帶有進化免疫球蛋白結合分子的hiv蛋白酶底物分子、其製備方法及應用的製作方法

2023-06-11 09:46:26 2

專利名稱：帶有進化免疫球蛋白結合分子的hiv蛋白酶底物分子、其製備方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及HIV蛋白酶底物分子、其製備方法及應用，尤其涉及重組的帶有進化免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶底物分子、其製備方法及應用。
背景技術：
人類免疫缺陷病毒(HIV)的感染引起獲得性免疫缺陷綜合症(AIDS)，現已成為世界範圍內危害人類健康最嚴重的傳染性疾病。
人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)蛋白酶包含99個胺基酸，活性形式為同源二聚體。該酶通過切割HIV gag與gag-pol融合蛋白促進病毒顆粒的成熟。Gag蛋白的切割引起病毒體形態的改變以及核心蛋白的濃縮，切割產物與病毒體結構形成及RNA包裝密切相關。蛋白酶被包裝進病毒體及切割事件基本上與病毒從感染細胞表面出芽同時發生，或稍遲一些完成。缺少活性蛋白酶的原病毒DNA只能產生無感染性的幼稚型病毒顆粒。因此，蛋白酶是HIV複製所必需的酶，也是抗HIV藥物的重要靶位點之一。HIV蛋白酶屬於天冬氨酸酶類。兩個蛋白酶單體形成可轉動C2精確對稱結構的二聚體。活性中心具有催化活性的Asp基團位於二聚體裂縫底部的共面結構上，通常作用於Gag與Gag-Pol中的保守的胺基酸序列Ser-Thr-Xa-Ya-Phe/Pro-Za。其它的切點位於Phe與Tyl之間也可位於Met-Met，Phe-Leu，Leu-Ala，Leu-Phe之間。現有的抗HIV蛋白酶抑制劑藥物是根據蛋白酶的結構設計的一系列HIV蛋白酶切割位點P1-P1』相似物，通過現有的蛋白酶抑制劑藥物體外篩選方法從中初篩出有效的抑制物，酶動力學實驗分析蛋白酶抑制劑對蛋白酶切割活性的抑制作用，上述大規模體外篩選所獲的候選物再用細胞模型進行鑑定，用於抗-HIV新藥的開發。與眾多HIV反轉錄酶抑制劑藥物相比，目前僅有四個蛋白酶抑制劑藥物投入臨床應用，Indinavir(Crixivan)，nelfinavir(Viracept)，ritonavir(Norvir)，and saquinavir(Invirase and Fortovase)，這些藥物都是通過模擬肽鏈結合到酶的底物結合部位而抑制蛋白酶的切割作用。
由於HIV在逆轉錄中具有高突變與頻繁重組的特性，導致病毒的核苷酸序列呈多樣性。HIV-1分為M、N和O組，僅M組又可為A到K的11個亞型。HIV-2則分為A到F六組。並且，各組及亞型均有突變株出現。並且，不僅同一感染個體不同時段體內的HIV基因序列不同，而且同一感染個體同一時段也存在不同基因序列的病毒。HIV-1與HIV-2編碼蛋白酶的Pol基因間有34％的核苷酸差異，同一基因型內不同病毒組間也有10％的差異，同一組中不同毒株間的差異也達3％，而單點核苷酸引起的胺基酸不同就可導致對某抗HIV藥物的抵抗。因此，目前所開發的蛋白酶抑制劑種類遠遠不能滿足對所有HIV毒株或大部分HIV毒株的有效抑制，必須建立更多的不同序列蛋白酶的篩選模型篩選出更多的蛋白酶抑制劑以有效覆蓋更多的HIV毒株。
此外，隨著HIV蛋白酶抑制劑類藥物的應用，HIV蛋白酶耐藥性突變的不斷產生已成為抗HIV治療的重大難題之一。HIV蛋白酶通過突變來逃脫蛋白酶抑制劑的作用，臨床上主要的耐藥性突變圖譜已經被繪製，如，30位Asp突變為Asn可引起對nelfinavir耐受，48位Gly突變與90位Leu突變可以導致saquinavir耐受。Condra et al.曾經報導過用indinavir治療的病人產生對saquinavir和amprenavir的耐藥性，即交互耐藥現象，從而使得HIV蛋白酶突變耐藥機制更為複雜。總的來說，HIV蛋白酶的突變導致病毒耐藥性的產生，但是這是以犧牲病毒蛋白酶的活性為代價的，而此類突變之所以能夠保留下來，是因為病毒還在蛋白酶切割位點發生相應突變作為補償。HIV蛋白酶切割位點有兩種酶切位點的形式「經典」的位於p17/p24，p11(蛋白酶)/p51之間以及蛋白酶N端，「非經典」的指其餘的酶切位點。不同切割位點，有不同切割速度p2/p7與TF(轉位蛋白)/蛋白酶之間的是最快的切割位點，而p7/p1與p1/p6則是最慢的切割位點。在蛋白酶抑制劑的作用下，除蛋白酶發生突變外，蛋白酶所識別並切割的Gag前體蛋白的p7/p1和p1/p6也發生了突變。使用蛋白酶序列46、82位突變的重組HIV-1病毒株，作用於無突變p7/p1和p1/p6切割位點時，相比作用於野生型切割位點，複製率降低68％。引入p7/p1突變位點後，相比蛋白酶突變而p7/p1位點無突變的病毒株，複製率提高了41％。可見同時發生蛋白酶突變和適應性酶切位點突變的病毒株生長狀態雖然沒有野生型病毒好，但比構建的單純蛋白酶突變的嵌合病毒突變株好。可見，HIV有很好的機制來逃脫抗HIV藥物的打擊，病毒耐藥毒株的不斷出現已是抗HIV藥物治療的重大難題。因此，開發新的抗耐藥HIV也成為抗HIV新藥開發的重要方向和主要工作，而新的抗耐藥HIV的新藥篩選模型的研發也成為首當其衝的重要研究工作。
由此可見，由於HIV蛋白酶的序列多樣性及耐藥突變的不斷產生，有效的高效抗逆轉錄病毒療法(highly active anti-retroviral therapy，HAART)療法要求針對不同HIV蛋白酶應使用不同蛋白酶抑制劑，同時要求蛋白酶抑制劑類藥物的體外大規模篩選模型不僅能夠篩選出針對現有各種不同蛋白酶的抑制劑，更要能快速不斷地對新出現的耐藥突變株蛋白酶作出反應，篩選出針對新突變株蛋白酶的抑制劑。雖然目前所應用的蛋白酶抑制劑類藥物的體外大規模篩選方法雖然已有多種，卻遠遠不能很好地滿足抗HIV新藥開發的要求。具體目前所應用的體外大規模篩選方法按功能主要分為兩類(1)競爭結合法(2)功能測定法。
競爭結合法為目前所應用的主要的體外篩選方法將現有蛋白酶固相化，加入的待篩選藥物與現有對此蛋白酶有效的藥物競爭性結合固相化蛋白酶，其中待篩藥物可帶有檢測標記如同位素、生物素、螢光物質等，待充分結合後，洗去游離成分，使用同位素測定法、生物素檢測法或光學檢測法來判斷待篩選藥物的結合效果是否優於現有藥物。若檢測結果為陽性，則說明待篩藥物與蛋白酶親合力高於現有藥物，可作進一步鑑定。該法已經用於大規模藥物體外篩選，具有篩選效果較好、速度快的特點。其缺點也很明確(1)由於是與現有蛋白酶抑制劑競爭結合位點，因此僅能篩選出已知蛋白酶抑制劑的同類物，對於針對序列不同的不能結合已知蛋白酶抑制劑的蛋白酶及耐藥性蛋白酶的藥物篩選效果不好。(2)不利於生物大分子及其它類型藥物如中藥等的篩選。由於生物大分子或其它類型的藥物與蛋白酶相互作用的多樣性，因此可能存在多種並不影響結合但卻影響切割效果的相互作用結果，譬如通過與活性中心外的關鍵基團發生作用引起蛋白酶切割活性的降低甚至喪失等，這樣作用的藥物候選物該模型效果也不好。
功能測定法Matayosh，E.D.et al早在1990就合成了一種含蛋白酶酶切位點短肽的螢光淬滅分子來作為蛋白酶的底物，即在一端連接螢光基團，另一端連接螢光淬滅基團，使用蛋白酶切割該底物後，螢光基因與淬滅基團分離，發出螢光。當所篩分子對蛋白酶有抑制時，底物不被切割，則不能發出螢光，因此，通過檢測螢光強度即可判斷所篩藥物的活性。目前該法已被實際應用到HIV蛋白酶抑制劑的篩選過程中。另外，國外有學者將蛋白酶酶切位點融合表達到兩個蛋白之間，其中一個蛋白是可用ELISA檢測的標記蛋白，另一個則提供針對前一蛋白ELISA法檢測位點的封閉基團。待篩藥物與蛋白酶結合後，如有抑制作用，則不能切割融合蛋白，標記蛋白則不能被檢測出。用ELISA法檢測切割後的標記蛋白信號強度，如呈顯弱陽性，則可認為待篩藥物抑制了蛋白酶的切割作用，封閉基團仍可作用於檢測標記基團。上述方法尤其是第一種具有敏感、快速、簡便的特點，特別適合於大規模的體外篩選，並且是直接測定蛋白酶的切割功能，適用於生物大分子及其它類型藥物的檢測。但上述兩種方法所模擬的酶切位點底物，由於方法自身的局限性，兩端基團需要足夠短的距離才能起作用，導致包含酶切位點的片斷只能很短，無法保留較完整HIV蛋白酶靶序列周圍天然的結構域，因此所得構象與HIV切割位點周圍的實際序列差距較大，當切割位點周圍序列對蛋白酶作用產生影響時，一些在體外模型中所篩出的蛋白酶抑制劑候選物就不一定能在體內實際的環境中有效作用，從而導致所篩藥物在HIV細胞模型中的有效率下降。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種帶有進化免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶底物分子及其基因序列。
本發明的另一個目的是提供上述帶有進化免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶底物分子的表達載體、轉化體及其製備方法。
本發明的再一個目的是提供上述帶有進化免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶底物分子的應用。
本發明的第四個目的是提供展示上述帶有進化免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶底物分子的噬菌體、轉化體及其製備方法。
本發明的第五個目的是提供上述展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌體的應用。
為了得到更加簡便實用的HIV蛋白酶抑制劑類藥物篩選模型，我們選擇了將HIV蛋白酶靶位點及其周圍結構域序列克隆至帶有免疫球蛋白結合分子的噬菌體，得到了可以被HIV蛋白酶切割的新型噬菌體，以及可被HIV蛋白酶切割的帶有免疫球蛋白結合分子的多肽。具體為體外合成了HIV GAG蛋白CAP2NC片斷的cDNA序列。並將該片斷克隆至噬菌體載體PCANTAB5S-LD3的Stu I和Sal I位點。PCANTAB5S-LD3是從展示金黃色葡萄球菌蛋白和大消化鏈球菌表面蛋白的Ig結合結構域的噬菌體文庫中篩選獲得的具有高免疫球蛋白結合單克隆噬菌體，其製備方法詳見《噬菌體展示SpA及PpL Ig結合單結構域隨機組合文庫及親和篩選》，生物物理與生物化學進展，2005年第32卷第6期第535～543頁。進一步將LD3-CAP2NC DNA序列克隆至pQE30載體，表達了帶有免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶底物多肽。
本發明將HIV gag基因CAP2NC序列克隆至噬菌體載體PCANTAB5S-LD3，生產並純化新型噬菌體PCANTAB5S-LD3-CAP2NC，對HIV蛋白酶切割該噬菌體的切割效果進行了測定，建立了應用該噬菌體進行HIV蛋白酶切割活性檢測的方法，建立了應用該噬菌體進行HIV蛋白酶抑制劑類藥物篩選的酶聯免疫吸附方法。另外，本發明生產並純化了帶有免疫球蛋白結合分子的HIV底物多肽，並建立了應該該多肽進行HIV蛋白酶切割活性檢測的方法。
本發明的第一方面，公開了一種重組的帶有進化免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶底物分子，它是SEQ ID NO1所示的胺基酸序列的蛋白、或其保守性變異蛋白。較佳的，它是SEQ ID NO1所示的胺基酸序列。
上述分子是發明人通過將HIV GAG蛋白CAP2NC片斷連接於LD3分子的C端後獲得的。該分子包含HIV蛋白酶的靶位點P2NC。經過發明人的一系列試驗，證實該分子可以在體外被HIV蛋白酶所切割，並為特異性切割。
本發明的第二方面，公開了一種分離的多核苷酸，它編碼上述帶有進化免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶底物分子。較佳的，它是SEQ IDNO 2所示的核苷酸序列。
本發明的第三方面，公開了一種表達載體，它表達上述SEQ ID NO1蛋白，表達載體含有上述多核苷酸以及與該多核苷酸序列操作性相連的表達調控序列。較佳的，上述表達載體為原核表達載體，如pKK223-3、pBR322、pGEX載體等等，優選pQE30。
本發明的第四方面，公開了一種宿主細胞，它被上述表達載體所轉化。較佳的，上述宿主細胞為原核細胞如大腸桿菌，鏈黴菌屬，鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞，其中優選大腸桿菌如M15，DH5α，TG1，其中優選大腸桿菌M15。
本發明的第五方面，公開了上述帶有進化免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶底物分子的製備方法，該方法包含(1)在適合表達帶有進化免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶底物分子的條件下，培養上述宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有免疫球蛋白結合活性且可被HIV蛋白酶切割的多肽。實施例中，發明人將新型帶有進化免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶底物分子克隆入原核表達載體pQE30中，構建其大腸桿菌表達菌種，對該菌種進行大規模培養，誘導生產進化免疫球蛋白結合分子，用Ni親和層析柱進行純化，製備出純化的新型帶有進化免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶底物分子LD3-CAP2NC。
本發明的第六方面，公開了將上述的帶有進化免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶底物分子用於體外HIV蛋白酶的切割試驗，HIV蛋白酶切割該噬菌體的模式是特異性切割模式，即HIV蛋白酶特異性識別展示於噬菌體表面的CAP2NC片斷中的胺基酸序列SATIMMQRGN。
優選的，上述應用為將帶有進化免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶底物分子用於檢測HIV蛋白酶的體外活性，其中體外活性檢測優選體外切割活性檢測。
同樣優選的，上述應用為將帶有進化免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶底物分子用於HIV蛋白酶抑制劑類藥物的篩選鑑定。
較佳的，上述HIV蛋白酶來自HIV SF2株蛋白酶。
本發明的第七方面，公開了一種噬菌體，它含有上述多核苷酸以及與該多核苷酸序列操作性相連的表達調控序列。噬菌體優選PCANTAB5S。經過一系列試驗證實，該噬菌體可以在體外被HIV蛋白酶切割，並為特異性切割。
本發明的第八方面，公開了一種宿主細胞，它被上述噬菌體所轉化。較佳的，上述宿主細胞為原核細胞如大腸桿菌，鏈黴菌屬，鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞，其中優選大腸桿菌如M15，DH5α，TG1，其中更佳的，為大腸桿菌TG1。
本發明的第九方面，公開了上述帶有進化免疫球蛋白結合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌體的製備方法，該方法包含(1)在適合培養帶有進化免疫球蛋白結合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌體的條件下，培養上述宿主細胞；(2)從培養物中分離出帶有進化免疫球蛋白結合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌體。實施例中，發明人將HIV蛋白酶底物分子克隆入噬菌體載體PCANTAB5S-LD3中，構建其大腸桿菌菌種，對該菌種進行大規模培養，擴增上述展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌體，用0.22μm微孔濾膜進行純化，製備出純化的新型的帶有進化免疫球蛋白結合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌體。
本發明的第十方面，公開了將上述的帶有進化免疫球蛋白結合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌體用於體外HIV蛋白酶的切割試驗，HIV蛋白酶切割該噬菌體的模式是特異性切割模式，即HIV蛋白酶特異性識別展示於噬菌體表面的CAP2NC片斷中的胺基酸序列SATIMMQRGN。
優選的，上述應用為將帶有進化免疫球蛋白結合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌體用於體外檢測HIV蛋白酶的活性，其中體外活性檢測優選體外切割活性檢測。
同樣優選的，上述應用為將帶有進化免疫球蛋白結合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌體用於HIV蛋白酶抑制劑類藥物的篩選鑑定。
較佳的，上述HIV蛋白酶來自HIV SF2株蛋白酶。
本發明的優點在於本發明公開的帶有進化免疫球蛋白結合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌體，在蛋白酶靶位點周圍保留了較完整的HIV蛋白酶靶序列結構域，能更好地模擬體內蛋白酶切割底物的真實情況，使得如此體外所篩出的蛋白酶抑制劑候選物在細胞體內模型中有更高地陽性率，提高了篩選效率。另一方面，本發明公開了上述帶有進化免疫球蛋白結合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌體的基因工程製備方法，使得低成本、大規模生產成為可能。再一方面，本發明公開了將上述帶有進化免疫球蛋白結合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌體用於HIV蛋白酶的體外活性檢測及HIV蛋白酶抑制劑類藥物的篩選鑑定，與現有技術相比，使用了本發明的帶有進化免疫球蛋白結合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌體可以提高檢測的靈敏度，篩選的效率。


圖1CAP2NC DNA合成並克隆於噬菌粒pCANTAB5S-LD3的流程2CAP2、NC、CAP2NC DNA PCR擴增MDL2,000marker；1，2CAP2/NC PCR產物3，4CAP2PCR產物5，6NC PCR產物圖3重組噬菌粒pCANTAB5S-LD3-CAP2NC的酶切鑑定MDL2,000marker；1pCANTAB5S-LD3-CAP2/NC2，3噬菌粒pCANTAB5S-LD3-CAP2NC/Stu I+Sal I，圖4CAP2NC和LD3-CAP2NC融合蛋白表達載體構建流程5LD-CAP2NC DNA片斷的PCR擴增1-3LD3-CAP2NC DNA片斷PCR產物MDL 2,000marker圖6pQE30-LD3-CAP2NC質粒限制酶酶切分析1pQE30-LD3-CAP2NC質粒2-4pQE30-LD3-CAP2NC質粒/Bam H I+Sal IMDL 2,000marker圖7大腸桿菌中誘導表達HIV CAP2NC與的LD3-CAP2NC融合蛋白的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析MP Protein marker；1-4pQE30-CAP2NC/M15誘導後總蛋白5pQE30/M15對照；6-9pQE30-LD3-CAP2NC/M15誘導後總蛋白圖8純化HIV CAP2NC與LD3-CAP2NC蛋白的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析MProtein marker；
1純化LD3-CAP2NC蛋白圖9不同劑量HIV SF2蛋白酶切割LD3-CAP2NC融合蛋白MProtein marker；1蛋白酶2μg+LD3-CAP2NC；2蛋白酶0.2μg+LD3-CAP2NC；3蛋白酶0.02μg+LD3-CAP2NC；4LD3-CAP2NC control；5蛋白酶2μg+LD3；6LD3**由於LD3分子是由pET32a(+)/BL21系統表達，其純化產物融合有Trx Tag、S Tag、HisTag等，因此融合蛋白分子量達到約36 000。
圖10不同劑量HIV SF2蛋白酶切割噬菌體表面的CAP2NC none 10ug/ml HIV SF2蛋白酶 5ug/ml HIV SF2蛋白酶 2.5ug/ml HIV SF2蛋白酶 1.25ug/ml HIV SF2蛋白酶圖11Indinavir對HIV SF2蛋白酶切割展示HIV CAP2NC蛋白的重組噬菌體的作用 none 10ug/ml HIV SF2蛋白酶 3ug/ml Indinavir 10ug/ml HIV SF2蛋白酶+3ug/ml Indinavir具體實施方式
在本發明中，術語「其保守性變異蛋白」是指具有HIV蛋白酶底物分子活性的SEQ IDNO1所示的胺基酸序列的蛋白的變異形式，這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-30個，較佳的1-10個，更佳的1-5個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸，例如，在本領域中，用性能相近或相似地胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質地功能，如可以用Val或Leu或Ile取代Ala等，又比如，在C末端和/或N末端添加一個和數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。此外，這些變異形式還包括成熟蛋白與另一個化合物融合所形成的蛋白，附加的胺基酸序列融合到此多肽序列而形成的蛋白(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，比如GST)。此外，變異形式還包括(但不限於)進化免疫球蛋白結合分子及上述蛋白經過修飾後的形式化學衍生形式如乙醯化或羧基化；糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的蛋白，這種修飾可以通過將蛋白暴露於進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成；具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的蛋白。這些片段、衍生物和類似物屬於本領域熟悉技術人員公知的範圍。
本發明中，術語「表達調控序列」通常指參與控制核苷酸序列表達的序列。表達調控序列包括與目標核苷酸序列操作性相連的啟動子和終止信號。它們通常還包括核苷酸序列適當翻譯所需的序列。「操作性相連」是指線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果啟動子或增強子增加了編碼序列的轉錄，則它與編碼序列是操作性相連的。
用重組載體轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收穫，用CaCl2法或熱擊法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉澱法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
本發明所述適合表達進化免疫球蛋白結合分子的條件與表達所用的宿主細胞有關，重組載體轉化的宿主細胞獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的帶有進化免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶底物分子。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適於宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。上述方法中的重組蛋白可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但並不限於常規的復性處理、用蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
一、一種新型帶有進化免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶底物分子原核製備本發明所述的一種新型帶有進化免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶底物分子LD3-CAP2NC是將HIV GAG蛋白CAP2NC片斷克隆至噬菌體PCANTAB5S-LD3獲得。其中，PCANTAB5S-LD3帶有進化免疫球蛋白結合分子，製備PCANTAB5S-LD3的方法在《噬菌體展示SpA及PpL Ig結合單結構域隨機組合文庫及親和篩選》，生物物理與生物化學進展，2005年第32卷第6期第535～543頁中具有詳細描述。本發明以含有編碼帶有進化免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶底物分子LD3-CAP2NC cDNA序列克隆pCANTAB5S-LD3-CAP2NC為模板，PCR擴增LD3-CAP2NC的DNA片斷，並通過引物合成方法在擴增片斷上遊引入Bam HI內切酶識別位點。擴增片斷用PCR產物回收試劑盒回收後Bam H I和SalI內切酶酶切，酶切片斷進行瓊脂糖凝膠電泳後用膠回收試劑盒回收，克隆到原核表達載體PQE30的BamH I和SalI位點中，構建成功原核表達載體PQE30-LD3-CAP2NC，用CAP2NC的下遊引物C1Ld-6(5』-gggg GTC GAC GTT AGC CTG ACG TTC GGT GCA GTC-3』(SEQ ID NO5)。委託上海生工生物技術有限公司合成。)測定克隆片段LD3-CAP2NC的DNA序列，序列分析結果證實PQE30-LD3-CAP2NC在Bam H I和SalI位點間的插入序列與帶有免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶靶分子LD3-CAPN2C的序列完全相符，讀框完全正確，起始子和終止子已加上。取重組質粒PQE30-LD3-CAP2NC200ng轉化大腸桿菌M15，獲得LD3-CAP2NC的原核表達菌種。將該菌中培養後IPTG誘導表達，設空菌作陰性對照，SDS電泳顯示在分子量約60000Daltons處出現對照菌沒有的一條蛋白帶，符合LD3-CAP2NC的分子量。將菌種菌種活化後大量培養，IPTG誘導表達，Ni-NTA柱純化獲得純化LD3-CAP2NC融合蛋白，SDS電泳顯示純化後僅出現一條蛋白帶，符合其相應分子量。
二、HIV蛋白酶體外切割帶有進化免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶底物分子HIV SF2株蛋白酶為HIV-1型B亞型SF2株蛋白酶，其製備方法在《Identificationof efficiently cleaved substrates for HIV-1 protease using a phage display libraryand use in inhibitor development》，Virology，2000年274期中391-401頁中有詳細記載。
將純化後的LD3-CAP2NC蛋白用磷酸鹽緩衝液調至5μg/μl。取LD3-CAP2NC蛋白各25μg於MES緩衝液(0.2M NaCl，0.1M 2-嗎啉代乙烷磺酸，pH 6.7)中，加入不同濃度的HIV SF2蛋白酶(2μg，0.2μg，0.02μg，0.002μg)，混勻後於37℃孵育16h，反應完成後，每一反應體系加入20μl 2倍SDS加樣緩衝液，振蕩混勻後100℃加熱7min，用10％的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳鑑定切割效果。SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳電泳顯示2μg蛋白酶可以將LD3-CAP2NC蛋白切割成兩條目的條帶，大小與LD3-CAP2和NC蛋白的分子量一致，表明融合了LD3分子後，HIV蛋白酶靶分子仍可被HIV SF2株蛋白酶特異性切割。單獨的LD3蛋白未見任何切割作用。
三、帶有進化免疫球蛋白結合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌體的製備本發明所述的帶有進化免疫球蛋白結合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌體是將HIV GAG蛋白CAP2NC片斷克隆至噬菌體載體pCANTAB5S-LD3獲得。取pCANTAB5S-LD3-CAP2NC重組噬菌粒1μg轉化大腸桿菌TG1，活化培養1h後加入1ml 4×1010TU/ml的M13KO7輔助噬菌體拯救，37℃，250rpm振蕩培養1h，1000×g離心10min，細菌沉澱用10ml 2×YT(含氨苄青黴素100ng/μl和卡那黴素50ng/ml)懸浮，37℃，250r/min振蕩培養過夜。培養液上清加入2ml聚乙二醇/NaCl沉澱後懸浮於10ml2×YT培養液中，經0.22μm濾膜過濾，獲得pCANTAB5S-LD3-CAP2NC重組噬菌體。取1μl重組噬菌體10倍系列稀釋，感染對數生長期的大腸桿菌TG1，37℃培養1h後塗瓊脂(含氨苄青黴素100ng/μl)平板，置37℃培養過夜。計數不同稀釋度平皿上的菌落數，生長菌落數的稀釋倍數乘以100即為每毫升噬菌體的轉化單位數(transformation unit，TU)。
四、HIV蛋白酶體外切割帶有進化免疫球蛋白結合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌體將pCANTAB5S-LD3-CAP2NC和pCANTAB5S-LD3重組噬菌體用2×YT培養液均調整至1.0×1012TU/ml後，分別取噬菌體100μl，加入包被有人IgG抗體的反應孔中，37℃孵育3h後洗滌10次。每孔加入不同稀釋度的HIV SF2蛋白酶至終濃度分別為10ug/ml，5ug/ml，2.5ug/ml，1.25ug/ml。37℃孵育4h後洗滌10次。加入抗M13噬菌體酶標抗體，37℃孵育45min後加入TMB顯色，測D450值，每種蛋白酶濃度各作3復孔，取平均值計算切割率。切割率＝(未加蛋白酶D450均數-(加入蛋白酶後D450均數-對照D450均數))/(未加蛋白酶D450均數-對照D450均數)。結果證實HIV蛋白酶能夠很好的切割展示於噬菌體表面的蛋白酶靶分子，在蛋白酶濃度分別為10ug/ml、5ug/ml、2.5ug/ml時，HIV SF2蛋白酶切割噬菌體pCANTAB5S-LD3-CAP2NC的切割率分別為80％、53％、24％，且與HIV SF2蛋白酶濃度呈相關關係(0.05＞P＞0.02)，表現出較好的特異性作用。
五、應用帶有進化免疫球蛋白結合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌體鑑定HIV蛋白酶抑制劑類藥物蛋白酶切割的抑制作用為驗證上述實驗中噬菌體數量減少是否為HIV SF2蛋白酶的特異性作用，我們利用蛋白酶抑制劑類藥物Indinavir(商品名Crixivan，Merck公司，由上海公共衛生中心盧洪洲教授惠贈)對上述切割進行了鑑定。將pCANTAB5S-LD3-CAP2NC和pCANTAB5S-LD3重組噬菌體用2×YT培養液均調整至1.0×1012TU/ml後，分別取噬菌體100μl，加入包被有人IgG抗體的反應孔中，37℃孵育3h後洗滌10次。每孔加入不同稀釋度的HIV SF2蛋白酶至終濃度分別為10ug/ml，0ug/ml，分成兩組，一組中加入Indinavir至3μg/ml，另一組不加Indinavir，37℃孵育3h後洗滌10次。每孔加入不同稀釋度的HIV SF2蛋白酶，37℃孵育4h後洗滌10次。加入抗M13噬菌體酶標抗體，37℃孵育45min後加入TMB顯色，測D450值同，每種蛋白酶濃度各作3復孔，取平均值計算切割率。結果表明，同時加入HIV SF2蛋白酶與Indinavir組，結合於板上的pCANTAB5S-LD3-CAP2NC數量明顯高於僅加入HIV SF2蛋白酶組，且與對照組結合於板上噬菌體數量相當，說明蛋白酶抑制劑特性抑制蛋白酶對CAP2NC的特異切割。Indinavir同樣抑制蛋白酶對LD3的非特異切割。
下面結合實施例進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明，而非限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆試驗手冊(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件或者製造商建議的條件進行或配置。
實施例1 一種新型帶有進化免疫球蛋白結合分子的展示HIV蛋白酶靶分子的噬菌體製備的方法噬菌體載體pCANTAB5S-LD3-CAP2NC的構建流程見圖1含有編碼帶有進化免疫球蛋白結合分子LD3的展示HIV蛋白酶靶分子cDNA序列克隆的重組噬菌粒載體pCANTAB5S-LD3-CAP2NC，是通過將CAP2NC的cDNA序列克隆至噬菌體載體PCANTAB5S-LD3的StuI和SalI位點之間構建的，pCANTAB5S-LD3製備的具體步驟在《噬菌體展示SpA及PpL Ig結合單結構域隨機組合文庫及親和篩選》，生物物理與生物化學進展，2005年第32卷第6期第535～543頁中已完全公開。
1引物合成CAP2NC cDNA序列是通過重疊延伸PCR方法在體外合成的。根據GenBank中HIV-1 HXB2株CAP2序列(GenBank NOAF 033819；CAP2胺基酸序列為GAG蛋白上第133位到430位胺基酸)，根據大腸桿菌偏好密碼子設計併合成了10對用以重疊延伸PCR合成蛋白酶DNA序列的引物C1Bu-1，C1Bu-2，C1Bu-3，C1Bu-4，C1Bu-5，C1Bu-6，C1Bu-7，C1Bu-8，C1Bu-9，C1Bu-10，C1Bd-1，C1Bd-2，C1Bd-3，C1Bd-4，C1Bd-5，C1Bd-6，C1Bd-7，C1Bd-8，C1Bd-9，C1Bd-10。每條約50個鹼基，重疊區域包含20個鹼基，序列全長726bp。HIV CAP2NC片段中存在兩個蛋白酶靶位點CA/P2，P2/NC，本研究選擇P2/NC序列作為蛋白酶切割對象，為了避免CA/P2位點的影響，我們對CA/P2位點進行了改造，將GAG蛋白第231位L突變為G，232位A突變為G，突變後的CA/P2位點將不會被HIV蛋白酶特異性切割。引物序列如下C1Bu-1(SEQ ID NO6)5』-gg TCTAG ACCGA TCGTT CAGAA CATCC AGGGT CAGAT GGTTC ACCAG GCTAT CTCTC-3』C1Bu-2(SEQ ID NO7)5』-CTTGG GTTAA AGTTG TTGAA GAAAA AGCTT TCTCT CCGGA AGTTA TCCCG ATGTT-3』C1Bu-3(SEQ ID NO8)5』-AGGTG CTACC CCGCA GGACC TGAAC ACCAT GCTGA ACACC GTTGG TGGTC ACCAG-3』C1Bu-4(SEQ ID NO9)5』-CTGAA AGAAA CCATC AACGA AGAAG CTGCT GAATG GGACC GTGTT CACCC GGTTC-3』C1Bu-5(SEQ ID NO10)5』-CTCCG GGTCA GATGC GTGAA CCGCG TGGTT CTGAC ATCGC TGGTA CCACC TCTAC-3』C1Bu-6(SEQ ID NO11)5』-CGGTT GGATG ACCAA CAACC CGCCG ATCCC GGTTG GTGAA ATCTA CAAAC GTTGG-3』C1Bu-7(SEQ ID NO12)5』-AACAA AATCG TTCGT ATGTA CTCTC CGACC TCTAT CCTGG ACATC CGTCA GGGTC-3』C1Bu-8(SEQ ID NO13)5』-GTGAC TACGT TGACC GTTTC TACAA AACCC TGCGT GCTGA ACAGG CTTCT CAGGA-3』C1Bu-9(SEQ ID NO14)5』-GACCG AAACC CTGCT GGTTC AGAAC GCTAA CCCGG ACTGC AAAAC CATCC TGAAA-3』C1Bu-10(SEQ ID NO15)5』-CCTGG AAGAA ATGAT GACCG CTTGC CAGGG TGTTG GTGGT CCGGG TCACA AAGCT-3』C1Bd-1(SEQ ID NO16)5』-TTCAA CAACT TTAAC CCAAG CGTTC AGGGT ACGCG GAGAG ATAGC CTGGT GAACC-3』C1Bd-2(SEQ ID NO17)5』-GGTCC TGCGG GGTAG CACCT TCAGA CAGAG CAGAG AACAT CGGGA TAACT TCCGG-3』C1Bd-3(SEQ ID NO18)5』-TCGTT GATGG TTTCT TTCAG CATCT GCATA GCAGC CTGGT GACCA CCAAC GGTGT-3』C1Bd-4(SEQ ID NO19)5』-TTCAC GCATC TGACC CGGAG CGATC GGACC AGCGT GAACC GGGTG AACAC GGTCC-3』C1Bd-5(SEQ ID NO20)5』-GGTTG TTGGT CATCC AACCG ATCTG TTCCT GCAGG GTAGA GGTGG TACCA GCGAT-3』C1Bd-6(SEQ ID NO21)5』-TACAT ACGAA CGATT TTGTT CAGAC CCAGG ATGAT CCAAC GTTTG TAGAT TTCAC-3』C1Bd-7(SEQ ID NO22)5』-GAAAC GGTCA ACGTA GTCAC GGAAC GGTTC TTTCG GACCC TGACG GATGT CCAGG-3C1Bd-8(SEQ ID NO23)5』-GAACC AGCAG GGTTT CGGTC ATCCA GTTTT TAACT TCCTG AGAAG CCTGT TCAGC-3』C1Bd-9(SEQ ID NO24)5』-ATCAT TTCTT CCAGG GTAGC AGCCG GACCC AGAGC TTTCA GGATG GTTTT GCAGT-3』C1Bd-10(SEQ ID NO25)5』-GTTGG TAACC TGAGA CATAG CTTCA CCACC AACAC GAGCT TTGTG ACCCG GACCAC-3』根據GenBank中HIV-1 HXB2株NC序列(GenBank NOAF 033819；NC胺基酸序列為GAG蛋白上第431位到488位胺基酸)，根據大腸桿菌偏好密碼子設計併合成了2對用以重疊延伸PCR合成NC DNA序列的引物C1Lu-1a，C1Lu-2，C1Ld-1，C1Ld-2。每條約50個鹼基，重疊區域包含20個鹼基，序列全長176bp。引物序列如下C1Lu-1a(SEQ ID NO26)5』-a TCATG ATGCA GCGTG GTAAC TTCCG TAACC AGCGT AAAAT CGTTAAATGC TTCAA CT-3』C1Lu-2(SEQ ID NO27)5』-CTCGT AACTG CCGTG CTCCG CGTAA AAAAG GTTGC TGGAA ATGCG GTAAAGAAGG TCAC-3』C1Ld-1(SEQ ID NO28)5』-GGAGC ACGGC AGTTA CGAGC GGTGT GACCT TCTTT ACCGC AGTTG AAGCATTTAA CGA-3』C1Ld-2(SEQ ID NO29)5』-gg GTCGA CGTTA GCCTG ACGTT CGGTG CAGTC TTTCA TCTGG TGACCTTCTT TACCG CA-3』上述引物均委託上海生工生物技術有限公司合成。
用重疊延伸PCR方法體外合成編碼HIV-1 CAP2的DNA序列。首輪PCR反應體系包括上述10對引物(C1Bu-1，C1Bu-2，C1Bu-3，C1Bu-4，C1Bu 5，C1Bu-6，C1Bu-7，C1Bu-8，C1Bu-9，C1Bu-10，C1Bd-1，C1Bd-2，C1Bd-3，C1Bd-4，C1Bd-5，C1Bd-6，C1Bd-7，C1Bd-8，C1Bd-9，C1Bd-10，濃度分別為0.25mM)，Pfu DNA聚合酶(購自Promega公司)1u，總體積50μl，反應條件為94℃變性5min；94℃ 30sec，45℃ 30sec，72℃ 60sec，30個循環；最後72℃延伸5min。第二輪反應以首輪PCR產物1μl為模板，以引物C1Bu-1，C1Bd-10為上、下遊引物，各0.25mM，Pfu DNA聚合酶1u，總體積50μl，反應條件為94℃變性5min；94℃ 30sec，45℃ 45sec，72℃ 60sec，30個循環；最後72℃延伸5min。1.5％瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行鑑定。結果如圖2所示，在756kb處有條帶顯示。
用重疊延伸PCR方法體外合成編碼HIV-1 NC的DNA序列。首輪PCR反應體系包括上述2對引物(C1Lu-1a，C1Lu-2，C1Ld-1，C1Ld-2，濃度為0.25mM)，Pfu DNA聚合酶lu，總體積50μl，反應條件為94℃變性5min；94℃ 30sec，45℃ 30sec，72℃ 30sec，30個循環；最後72℃延伸5min。第二輪反應以首輪PCR產物1μl為模板，以引物C1Lu-la，C1Ld-2為上、下遊引物，各0.25mM，Pfu DNA聚合酶lu，總體積50μl，反應條件為94℃變性5min；94℃ 30sec，45℃ 45sec，72℃ 30sec，30個循環；最後72℃延伸5min。1.5％瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行鑑定，如圖2所示，在176kb處有條帶顯示。
DNA凝膠抽提試劑盒(購自杭州維特潔生化技術有限公司)純化上述兩種PCR產物。純化後的PCR產物CAP2與NC各取100ng，分別與50ng pMD-18T載體(購自Takara公司)混合，同時加入等體積的DNA Ligation Solution I(購自Takara公司)，於16℃連接30min。取連接液10μl轉化氯化鈣法製備的100μl感受態大腸桿菌Top10F』。冰浴30min，42℃ 1min，冰浴2min；加入900μl 37℃預熱的SOC，37℃，200rpm，1h；取100μl轉化液塗布含100μg/ml氨苄青黴素的LB平板，37℃倒置培養過夜。
對CAP2克隆的質粒以C1Bu-1，C1Bd-10為上、下遊引物PCR擴增篩選陽性克隆，引物濃度為0.25mM，Taq DNA聚合酶(購自Takara公司)1U，總體積50μl，反應條件為94℃變性5min；94℃ 30sec，45℃ 30sec，72℃ 45sec，30個循環；最後72℃延伸5min。對NC克隆的質粒以引物C1Lu-1a，C1Ld-2為上、下遊引物PCR擴增篩選陽性克隆，引物濃度為0.25mM，Taq DNA聚合酶1U，總體積50μl，反應條件為94℃變性5min；94℃ 30sec，45℃ 30sec，72℃ 30sec，30個循環；最後72℃延伸5min。取鑑定為陽性的單克隆委託Invitrogen公司進行序列測定，測序結果用DNASTAR軟體與GenBank中序列進行同源性比較分析，結果符合預期，CAP2與NC的cDNA序列分別如SEQ ID NO3，SEQ ID NO4所示。將測序正確的質粒分別命名為pMD18-T-CAP2和pMD18-T-NC。
CAP2 cDNA序列(SEQ ID NO3)如下TCTAGACCGATCGTTCAGAACATCCAGGGTCAGATGGTTCACCAGGCTATCTCTCCGCGTACCCTGAACGCTTGGGTTAAAGTTGTTGAAGAAAAAGCTTTCTCTCCGGAAGTTATCCCGATGTTCTCTGCTCTGTCTGAAGGTGCTACCCCGCAGGACCTGAACACCATGCTGAACACCGTTGGTGGTCACCAGGCTGCTATGCAGATGCTGAAAGAAACCATCAACGAAGAAGCTGCTGAATGGGACCGTGTTCACCCGGTTCACGCTGGTCCGATCGCTCCGGGTCAGATGCGTGAACCGCGTGGTTCTGACATCGCTGGTACCACCTCTACCCTGCAGGAACAGATCGGTTGGATGACCAACAACCCGCCGATCCCGGTTGGTGAAATCTACAAACGTTGGATCATCCTGGGTCTGAACAAAATCGTTCGTATGTACTCTCCGACCTCTATCCTGGACATCCGTCAGGGTCCGAAAGAACCGTTCCGTGACTACGTTGACCGTTTCTACAAAACCCTGCGTGCTGAACAGGCTTCTCAGGAAGTTAAAAACTGGATGACCGAAACCCTGCTGGTTCAGAACGCTAACCCGGACTGCAAAACCATCCTGAAAGCTCTGGGTCCGGCTGCTACCCTGGAAGAAATGATGACCGCTTGCCAGGGTGTTGGTGGTCCGGGTCACAAAGCTCGTGTTGGTGGTGAAGCTATGTCTCAGGTTACCAACTCTGCTACCATCATGATGCAGCGTGGTAANC cDNA序列(SEQ ID NO4)如下ATCATGATGCAGCGTGGTAACTTCCGTAACCAGCGTAAAATCGTTAAATGCTTCAACTGCGGTAAAGAAGGTCACACCGCTCGTAACTGCCGTGCTCCGCGTAAAAAAGGTTGCTGGAAATGCGGTAAAGAAGGTCACCAGATGAAAGACTGCACCGAACGTCAGGCTAACGTCGAC2 CAP2NC序列的PCR擴增以pMD18-T-CAP2質粒為模板，以C1Bu-stu(SEQ ID NO30)(5』-gg AGG CCT TCT AGACCG ATC GTT CAG AA-3』，生工生物技術公司合成)和C2Bd-11t(SEQ ID NO31)(5』-GTTACC ACG CTG CAT CAT GAT GGT AGC AGA GTT GGT AAC CTG AGA CAT AG-3』，生工生物技術公司合成)為引物擴增CAP2片段，引物各1μmol，dNTP 100μmol，Mg2+3mmol，Taq酶1U，50μl反應體積，擴增條件為94℃ 40s；56℃ 40s；72℃ 60s；30個循環。以pMD18-T-NC質粒為模板，以C1Lu-1a，和C1Ld-6為引物擴增NC片段，引物各1μmol，dNTP 100μmol，Mg2+3mmol，Taq酶1U，50μl反應體積，擴增條件為94℃ 40s；56℃ 40s；72℃ 60s；30個循環。PCR產物於1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析、試劑盒溶液回收。
以CAP2與NC擴增產物為模板，以C1Bu-stu和C1Ld-6為引物擴增CAP2/NC片段，引物各1μmo1，dNTP 100μmol，Mg2+3mmol，Taq酶1U，50μl反應體積，擴增條件為94℃ 40s；55℃ 40s；72℃ 90s；30個循環。PCR產物於1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析，結果如圖2，912kb處條帶為CAP2NC。PCR產物純化試劑盒(購自上海華舜生物工程有限公司)溶液回收。回收產物StuI和SalI雙酶切過夜，DNA凝膠抽提試劑盒(購自杭州維特潔生化技術有限公司)膠回收。
3重組噬菌體載體的構建及DNA序列測定將HIV CAP2NC DNA的Stu I和Sal I酶切回收產物與限制酶Stu I和Sal I消化後的pCANTAB5S-LD3載體連接並轉化大腸桿菌Top10F』。提取單克隆噬菌粒，雙酶切鑑定，如圖3所示，在912kb可見一條帶，即為CAP2NC DNA。初步鑑定正確的三個單克隆送英駿生物技術公司進行序列測定。測序結果用DNASTAR軟體與GenBank中序列進行同源性比較分析。
最終獲得的帶有進化免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶靶分子LD3-CAP2NC的cDNA序列如序列SEQ ID NO2所示，胺基酸序列如SEQ ID NO1所示。
最終獲得的帶有進化免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶靶分子LD3-CAP2NC的cDNA序列(SEQ ID NO2)AAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCTATGCAGATGGAAAAACACAAACAGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCTGACTTATTAGCAAAAGAAAATGGTAAATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCTCGCTGATGCGCAACAAAATAACTTCAACAAAGATCAACAAAGCGCCTTCTATGAAATTTTGAACATGCCTAACTTAAACGAAGCGCAACGCAATGGTTTCATTCAAAGTCTTAAAGACGATCCAAGCCAAAGCACTAACGTTTTAGGTGAAGCTAAAAAATTAAACGAATCTCAAGCACCGAAAGAGCTCAAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCTATGCAGATGGAAAAACACAAACAGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCTGACTTATTAGCAAAAGAAAATGGTAAATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCTCAGGTCTAGACCGATCGTTCAGAACATCCAGGGTCAGATGGTTCACCAGGCTATCTCTCCGCGTACCCTGAACGCTTGGGTTAAAGTTGTTGAAGAAAAAGCTTTCTCTCCGGAAGTTATCCCGATGTTCTCTGCTCTGTCTGAAGGTGCTACCCCGCAGGACCTGAACACCATGCTGAACACCGTTGGTGGTCACCAGGCTGCTATGCAGATGCTGAAAGAAACCATCAACGAAGAAGCTGCTGAATGGGACCGTGTTCACCCGGTTCACGCTGG
TCCGATCGCTCCGGGTCAGATGCGTGAACCGCGTGGTTCTGACATCGCTGGTACCACCTCTACCCTGCAGGAACAGATCGGTTGGATGACCAACAACCCGCCGATCCCGGTTGGTGAAATCTACAAACGTTGGATCATCCTGGGTCTGAACAAAATCGTTCGTGGTACTCTCCGACCTCTATCCTGGACATCCGTCAGGGTCCGAAAGAACCGTTCCGTGACTACGTTGACCGTTTCTACAAAACCCTGCGTGCTGAACAGGCTTCTCAGGAAGTTAAAAACTGGATGACCGAAACCCTGCTGGTTCAGAACGCTAACCCGGACTGCAAAACCATCCTGAAAGCTCTGGGTCCGGCTGCTACCCTGGAAGAAATGATGACCGCTTGCCAGGGTGTTGGTGGTCCGGGTCACAAAGCTCGTGTTGGTGGTGAAGCTATGTCTCAGGTTACCAACTCTGCTACCATCATGATGCAGCGTGGTAACTTCCGTAACCAGCGTAAAATCGTTAAATGCTTCAACTGCGGTAAAGAAGGTCACACCGCTCGTAACTGCCGTGCTCCGCGTAAAAAAGGTTGCTGGAAATGCGGTAAAGAAGGTCACCAGATGAAAGACTGCACCGAACGTCAGGCTAACGTCGAC帶有進化免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶靶分子LD3-CAP2NC的胺基酸序列(SEQ IDNO1)KEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKENGKYTVDVADKGYTLNIKFAGELADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKELKEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKENGKYTVDVADKGYTLNIKFAGELRSRPIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTNNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPGHKARVGGEAMSQVTNSATIMMQRGNFRNQRKIVKCFNCGKEGHTARNCRAPRKKGCWKCGKEGHQMKDCTERQANVD4帶有進化免疫球蛋白結合分子的展示HIV蛋白酶靶分子的噬菌體的構建取pCANTAB5S-LD3-CAP2NC和pCANTAB5S-LD3重組噬菌粒各1μg轉化大腸桿菌TG1，活化培養1h後加入1ml 4×1010TU/ml的M13KO7輔助噬菌體拯救，37℃，250rpm振蕩培養1h，1000×g離心10min，細菌沉澱用10ml 2×YT(含氨苄青黴素100ng/μl和卡那黴素50ng/ml)懸浮，37℃，250r/min振蕩培養過夜。培養液上清加入2ml聚乙二醇/NaCl沉澱後懸浮於10ml 2×YT培養液中，經0.22μm濾膜過濾，分別獲得pCANTAB5S-LD3-CAP2NC和pCANTAB5S-LD3重組噬菌體。取1μl重組噬菌體10倍系列稀釋，感染對數生長期的大腸桿菌TG1，37℃培養1h後塗SOB(含氨苄青黴素100ng/μl)平板，置37℃培養過夜。計數不同稀釋度平皿上的菌落數，生長菌落數的稀釋倍數乘以100即為每毫升噬菌體的轉化單位數(transformation unit，TU)。
所製備的pCANTAB5S-LD3-CAP2NC和pCANTAB5S-LD3重組噬菌體滴度分別為3.2×1012、5.6×1012TU/ml，pCANTAB5S對照噬菌體滴度為7.6×1012TU/ml可見重組噬菌體的滴度與對照噬菌體基本在同一水平。
實施例2 新型帶有進化免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶靶分子的原核製備方法及應用
1帶有進化免疫球蛋白結合分子的蛋白酶靶分子的原核表達載體的構建表達帶有進化免疫球蛋白結合分子的蛋白酶靶分子的原核表達載體的構建流程如圖4所示以pCANTAB5S-LD3-CAP2NC質粒為模板，以LCu-bam，C1Ld-6(LCu-bam(SEQ ID NO32)5』-gggg GGA TCC CCG GCC TCT AGA GAG-3』，上海生工生物技術有限公司合成。)分別為上下遊引物擴增LD3-CAP2NC DNA片斷，94℃ 40s；55℃ 40s；72℃ 120s；Taq酶0.3μl，50μl反應體系，30個循環。PCR產物於1.0％瓊脂糖凝膠電泳分析、試劑盒溶液回收，如圖5所示；回收產物Bam H I和Sal I雙酶切過夜，試劑盒回收後與限制酶Bam H I與Sal I消化後的原核表達載體pQE30(購自QIAgene公司)連接並轉化大腸桿菌.Top10F』。提取單克隆質粒，Bam H I與Sal I雙酶切鑑定。
如圖6所示，pQE30-LD3-CAP2NC經Bam H I與Sal I後，在1500bp左右處出現一條帶，大小與LD3-CAP2NC DNA一致。
2重組表達載體pQE30-LD3-CAP2NC的表達與純化將pQE30-LD3-CAP2NC轉化大腸桿菌M15(購自QIAgene公司)中進行IPTG誘導表達。取誘導後菌液1ml，離心收集菌體，加20μl 2倍SDS加樣緩衝液，振蕩混勻後100℃加熱7min，用10％的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳鑑定表達結果。挑選表達量較高的菌種進行重組蛋白的大量誘導表達和純化將pQE30-LD3-CAP2NC/M15的過夜培養物50ml接種500ml LB培養基，劇烈振搖4h，加入IPTG至終濃度為1mM，誘導3.5h，離心收集細菌沉澱，8M pH8.0尿素裂解過夜，離心收集上清用於純化，純化按Qiagen公司Ni-NTA使用說明書進行。經SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳確定純化效果。Brade-ford法595nm下測定目的蛋白濃度。
如圖7所示，pQE30-LD3-CAP2NC/M15誘導產物在分子量約60000 Daltons處出現對照菌pQE30/M15沒有的一條蛋白帶，符合LD3-CAP2NC的分子量。將菌種菌種活化後大量培養，IPTG誘導表達，Ni-NTA柱純化獲得純化LD3-CAP2NC融合蛋白。
灰度掃描分析表明目的蛋白LD3-CAP2NC佔總蛋白量達到10％以上。用Ni-NTA親和介質純化目的蛋白，經10％SDS-PAGE鑑定，純化後顯示為分子質量60 000的單一條帶(圖8)，經Smartview軟體密度掃描分析純化後的LD3-CAP2NC條帶佔純化後總蛋白百分比約為80％。用Brade-ford工作液在595nm下測純化後蛋白濃度，LD3-CAP2NC融合蛋白的濃度達3.25mg/ml。根據DNA測序的結果，推得蛋白序列為SEQ ID NO1。
3HIV蛋白酶切割帶有進化免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶靶分子
LD3純化蛋白為pET32(a)/BL21系統表達，其具體製備方法詳見《噬菌體展示proteinA和protein L的單結構域組合文庫及親和篩選》，生物化學與生物物理進展2005年32卷第6期535-543頁。
將純化後的LD3-CAP2NC蛋白用磷酸鹽緩衝液調至5μg/μl。取LD3-CAP2NC蛋白25μg於MES緩衝液中，加入不同濃度的HIV SF2蛋白酶，混勻後於37℃孵育16h，反應完成後，每一反應體系加入20μl 2倍SDS加樣緩衝液，振蕩混勻後100℃加熱7min，用10％的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳鑑定切割效果。
如圖9中所示2μg蛋白酶可以將LD3-CAP2NC蛋白切割成兩條目的條帶，大小與LD3-CAP2和NC蛋白的分子量一致，表明融合了LD3分子後，HIV蛋白酶靶分子仍可被HIVSF2株蛋白酶特異性切割。單獨的LD3蛋白未見任何切割作用實施例3 HIV蛋白酶切割帶有進化免疫球蛋白結合分子的展示HIV蛋白酶靶分子的噬菌體辣根過氧化物酶標記鼠抗M13噬菌體單克隆抗體(anti-M13-HRP monoclonalconjugate)購自Amersham Pharmacia公司。
將pCANTAB5S-LD3-CAP2NC和pCANTAB5S-LD3重組噬菌體用2×YT培養液均調整至1.0×1012TU/ml後，分別取噬菌體100μl，加固相包被的人IgG抗體反應孔中，37℃孵育3h後洗滌10次。每孔加入不同稀釋度的HIV SF2蛋白酶，37℃孵育4h後洗滌10次。反應後，在樣品孔中每孔加抗M13噬菌體酶標抗體，37℃孵育45min後加入TMB顯色，測D450值。
如表1、圖10所示，pCANTAB5S-LD3-CAP2NC可以很好的被HIV SF2蛋白酶切割，在蛋白酶濃度分別為10ug/ml、5ug/ml、2.5ug/ml時，HIV SF2蛋白酶切割噬菌體pCANTAB5S-LD3-CAP2NC的切割率分別為80％、53％、24％，且與HIV SF2蛋白酶濃度呈相關關係(0.05＞P＞0.02)，表現出較好的特異性作用。
加入HIV SF2蛋白酶後，結合於板上的pCANTAB5S-LD3數量也有減少，但在10ug/ml蛋白酶時最多僅減少了約61％，小於HIV SF2蛋白酶切割pCANTAB5S-LD3-CAP2NC的相應切割率，並且減少程度與HIV SF2蛋白酶濃度無相關關係，說明二者沒有表現出特異性的作用。
表1 不同劑量HIV SF2蛋白酶切割噬菌體表面的CAP2NC(D450)


噬菌體pCANTAB5S的製備在《新型噬菌體展示載體pCANTAB5S的構建》，安徽醫科大學學報，2004年第39卷第2期83-86頁中有詳細描述。
實施例4 應用帶有進化免疫球蛋白結合分子的展示HIV蛋白酶靶分子的噬菌體檢測HIV蛋白酶抑制劑類藥物對HIV蛋白酶切割活性的抑制作用將pCANTAB5S-LD3-CAP2NC和pCANTAB5S-LD3重組噬菌體用2×YT培養液均調整至1.0×1012TU/ml後，分別取噬菌體100μl，加固相包被的人IgG抗體反應孔中，37℃孵育3h後洗滌10次。每孔加入不同稀釋度的HIV SF2蛋白酶，分成兩組，一組中加入Indinavir至3μg/ml，另一組不加Indinavir，37℃孵育3h後洗滌10次。每孔加入不同稀釋度的HIV SF2蛋白酶，37℃孵育4h後洗滌10次。在樣品孔中每孔加抗M13噬菌體酶標抗體，37℃孵育45min後加入TMB顯色，測D450值。
如表2、圖11所示，同時加入HIV SF2蛋白酶與Indinavir組，結合於板上的pCANTAB5S-LD3-CAP2NC數量明顯高於僅加入HIV SF2蛋白酶組，且與對照組結合於板上噬菌體數量相當，說明蛋白酶抑制劑特性抑制蛋白酶對CAP2NC的特異切割。Indinavir同樣抑制蛋白酶對LD3的非特異切割。
表2 Indinavir對HIV SF2蛋白酶切割展示HIV CAP2NC蛋白的重組噬菌體的作用

噬菌體pCANTAB5S的製備在《新型噬菌體展示載體pCANTAB5S的構建》，安徽醫科大學學報，2004年第39卷第2期83-86頁中有詳細描述。
序列表110中國人民解放軍第二軍醫大學120帶有進化免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶底物分子、其製備方法及應用130PCNTJ07012716032170PatentIn version 3.12101211516212PRT213artificial sequence220
223帶有進化免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶靶分子LD3-CAP2NC的胺基酸序列4001Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala1 5 10 15Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly20 25 30Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Leu Leu35 40 45Ala Lys Glu Asn Gly Lys Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp Lys Gly Tyr50 55 60Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly Glu Leu Ala Asp Ala Gln Gln Asn65 70 75 80Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met85 90 95Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys100 105 110Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu115 120 125Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Glu Leu Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu130 135 140Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly145 150 155 160Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala
165 170 175Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Ala Lys Glu Asn Gly Lys Tyr180 185 190Thr Val Asp Val Ala Asp Lys Gly Tyr Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala195 200 205Gly Glu Leu Arg Ser Arg Pro Ile Val Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met210 215 220Val His Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val225 230 235 240Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala245 250 255Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr260 265 270Val Gly Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn275 280 285Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro290 295 300Ile Ala Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly305 310 315 320Thr Thr Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro325 330 335Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu340 345 350Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg355 360 365Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys370 375 380Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr385 390 395 400Glu Thr Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu405 410 415Lys Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys420 425 430Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Gly Gly Glu Ala435 440 445
Met Ser Gln Val Thr Asn Ser Ala Thr Ile Met Met Gln Arg Gly Asn450 455 460Phe Arg Asn Gln Arg Lys Ile Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu465 470 475 480Gly His Thr Ala Arg Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp485 490 495Lys Cys Gly Lys Glu Gly His Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln500 505 510Ala Asn Val Asp51521022111548212DNA213artificial sequence220
223帶有進化免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶靶分子LD3-CAP2NC的cDNA序列4002aaagaaaaaa caccagaaga accaaaagaa gaagttacta ttaaagcaaa cttaatctat 60gcagatggaa aaacacaaac agcagaattc aaaggaacat ttgaagaagc aacagcagaa 120gcatacagat atgctgactt attagcaaaa gaaaatggta aatatacagt agacgttgca 180gataaaggtt atactttaaa tattaaattt gctggagagc tcgctgatgc gcaacaaaat 240aacttcaaca aagatcaaca aagcgccttc tatgaaattt tgaacatgcc taacttaaac 300gaagcgcaac gcaatggttt cattcaaagt cttaaagacg atccaagcca aagcactaac 360gttttaggtg aagctaaaaa attaaacgaa tctcaagcac cgaaagagct caaagaaaaa 420acaccagaag aaccaaaaga agaagttact attaaagcaa acttaatcta tgcagatgga 480aaaacacaaa cagcagaatt caaaggaaca tttgaagaag caacagcaga agcatacaga 540tatgctgact tattagcaaa agaaaatggt aaatatacag tagacgttgc agataaaggt 600tatactttaa atattaaatt tgctggagag ctcaggtcta gaccgatcgt tcagaacatc 660cagggtcaga tggttcacca ggctatctct ccgcgtaccc tgaacgcttg ggttaaagtt 720gttgaagaaa aagctttctc tccggaagtt atcccgatgt tctctgctct gtctgaaggt 780gctaccccgc aggacctgaa caccatgctg aacaccgttg gtggtcacca ggctgctatg 840cagatgctga aagaaaccat caacgaagaa gctgctgaat gggaccgtgt tcacccggtt 900cacgctggtc cgatcgctcc gggtcagatg cgtgaaccgc gtggttctga catcgctggt 960accacctcta ccctgcagga acagatcggt tggatgacca acaacccgcc gatcccggtt1020
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ggtaaagaag gtcacaccgc tcgtaactgc cgtgctccgc gtaaaaaagg ttgctggaaa120tgcggtaaag aaggtcacca gatgaaagac tgcaccgaac gtcaggctaa cgtcgac 177210521134212DNA213artificial sequence220
223引物4005gggggtcgac gttagcctga cgttcggtgc agtc 34210621157212DNA213artificial sequence220
223引物4006ggtctagacc gatcgttcag aacatccagg gtcagatggt tcaccaggct atctctc 57210721155212DNA213artificial sequence220
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220
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223引物40015cctggaagaa atgatgaccg cttgccaggg tgttggtggt ccgggtcaca aagct 552101621155212DNA
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223引物40017ggtcctgcgg ggtagcacct tcagacagag cagagaacat cgggataact tccgg 552101821155212DNA213artificial sequence220
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223引物40019ttcacgcatc tgacccggag cgatcggacc agcgtgaacc gggtgaacac ggtcc 552102021155
212DNA213artificial sequence220
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223引物40023gaaccagcag ggtttcggtc atccagtttt taacttcctg agaagcctgt tcage 5521024
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223引物40027ctcgtaactg ccgtgctccg cgtaaaaaag gttgctggaa atgcggtaaa gaaggtcac 59
2102821158212DNA213artificial sequence220
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223引物40031gttaccacgc tgcatcatga tggtagcaga gt tggtaacc tgagacatag50
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223引物40032ggggggatcc ccggcctcta gagag2權利要求
1.一種重組的帶有進化免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶底物分子，其特徵在於，它是SEQID NO1所示的胺基酸序列的蛋白、或其保守性變異蛋白。
2.一種分離的多核苷酸，其特徵在於，它編碼權利要求1所述的蛋白。
3.如權利要求2所述的多核苷酸，其特徵在於，它是SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
4.一種表達載體，其特徵在於，它表達權利要求1所述的蛋白。
5.如權利要求4所述的表達載體，其特徵在於，它含有權利要求2或3所述的多核苷酸以及與該多核苷酸序列操作性相連的表達調控序列。
6.如權利要求4或5所述的載體，其特徵在於，所述載體為原核載體。
7.如權利要求6所述的載體，其特徵在於，所述原核載體為pQE30。
8.一種宿主細胞，其特徵在於，它被權利要求4-7中任一權利要求所述的表達載體所轉化。
9.如權利要求8所述的宿主細胞，其特徵在於所述宿主細胞為原核細胞。
10.如權利要求9所述的宿主細胞，其特徵在於所述原核細胞為大腸桿菌。
11.如權利要求10所述的宿主細胞，其特徵在於所述大腸桿菌為M15。
12.一種重組的帶有進化免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶底物分子的製備方法，其特徵在於，該方法包含(1)在適合表達權利要求1所述的蛋白的條件下，培養權利要求8-11中任一權利要求所述的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有免疫球蛋白結合活性的且可被HIV蛋白酶切割的多肽。
13.權利要求1所述的蛋白作為底物用於體外HIV蛋白酶的切割。
14.如權利要求13所述的用途，其特徵在於，將所述蛋白用於檢測HIV蛋白酶的活性。
15.如權利要求13所述的用途，其特徵在於，將所述蛋白用於篩選HIV蛋白酶抑制劑。
16.如權利要求13-15中任一權利要求所述的用途，其特徵在於，所述的HIV蛋白酶為HIV SF2株蛋白酶。
17.一種噬菌體，其特徵在於，它含有權利要求2或3所述的多核苷酸以及與該多核苷酸序列操作性相連的調控序列。
18.如權利要求17所述的噬菌體，其特徵在於，所述噬菌體為PCANTAB5S。
19.一種宿主細胞，其特徵在於，它被權利要求17或18所述的噬菌體所轉化。
20.如權利要求19所述的宿主細胞，其特徵在於所述宿主細胞為原核細胞。
21.如權利要求20所述的宿主細胞，其特徵在於所述原核細胞為大腸桿菌。
22.如權利要求21所述的宿主細胞，其特徵在於所述大腸桿菌為TG1。
23.如權利要求17或18所述的噬菌體的製備方法，其特徵在於，該方法包含(1)在適合培養帶有進化免疫球蛋白結合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌體的條件下，培養權利要求19-22中任一權利要求所述的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有免疫球蛋白結合活性且可被HIV蛋白酶切割的噬菌體。
24.如權利要求17或18所述的噬菌體用於體外結合免疫球蛋白並被HIV蛋白酶切割。
25.如權利要求24所述的用途，其特徵在於，將所述噬菌體用於檢測HIV蛋白酶的活性。
26.如權利要求24所述的用途，其特徵在於，將所述蛋白用於篩選HIV蛋白酶抑制劑。
27.如權利要求24-26中任一權利要求所述的用途，其特徵在於，所述的HIV蛋白酶為HIV SF2株蛋白酶。
全文摘要
本發明涉及新型HIV蛋白酶切割模型的體系構成、製備方法及應用。本發明公開一種重組的帶有進化免疫球蛋白結合分子的HIV蛋白酶底物分子，它是SEQ ID NO1所示的胺基酸序列的蛋白、或其保守性變異蛋白。本發明還公開了上述蛋白的製備方法及應用。本發明還公開了展示上述蛋白的噬菌體、其製備方法及應用。本發明公開的HIV蛋白酶切割模型具有簡便快速的特點，可用於HIV蛋白酶活性鑑定，HIV蛋白酶對蛋白酶抑制劑類藥物敏感性的鑑定以及HIV蛋白酶抑制劑類藥物的篩選與鑑定。
文檔編號C07K14/005GK101045748SQ20071003773
公開日2007年10月3日 申請日期2007年2月28日 優先權日2007年2月28日
發明者潘衛, 賈建安, 周波, 蔣少華, 陳秋莉, 曹潔, 趙平, 潘欣, 溫宗梅, 戚中田 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學