一種美洲大蠊提取物中活性成份的檢測方法
2023-06-11 06:37:06 3
專利名稱：一種美洲大蠊提取物中活性成份的檢測方法
技術領域：
本發明涉及藥物檢測方法，具體涉及中藥康復新液主要活性成分美洲大蠊提取物 的檢測方法，尤其涉及一種美洲大蠊提取物中活性成份的檢測方法。
背景技術：
中藥康復新液是本申請人已上市多年的產品，主要成分為美洲大蠊提取物。功能 主治為通利血脈，養陰生肌。內服用於瘀血陰滯，胃痛出血，胃、十二指腸潰瘍；以及陰虛 肺癆，肺結核的輔助治療。外用於金瘡、外傷、潰瘍燒傷、褥瘡之創面。有關美洲大蠊中的藥效活性成分報導較少，其主要的化學成分為信息素類及氨基 酸和各種昆蟲神經肽類，此外還有蜚蠊酸、蜚蠊酮、蟑螂油、過敏原成分、各種酶、細胞色素 A、B、C、甲殼素、煙酸及微量元素等，有明確藥效活性化學成分的報導也比較少。康復新液的臨床療效明確，但因所含成分複雜，真正的活性物質基礎不夠明確，現 行質量標準中僅收錄性狀、鑑別(胺基酸和嘧啶鹼的鑑別)、PH值及總胺基酸含量等，並以 此作為主要質控指標。由於含量測定項僅有總胺基酸，不能真正控制康復新液的質量。隨 著對藥品質量的要求不斷提高，對康復新液進一步深入研究，找到能真正體現其活性的物 質基礎，提高其質量標準具有重要的意義。為此，本發明人從分子水平基礎上闡明康復新液的藥效活性成分，經過艱苦努力， 從康復新液中成功地分離到了一種具有顯著的抗炎、促進肉芽組織增生、創傷癒合等活性 作用的化合物單體成分(化學名(3R)-3-甲基-7-羥甲基-8-羥基-3，4-二氫異香豆 素-6-0- β -D-吡喃葡萄糖苷，簡稱KFX-4)，專利申請號=200910200557. 9。目前，對於美洲大蠊提取物及康復新液的質量標準中只有總胺基酸的質量控制， 與其藥效沒有直接的關係，而本發明人對KFX-4的藥效試驗表明具有顯著的抗炎、促進肉 芽組織增生、創傷癒合等活性作用，與其適應症一致。康復新液中KFX-4的質控檢測方法未 見文獻報導，且因其含量較低，雜質幹擾非常嚴重，常規檢測方法難以實施，存在困難。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在於研究康復新液的藥效活性成分(3R)-3-甲 基-7-羥甲基-8-羥基-3，4- 二氫異香豆素-6-0- β -D-吡喃葡萄糖苷，簡稱KFX-4的含 量，設計更好控制該產品質量的方法。本發明提供了一種美洲大蠊提取物中活性成份的檢測方法。具體提供了美洲大蠊 提取物中的活性成份(3R) -3-甲基-7-羥甲基-8-羥基-3，4- 二氫異香豆素-6-0- β -D-吡 喃葡萄糖苷，KFX-4的檢測方法。有關康復新液及美洲大蠊提取物中活性成份KFX-4的檢測方法未見文獻報導，且 因其含量較低，雜質幹擾非常嚴重，常規檢測方法難以實施。本發明人經多次研究，試用了 多種分離富集KFX-4的方法，選用多種樹脂和固相萃取柱，並試用了多種洗脫液和色譜分 離條件，最終建立了康復新液中KFX-4的檢測方法。
本發明採用HPLC色譜法，包括下列步驟(1)色譜條件與系統以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以甲醇或乙腈_水 (0-50 100-50V/V)為流動相，流速 0. 2-2. Oml/min ；檢測波長為 210nm_400nm 中的一個 或幾個波長或二極體陣列檢測器，進樣量5-50 μ 1，理論板數按(3R)-3-甲基-7-羥甲 基-8-羥基-3，4- 二氫異香豆素-6-0- β -D-吡喃葡萄糖苷峰計算應不低於4000，且與相鄰 雜質峰的分離度均大於1. 5 ；(2)對照品溶液的製備取KFX-4對照品(京新藥業提取精製，製備方法見專利， 申請號=200910200557. 9)適量，精密稱定，加甲醇或乙腈的5_50%水溶液，製成每ml含 2-100 μ g (3R) -3-甲基-7-羥甲基-8-羥基-3，4- 二氫異香豆素-6-0- β -D-吡喃葡萄糖苷 的溶液，即得；(3)美洲大蠊提取物供試品溶液的製備取美洲大蠊提取物lg，精密稱定，置IOml 量瓶內，加水約5-7ml，加熱或超聲使溶解，定容，離心，取離心清液l_5ml，過固相萃取小柱 或聚苯乙烯型吸附樹脂，用水l_5ml洗滌兩次，棄去，用甲醇或乙腈或其中任一的5-50%水 溶液2ml洗脫或梯度洗脫，合併洗脫液，置水浴蒸乾，殘渣用甲醇或乙腈的5-50%水溶液溶 解並定量轉移到Iml或2ml量瓶，離心，上清液作為供試品溶液；(4)分別取上述溶液進行色譜分析，以峰面積外標法計算(3R)-3-甲基-7-羥甲 基-8-羥基-3，4- 二氫異香豆素-6-0-β -D-吡喃葡萄糖苷含量(參照中華人民共和國藥 典2005年版二部附錄V D)。本發明方法可用於中藥康復新液的質量控制，檢測其中的KFX-4含量，有效控制 藥品質量。具體方法為康復新液供試品溶液的製備精密量取康復新液10ml，經lOOOOrpm， 離心lOmin，取上清液過固相萃取小柱或聚苯乙烯型吸附樹脂，用l-5ml水洗滌，棄去洗滌 液，再用0. 01-0. 5mol/L氫氧化鈉溶液l_5ml洗滌，棄去洗滌液；最後用甲醇或乙腈或其中 任一的5-50%水溶液l-5ml洗脫或梯度洗脫，收集洗脫液，作為供試品溶液，分別取上述溶 液按上述方法進行色譜分析，以峰面積外標法計算KFX-4含量。本發明方法所述固相萃取柱為反相聚合物固相萃取柱，包括ODS或HLB或Strata X固相萃取柱的任一種；所述聚苯乙烯型吸附樹脂，包括D101、麗200、HPD100, HPD400、 HPD450、AB-8、D4020、S_8，HZ806 或 HP-20 的任一種。本發明提供了美洲大蠊提取物中活性成份(3R)-3_甲基-7-羥甲基-8-羥基_3， 4- 二氫異香豆素-6-0- β -D-吡喃葡萄糖苷，KFX-4的檢測方法，為中藥康復新液提供有效 的質量控制方法，對於提高產品質量和藥物的安全性有較大的實用價值。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發明作進一步說明。美洲大蠊提取物批號Τ09070101、Τ09070102、Τ09070103、Τ09070104、Τ09070201、 Τ09070202、Τ09060103、Τ09060104、Τ09060201、Τ090104。康復新液批號:090602、090608、090609、090709、090805、090807、091101、091103、 091201,081003,071004,071003ο以上美洲大蠊提取物和康復新液樣品均由內蒙古京新藥業有限公司提供，供下列實施例使用。實施例1美洲大蠊提取物製備(以下檢測用的各批號美洲大蠊提取物均按此法製備)取乾燥美洲大蠊1kg，置提取罐罐內，加入90%的乙醇溶液，於60°C溫浸三次，每 次12小時，第一次用乙醇為美洲大蠊的八倍量；第二次為六倍量；第三次四倍量。合併溫浸 液，過濾濃縮，回收乙醇至無醇味。所得濃縮液加純化水為美洲大蠊的1-2倍量。靜置24 小時以上，分離並棄去沉澱、油層，水溶液過濾，減壓濃縮至相對密度1. 15-1.20(70°C )，即 得。實施例2取T09070101批號美洲大蠊提取物lg，精密稱定，置IOml量瓶內，加水約5_7ml， 超聲溶解，定容至10ml。離心，取離心清液lml，過Strata X固相萃取小柱，用水洗滌兩次， 每次2ml，棄去，用20%甲醇，30%甲醇，50%甲醇各2ml依次洗脫，合併洗脫液，置水浴蒸 幹，殘渣用50%甲醇溶解並定量轉移到Iml或2ml量瓶，離心，取上清液進行色譜分析[色 譜分析條件以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以甲醇-水(20 80)V/V為流動相，流 速0. 8ml/min ；檢測波長為265nm，進樣量5 μ 1，以峰面積外標法計算KFX-4的含量]。結 果測得KFX-4含量為0. 485mg/g。實施例3取T09070101批號美洲大蠊提取物約lg，精密稱定，置IOml量瓶內，加水約 5-7ml，加熱或超聲使溶解，定容。離心，取離心清液Iml，過ODS (十八烷基矽烷健合矽膠) 固相萃取小柱，用水洗滌兩次，每次2ml，棄去，用20%甲醇，30%甲醇，50%甲醇各2ml依次 洗脫，合併洗脫液，置水浴蒸乾，殘渣用50%甲醇溶解並定量轉移到Iml或2ml量瓶，離心， 取上清液進行色譜分析(方法同實施例1)。結果測得KFX-4含量為0. 483mg/g。實施例4取T09070101批號美洲大蠊提取物約lg，精密稱定，置IOml量瓶內，加水約 5_7ml，加熱或超聲使溶解，定容。離心，取離心清液1ml，過HLB固相萃取小柱，用水洗滌兩 次，每次2ml，棄去，用20%甲醇，30%甲醇，50%甲醇各2ml依次洗脫，合併洗脫液，置水浴 蒸乾，殘渣用50%甲醇溶解並定量轉移到Iml或2ml量瓶，離心，取上清液進行色譜分析 (方法同實施例1)。結果測得KFX-4含量為0. 478mg/g。實施例5精密移取090807批康復新液10ml，lOOOOrpm，離心lOmin，取離心清夜過DlOl大 孔樹脂柱(lg，內徑15mm)，用水，5%乙醇各IOml洗滌，洗滌液棄去，繼續用50%乙醇50ml 洗脫，洗脫液置水浴蒸乾，殘渣用50%甲醇溶解並定量轉移到Iml或2ml量瓶，離心。取上 清液進行色譜分析(方法同實施例1)。結果測得KFX-4含量為2. 09 μ g/ml。實施例6精密移取090807批康復新液IOml，lOOOOrpm,離心lOmin，取離心清夜過MN200大 孔樹脂柱(lg，內徑15mm)，用水，5%乙醇各IOml洗滌，洗滌液棄去，繼續用50%乙醇50ml 洗脫，洗脫液置水浴蒸乾，殘渣用50%甲醇溶解並定量轉移到Iml或2ml量瓶，離心。取上 清液進行色譜分析(方法同實施例1)。結果測得KFX-4含量為2. 16 μ g/ml。實施例7
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精密移取090807批康復新液10ml，IOOOOrpm,離心lOmin，取離心清夜過HPDlOO 大孔樹脂柱(lg，內徑15mm)，用水，5%乙醇各IOml洗滌，洗滌液棄去，繼續用50%乙醇 50ml洗脫，洗脫液置水浴蒸乾，殘渣用50%甲醇溶解並定量轉移到Iml或2ml量瓶，離心。 取上清液進行色譜分析(方法同實施例1)。結果測得KFX-4含量為2. 14yg/ml。實施例8精密移取090807批康復新液10ml，IOOOOrpm,離心lOmin，取離心清夜過HPD400 大孔樹脂柱(lg，內徑15mm)，用水，5%乙醇各IOml洗滌，洗滌液棄去，繼續用50%乙醇 50ml洗脫，洗脫液置水浴蒸乾，殘渣用50%甲醇溶解並定量轉移到Iml或2ml量瓶，離心。 取上清液進行色譜分析(方法同實施例1)。結果測得KFX-4含量為2. 08g/ml。實施例9精密移取090807批康復新液10ml，IOOOOrpm,離心lOmin，取離心清夜過HPD450 大孔樹脂柱(lg，內徑15mm)，用水，5%乙醇各IOml洗滌，洗滌液棄去，繼續用50%乙醇 50ml洗脫，洗脫液置水浴蒸乾，殘渣用50%甲醇溶解並定量轉移到Iml或2ml量瓶，離心。 取上清液進行色譜分析(方法同實施例1)。結果測得KFX-4含量為2. 12 μ g/ml。實施例10精密移取090807批康復新液10ml，lOOOOrpm，離心lOmin，取離心清夜過AB-8大 孔樹脂柱(lg，內徑15mm)，用水，5%乙醇各IOml洗滌，洗滌液棄去，繼續用50%乙醇50ml 洗脫，洗脫液置水浴蒸乾，殘渣用50%甲醇溶解並定量轉移到Iml或2ml量瓶，離心。取上 清液進行色譜分析(方法同實施例1)。結果測得KFX-4含量為2. 10 μ g/ml。實施例11精密移取090807批康復新液IOml，lOOOOrpm,離心lOmin，取離心清夜過D4020大 孔樹脂柱(lg，內徑15mm)，用水，5%乙醇各IOml洗滌，洗滌液棄去，繼續用50%乙醇50ml 洗脫，洗脫液置水浴蒸乾，殘渣用50%甲醇溶解並定量轉移到Iml或2ml量瓶，離心。取上 清液進行色譜分析(方法同實施例2)。結果測得KFX-4含量為2. 13 μ g/ml。實施例12精密移取090807批康復新液IOml，lOOOOrpm,離心lOmin，取離心清夜過S-8大孔 樹脂柱(lg，內徑15mm)，用水，5%乙醇各IOml洗滌，洗滌液棄去，繼續用50%乙醇50ml洗 脫，洗脫液置水浴蒸乾，殘渣用50%甲醇溶解並定量轉移到Iml或2ml量瓶，離心。取上清 液進行色譜分析(方法同實施例1)。結果測得KFX-4含量為2. 08 μ g/ml。實施例13精密移取090807批康復新液IOml，lOOOOrpm,離心lOmin，取離心清夜過HZ806大 孔樹脂柱(lg，內徑15mm)，用水，5%乙醇各IOml洗滌，洗滌液棄去，繼續用50%乙醇50ml 洗脫，洗脫液置水浴蒸乾，殘渣用50%甲醇溶解並定量轉移到Iml或2ml量瓶，離心。取上 清液進行色譜分析(方法同實施例1)。結果測得KFX-4含量為2. 12 μ g/ml。實施例14 精密移取090807批康復新液IOml，lOOOOrpm,離心lOmin，取離心清夜過HP-20大 孔樹脂柱(lg，內徑15mm)，用水，5%乙醇各IOml洗滌，洗滌液棄去，繼續用50%乙醇50ml 洗脫，洗脫液置水浴蒸乾，殘渣用50%甲醇溶解並定量轉移到Iml或2ml量瓶，離心。取上 清液進行色譜分析(方法同實施例1)。結果測得KFX-4含量為2. 10 μ g/ml。
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實施例15本發明檢測方法的條件選擇試驗1.檢測波長的選擇二極體陣列檢測器全波長掃描，顯示最大吸收波長兩個為220nm和265nm，由於 220nm接近紫外末端吸收，故選擇265nm為檢測波長。2.流動相的選擇洗脫方式一梯度洗脫。流動相A 0. 2%冰乙酸的水溶液流動相B 0. 2%冰乙酸的的乙腈溶液
時間(分鐘)流動相)流動相B(%)010005100020802035595洗脫方式二 等度洗脫。流動相為甲醇-水(20 80)V/V，流速為0.8ml/min兩種洗脫方法，KFX-4與前後峰均完全分離且峰純度大於990，分離度均符合要 求。表明流動相適應良好。質控標準中選用洗脫方式二作為色譜條件。3.專屬性試驗取美洲大蠊提取物按測定法檢測，顯示KFX-4的吸收峰在DAD峰純度檢測中，峰純 度大於990。表明此法有較強的專屬性。4.定量限稀釋KFX-4對照品溶液，使液相色譜圖中顯示的KFX-4峰的信噪比約等於10 1， 結果此時KFX-4濃度為0. 618 μ g/ml。5.線形與範圍配製KFX-4對照品溶液貯備液，稀釋至不同濃度，注入HPLC，記錄色譜圖，以 KFX-4對照品的峰面積⑴和KFX-4濃度⑴為X軸進行線性回歸，得回歸方程y = 11. 498x-0. 883r = 0. 99998。表1 線性與範圍檢測結果
KFX-4 的 量(μ g/ml)0. 6181. 8443. 6889. 22018. 4427. 6646. 1092. 2峰面積7. 720. 542. 38106.04211. 66311. 01528. 601060. 15 由上述結果可知在0.618-9. 28 μ g/ml範圍內，線性關係良好，可採用外標一點法
7計算含量。6.儀器精密度取濃度21. 74 μ g/ml的KFX-4對照品溶液，連續進樣6次，進樣量5 μ 1，記錄峰面 積，計算相對標準偏差RSD)。結果表明儀器精密度良好，見表2。表2儀器精密度考察結果
權利要求
一種美洲大蠊提取物中活性成份KFX 4的檢測方法，其特徵在於該方法包括下列步驟(1)色譜條件與系統以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以甲醇或乙腈 水0 50∶100 50V/V為流動相，流速0.2 2.0ml/min；檢測波長為210nm 400nm中的一個或幾個波長或二極體陣列檢測器，進樣量5 50μl，理論板數按KFX 4峰計算應不低於4000，且與相鄰雜質峰的分離度均大於1.5；(2)對照品溶液的製備取KFX 4對照品適量，精密稱定，加甲醇或乙腈的5 50％水溶液，製成每ml含2 100μg KFX 4的溶液，即得；(3)美洲大蠊提取物供試品溶液的製備取美洲大蠊提取物約1g，精密稱定，置10ml量瓶內，加水約5 7ml，加熱或超聲使溶解，加水定容，離心，取離心清液1 5ml，過固相萃取小柱或聚苯乙烯型吸附樹脂，用水1 5ml洗滌兩次，棄去，用甲醇或乙腈的5 50％水溶液2ml洗脫或梯度洗脫，合併洗脫液，置水浴蒸乾，殘渣用甲醇或乙腈的5 50％水溶液溶解並定量轉移到1ml或2ml量瓶，離心，上清液作為供試品溶液；(4)分別取上述溶液進行色譜分析，以峰面積外標法計算KFX 4含量。
2.根據權利要求1所述一種美洲大蠊提取物中活性成份的檢測方法，其特徵在於所述 活性成份為(3R)-3-甲基-7-羥甲基-8-羥基-3，4-二氫異香豆素-6-0-β-D-吡喃葡萄 糖苷。
3.根據權利要求1所述一種美洲大蠊提取物中活性成份的檢測方法，其特徵在於所 述方法用於檢測中藥康復新液中的(3R)-3-甲基-7-羥甲基-8-羥基-3，4- 二氫異香豆 素-6-0-β -D-吡喃葡萄糖苷含量。
4.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述檢測中藥康復新液中的(3R)-3-甲 基-7-羥甲基-8-羥基-3，4- 二氫異香豆素-6-0- β -D-吡喃葡萄糖苷含量包括下列步驟(1)色譜條件與系統以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以甲醇或乙腈-水0-50 100-50V/V為流動相，流速0.2-2. Oml/min ；檢測波長為210nm_400nm中的一個或幾 個波長或二極體陣列檢測器，進樣量5-50μ 1，理論板數按KFX-4峰計算應不低於4000，且 與相鄰雜質峰的分離度均大於1. 5 ；(2)對照品溶液的製備取KFX-4對照品適量，精密稱定，加甲醇或乙腈的5-50% 水溶液，製成每ml含2-100μβ(3Κ)-3-甲基_7_羥甲基-8-羥基-3，4-二氫異香豆 素-6-0-β -D-吡喃葡萄糖苷的溶液，即得；(3)康復新液供試品溶液的製備精密量取康復新液10ml，經IOOOOrpm，離心lOmin， 取上清液過固相萃取小柱或聚苯乙烯型吸附樹脂，用l_5ml水洗滌，棄去洗滌液，再用 0. 01-0. 5mol/L氫氧化鈉溶液l-5ml洗滌，棄去洗滌液；最後用甲醇或乙腈的5-50%水溶液1-5ml洗脫或梯度洗脫，收集洗脫液，作為供試品溶液；(4)分別取上述溶液進行色譜分析，以峰面積外標法計算(3R)-3-甲基-7-羥甲 基-8-羥基-3，4- 二氫異香豆素-6-0- β -D-吡喃葡萄糖苷含量。
5.根據權利要求1或4所述的檢測方法，其特徵在於所述固相萃取柱為反相聚合物固 相萃取柱，包括ODS或HLB或Strata X固相萃取柱的任一種；所述聚苯乙烯型吸附樹脂，包 括 D101、MN200、HPDlOO、HPD400、HPD450、AB-8、D4020、S-8，HZ806 或 HP-20 的任一種。
全文摘要
本發明提供了美洲大蠊提取物中活性成份(3R)-3-甲基-7-羥甲基-8-羥基-3，4-二氫異香豆素-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，KFX-4的檢測方法。採用HPLC色譜法，以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以甲醇或乙腈-水(0-50∶100-50V/V)為流動相，流速0.2-2.0ml/min；檢測波長為210nm-400nm中的一個或幾個波長或二極體陣列檢測器，進樣量5-50μl，理論板數按KFX-4峰計算應不低於4000，且與相鄰雜質峰的分離度均大於1.5進行色譜分析，以峰面積外標法計算KFX-4含量。本發明為中藥康復新液提供有效的質量控制方法，對於提高產品質量和藥物的安全性有較大的實用價值。
文檔編號G01N30/02GK101957345SQ201010118350
公開日2011年1月26日 申請日期2010年3月5日 優先權日2010年3月5日
發明者餘國珍, 陳鑑東 申請人:浙江京新藥業股份有限公司;內蒙古京新藥業有限公司