵在於，包含 選自由 FeCl2、FeCl3、FeS04、MnCl2、及 ZnSO4(Dimethyl Sulfoxide,DMS0)組成的群中的1種以上的金屬化合物0. 01至0. 3% (w/v)；選自由乙醇、甲醇、丙酮及二甲基亞碸組成的群中的1種以上的有機溶劑1至10% (w/ν)；環糊精0. 1至5% (w/v)；三(羥基甲基)氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)0· 01 至 (w/v)琥珀酸鈉(sodium succinate)。· 01 至 (w/v)；氯化鈉(sodium chloride)0. 01 至 (w/v)；氯化鎂(magnesium chloride)0. 001 至 0. 5% (w/v)以及剩餘的水。
2.根據權利要求1所述的骨化三醇或骨化二醇的生產促進用緩衝液組合物，其特徵在於，所述金屬化合物為0. 01至0. 03% (w/v)，所述有機溶劑為2. 5至10% (w/v)，所述環糊精為0.25至(w/v)，所述三(羥基甲基)氨基甲烷為0. 12至0.61% (w/v)，所述琥珀酸鈉為0. 16至0. 8% (w/v)，所述氯化鈉為0. 06 M0. 18% (w/v)以及所述氯化鎂為0. 006 M0. 05% (w/v) ο
3.根據權利要求1所述的骨化三醇或骨化二醇的生產促進用緩衝液組合物，其特徵在於，所述金屬化合物為MnCl2。
4.根據權利要求1所述的骨化三醇或骨化二醇的生產促進用緩衝液組合物，其特徵在於，所述有機溶劑為甲醇。
5.根據權利要求1所述的骨化三醇或骨化二醇的生產促進用緩衝液組合物，其特徵在於，所述環糊精為β-環糊精。
6.一種骨化三醇或骨化二醇的生產方法，其特徵在於，包括如下步驟(a)培養步驟，對假諾卡菌屬自養小球藻進行培養；(b)回收步驟，回收所述培養液中的菌體；以及(c)混合步驟，對所述回收的菌體、維生素D3以及所述第1項至第5項中任一項的骨化三醇或骨化二醇的生產促進用緩衝液組合物進行混合。
7.根據權利要求6所述的骨化三醇或骨化二醇的生產方法，其特徵在於，所述假諾卡菌屬自養小球藻為假諾卡菌屬自養小球藻ID9302。
全文摘要
本發明涉及一種骨化三醇或骨化二醇的生產促進用緩衝液組合物及利用其的骨化三醇或骨化二醇的製造方法，尤其涉及以金屬化合物，有機溶劑，環糊精，三(羥基甲基)氨基甲烷，琥珀酸鈉，氯化鈉，氯化鎂及水組成的骨化三醇或骨化二醇的生產促進用緩衝液組合物及利用其的骨化三醇或骨化二醇的製造方法。本發明的製造方法具有如下優點骨化三醇或骨化二醇的生產率高；因在非微生物培養體系中的酶素反應體系中進行生物轉化，所以不需要維持無菌狀態，並生物催化反應結束後進行分離精製時也比微生物培養法更乾淨的狀態中進行分離精製，因此分離所需的費用低廉、品質良好。並且，本發明的骨化三醇或骨化二醇的生產促進用緩衝液組合物具有提供骨化三醇或骨化二醇的優秀生產率的效果。
文檔編號C12N1/20GK102482687SQ200980150570
公開日2012年5月30日 申請日期2009年12月10日 優先權日2008年12月19日
發明者任種赫, 姜大中, 康在勳, 鄭鉉正 申請人:一棟製藥株式會社