Vbnc狀態啤酒易感乳酸菌的誘導及復甦方法
2023-06-12 01:06:26 1
Vbnc狀態啤酒易感乳酸菌的誘導及復甦方法
【專利摘要】本發明屬於食品微生物培養和檢測領域，涉及兩種誘導啤酒易感乳酸菌進入「活的但不可培養」（viable?but?non-culturable，VBNC）狀態的方法以及將該VBNC狀態下易感乳酸菌復甦至正常狀態的方法和應用。其中兩種誘導方法分別為，一是通過0～4℃低溫儲藏；二是通過啤酒環境下連續傳代馴化培養，這兩種方法均可獲得處於VBNC狀態下的啤酒易感乳酸菌。另外，本發明還包括一種通過添加過氧化氫酶促進VBNC細菌生長的復甦方法。VBNC狀態啤酒易感乳酸菌的誘導及復甦研究對找到逃避檢測的「隱形」汙染源，提高啤酒檢測結果的準確性和檢測效率具有十分重要的意義，並為啤酒易感乳酸菌的預防監控奠定基礎。
【專利說明】VBNC狀態啤酒易感乳酸菌的誘導及復甦方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及啤酒易感乳酸菌「活的但不可培養」(VBNC)狀態的兩種誘導方法以及一種VBNC狀態易感乳酸菌的復甦方法和應用，屬於食品微生物培養和檢測領域。
【背景技術】
[0002]據國家統計局公布的最新數據顯示，2012年我國啤酒產量累計達4902萬千升，同比增長3.1%，與此同時我國啤酒的生產品種也向多樣化、個性化方向發展，產品質量穩步提高，企業規模不斷擴大，啤酒工業整體裝備水平日新月異。我國的啤酒工業已發展成為一個具有現代化規模的工業體系，在國民經濟中佔有舉足輕重的地位。雖然啤酒業近幾十年來的發展勢頭良好，但是汙染啤酒的微生物依然是困擾國內外各大啤酒釀造企業的一大難題。同時消費者評價啤酒質量的標準是口味新鮮、酒體澄清、泡沫豐富以及色度適中，這就決定了啤酒發酵需要純種發酵，這樣才能滿足口味純正、風味穩定的要求。所以國內和世界各大啤酒生產企業都對微生物汙染的控制特別嚴格。[0003]啤酒長期以來一直被公認為安全性食品，原因在於其特定的理化性質，含有一定濃度的酒精(0.5~10%，w/w)、極低含量的氧(〈0.lppm)、高濃度的二氧化碳(大約0.5%，w/W)、較低pH (3.8~4.7)且存在具有抗菌特性的酒花苦味物質，缺乏微生物生長和繁殖所需要的營養(如單糖和胺基酸等)。因此，啤酒具有一定的抑菌作用，能夠抵抗一般微生物的侵襲，並能防止人體致病菌的出現。儘管如此，在啤酒廠的環境中，仍然有一些耐酸、耐酒花苦味物質和專性厭氧的微生物，它們利用酵母的中間代謝產物和酵母自溶物，給啤酒生產帶來危害。
[0004]我國雖然多年來連續保持「世界啤酒第一產銷大國」的地位，但是與國外先進水平相比還有較大的差距，特別是在啤酒釀造中易感乳酸菌的檢測技術與研究方面。啤酒易感乳酸菌亦稱為啤酒有害微生物，是指其代謝產物能夠對啤酒的風味和口感產生損害，或者通過形成混濁、沉澱等使啤酒外觀發生變化的微生物的總稱。傳統的平板培養法一直是國內外大多數啤酒廠檢測汙染微生物的常規方法，但對於某些啤酒易感乳酸菌尤其是難培養菌使用該法一般需要十天甚至更長的時間，其結果嚴重滯後於生產，無法滿足對啤酒生產過程汙染菌的控制需求。06年Suzuki等發現,兩種啤酒易感乳酸菌LactobacillusIindneri和L.paracolIinoides可通過形成VBNC狀態以適應啤酒環境,使用常規的平板培養法難以檢測出，但對於啤酒同樣具有汙染能力(Suzuki, K.，Iijima, K.，Asano, S.，Kuriyama, H., and Kitagawa, Y.1nduction of viable but nonculturable state in beerspoilage lactic acid bacteria, J.1nst.Brew.，2006，112，295-301)。VBNC 狀態指可培養的不能產生孢子的細菌遇到環境壓力後，在瓊脂培養基上形成的菌落數不斷下降直至完全消失，但此期間細胞總數基本恆定，這些細胞仍然是「活」的，條件適宜後能夠再次回到可培養狀態。此狀態下的細菌仍具有細胞的完整性，並保持低水平的呼吸作用及代謝活性。為了更好地監控啤酒生產的衛生狀況特別是純生啤酒的純淨化釀造，迫切需要建立更加快速、高效、準確度高的微生物檢測鑑定體系。通過對啤酒易感乳酸菌特別是難培養菌VBNC狀態的研究，可以找到逃避檢測的「隱形」汙染源，提高啤酒檢測結果的準確性和檢測效率，為啤酒易感乳酸菌的預防監控奠定基礎。
【發明內容】
[0005]為了更好地還原啤酒易感乳酸菌在啤酒釀造環境中的實際生存狀態，並解決活的但不可培養(VBNC)狀態乳酸菌復甦生長的問題，本發明的目的在於提供兩種誘導啤酒易感乳酸菌進入VBNC狀態的方法。
[0006]本發明的另一目的在於提供一種將上述處於VBNC狀態的易感乳酸菌復甦至正常狀態的方法。
[0007]本發明的目的及解決其技術問題是採用以下技術方案來實現的。依據本發明提出的一種VBNC狀態啤酒易感乳酸菌的誘導方法，其可以通過低溫儲藏法或啤酒內連續傳代馴化法分別獲得處於VBNC狀態下的耐乙酸乳桿菌(L.acetotolerans)2011-8,該誘導方法包括如下步驟:
[0008]I)原始菌株的培養
[0009]L.acetotolerans2011-8採用MRS固體培養基進行純化復壯，挑取固體平板上較大的菌落接種於液體MRS培養基中，25-28°C厭氧培養3_5天；
[0010]2) VBNC狀態菌的誘導(以下兩種工藝可以任選其一)
[0011]a.低溫儲藏
[0012]取L.acetotolerans2011-8培養物放入0-4°C冰箱內保存,並且每隔7天進行一次MRS平板計數，本試驗重複三次且設定正常培養下的L.acetotolerans2011-8為對照組，直至平板25-28°C厭氧培養14天無單菌落出現；
[0013]b.啤酒內連續傳代
[0014]以步驟I)中的 L.acetotolerans2011_8 的培養物(約 I X 107cfu/mL)作為第 0 代，取ImL的0#培養物接種於IOmL滅菌後的脫氣啤酒中，25_28°C厭氧培養6天至出現絮狀沉澱，即作為第I代(1#)。再取ImL的1#培養物接種於IOmL滅菌後的脫氣啤酒中，25-28°C厭氧培養6天，另外吸取0.1mL的1#培養物塗布於MRS固體平板上進行細菌計數，重複上述操作直至計數平板25-28°C厭氧培養14天無單菌落出現。
[0015]3 ) VBNC狀態菌的檢測
[0016]首先選用吖啶橙螢光顯微鏡計數法(AODC)直接計數測定細菌總數，具體操作方法如下:將新鮮培養的菌液進行10倍系列稀釋，取適當濃度的稀釋液加終濃度2%的甲醛固定，再取ImL固定後的稀釋液加100 u L0.1%的吖啶橙溶液染色5min，再將0.22 y m黑色微孔濾膜(美國Millipore公司)置於無自發螢光的載玻片上，取適量樣品滴於濾膜上，待菌液略幹蓋上載玻片並壓緊，在載玻片上滴一滴無自發突光的香柏油，用突光顯微鏡(日本Olympus BH-2)於暗室中觀察並計數。激發光濾光片為480nm,突光濾光片為510nm。最後根據所取菌液的量和測得的細菌個數換算出菌液的細菌濃度。
[0017]細菌活性檢測米用由Molecular Probes公司生產的LIVE/DEAD@BacLight?Bacterial Viability試劑盒。該試劑盒由兩種專染核酸染料組成:一種是綠色突光染料SYT0-9,能滲入完整細胞膜結構的菌體內；一種是紅色染料PI，僅能滲到細胞膜破損的菌體內，並且與SYT0-9競爭核酸著染位點。經此試劑盒染色後，活細胞呈現綠色螢光，而死細胞則呈現紅色螢光。試劑盒中的兩種染料均按要求配製成工作濃度於_20°C保存。取ImL計數平板上無單菌落存在的培養物於7000g離心5min，用無菌生理鹽水洗滌兩次，儘可能地除去細菌培養液，以免培養基產生自發光而幹擾觀察結果；再加入50 μ L的無菌蒸餾水重懸菌體沉澱，加入各25 μ L的SYTO-9和PI，吹吸混勻後避光染色15_20min。取適量樣品滴於無自發螢光的載玻片上，蓋上載玻片，並在載玻片上滴I滴無自發螢光的香柏油，用螢光顯微鏡(日本Olympus BH-2)於暗室中觀察並計數。
[0018]另外，本發明還提出了一種能促進VBNC狀態乳酸菌生長並將其復甦至可培養狀態的方法，具體步驟如下:
[0019]首先，製備過氧化氫酶液:準確稱取2mg過氧化氫酶(Sigma產品，2000~5000U/mg)溶解於ImL磷酸鹽緩衝液(50mM,pH7.0)中，充分混勻後,3000r/min離心5min取上清，隨後通過0.45 μ m無菌濾膜過濾除菌，酶液現用現配以確保活力。隨後吸取50 μ L、IO6活菌數/mL的VBNC狀態L.acetotolerans2011_8加入到200 μ L的上述過氧化氫酶溶液中，混勻並於25-28°C靜置2h後塗布於MRS平板上。同時以不添加過氧化氫酶的VBNC菌懸液作為對照。
[0020]藉由上述技術方案，本發明具有的優點和有益效果是:
[0021]本發明首次通過低溫儲藏和啤酒內連續傳代兩種誘導方法均獲得了 VBNC狀態的L.acetotolerans2011-8，並採用過氧化氫酶處理促進VBNC狀態菌的復甦生長，應用於啤酒實際生產可提高微生物檢測結果的準確性和檢測效率，有利於找到逃避檢測的「隱形」汙染源，為啤酒易感乳酸菌的預防監控奠定基礎。本發明還具有操作簡單，復甦快等特點。 【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1是本發明VBNC狀態易感乳酸菌的誘導及復甦方法工藝流程圖。
[0023]圖2a和圖2b分別為為Lactobacillus acetotolerans2011_8通過低溫儲藏和啤酒內連續傳代法兩種方式誘導的生長曲線。其中，細菌總數(.)；活菌數(▲);可培養數(_)。
[0024]圖3a和圖3b分別為螢光顯微鏡檢測經低溫儲藏和啤酒內連續傳代法兩種方式誘導後 Lactobacillus acetotolerans2011_8 的活性變化圖。
[0025]圖4 為過氧化氫酶處理對 VBNC 狀態 Lactobacillus acetotolerans2011_8 的復甦效果圖。其中，A:過氧化氫酶處理；B:CK。
【具體實施方式】
[0026]本發明採用低溫儲藏和啤酒環境下連續傳代馴化兩種方法獲得處於VBNC狀態下的 L.acetotolerans2011_8o
[0027]請參閱圖1所示，本發明的誘導方法包括如下步驟:
[0028]I)原始菌株的培養
[0029]原始菌株為啤酒易感乳酸菌L.acetotolerans2011-8,該菌的分離篩選詳見文獻報導(方貴權等，中國啤酒易感乳酸菌的研究[J].啤酒科技，2011，2:25-28)，L.acetotolerans2011-8採用MRS固體培養基進行純化復壯，挑取固體平板上較大的菌落接種於液體MRS培養基中，於25-28°C厭氧培養3_5天至細菌計數約為107cfu/mL ；[0030]2) VBNC狀態菌的誘導(以下兩種工藝方法可以任選其一)
[0031]a.低溫儲藏
[0032]取L.acetotolerans2011-8培養物放入0_4°C冰箱內保存，並且每隔7天進行一次MRS平板計數，本試驗重複三次且設定正常培養下的L.acetotolerans2011-8為對照組，直至第105天發現，平板25-28°C厭氧培養14天後無單菌落長出；
[0033]b.啤酒內連續傳代
[0034]以步驟I)中的L.acetotolerans2011-8的培養物作為第0代，取ImL的0代培養物接種於IOmL滅菌後的脫氣啤酒中，25-28°C厭氧培養6天至出現絮狀沉澱，即作為第I代。再取ImL的I代培養物接種於IOmL滅菌後的脫氣啤酒中，於25-28°C厭氧培養6天，另外吸取0.1mL的1#培養物塗布於MRS固體平板上進行細菌計數，重複上述操作直至第18代，計數平板25-28°C厭氧培養14天後無單菌落出現。
[0035]3 ) VBNC狀態菌的檢測
[0036]首先選用吖啶橙螢光顯微鏡計數法(AODC)直接計數測定細菌總數，具體操作方法如下:將新鮮培養的菌液進行10倍系列稀釋，取適當濃度的稀釋液加終濃度2%的甲醛固定，再取ImL固定後的稀釋液加100 u L0.1%的吖啶橙溶液染色5min，再將0.22 y m黑色微孔濾膜(美國Millipore公司)至於無自發螢光的載玻片上，取適量樣品滴於濾膜上，待菌液略幹蓋上載玻片並壓緊，在載玻片上滴一滴無自發突光的香柏油，用突光顯微鏡(日本Olympus BH-2)於暗室中觀察並計數。激發光濾光片為480nm,突光濾光片為510nm。最後根據所取菌液的量和測得的細菌個數換算出菌液的細菌濃度。
[0037]細菌活性檢測米用由Molecular Probes公司生產的LIVE/DEADOBacLight?Bacterial Viability試劑盒。該試劑盒由兩種專染核酸染料組成:一種是綠色突光然染料SYT0-9，能滲入完整細胞膜結構的菌體內；一種是紅色染料PI，僅能滲到細胞膜破損的菌體內，並且與SYT0-9競爭核酸著染位點。經此試劑盒染色後，活細胞呈現綠色螢光，而死細胞則呈現紅色螢光。試劑盒中的兩種染料均按要求配製成工作濃度於_20°C保存。取ImL計數平板上無單菌落存在的培養物於7000g離心5min，用無菌生理鹽水洗滌兩次，儘可能地除去細菌培養液，以免培養基產生自發光而幹擾觀察結果；再加入50 y L的無菌蒸餾水重懸菌體沉澱，加入各25 ii L的SYT0-9和PI，吹吸混勻後避光染色15_20min。取適量樣品滴於無自發螢光的載玻片上，蓋上載玻片，並在載玻片上滴I滴無自發螢光的香柏油，用螢光顯微鏡(日本Olympus BH-2)於暗室中觀察並計數。激發光濾光片為480nm，螢光濾光片為510nm。
[0038]檢測結果顯示，啤酒易感乳酸菌L.acetotolerans2011-8通過兩種方式誘導後，細菌總數雖誘導時間的延長變化不大，但可培養菌數卻發生顯著變化，當低溫儲藏至105天、啤酒內連續傳代18代時可培養菌數分別降至0 (如圖2a和圖2b所示);此時，通過螢光顯微鏡觀察仍然有很多的綠色活菌存在，活菌數均保持在104f/mL以上(如圖2a、2b和圖3a、3b 所示)。
[0039]4) VBNC狀態菌的復甦
[0040]a.首先製備過氧化氫酶液:準確稱取2mg過氧化氫酶(Sigma產品，2000~5000U/mg)溶解於ImL磷酸鹽緩衝液(50mM,pH7.0)中，充分混勻後,3000r/min離心5min取上清，隨後通過0.45 y m無菌濾膜過濾除菌，酶液現用現配以確保活力。[0041]b.隨後吸取 50 U LUO6 活菌數 /mL 的 VBNC 狀態 L.acetotolerans2011-8 加入到200 u L的上述過氧化氫酶溶液中，混勻並於25-28°C靜置2h後塗布於MRS平板上。同時以不添加過氧化氫酶的VBNC菌懸液作為對照。
[0042]結果如下:
[0043]由圖4可知，通過過氧化氫酶處理後的VBNC菌液塗布於MRS平板25_28°C培養14天後發現有單菌落長出，可培養菌數約為105cfu/mL，且對照組相同條件培養無菌落生長，表明添加過氧化氫酶可以使處於VBNC狀態的耐乙酸乳桿菌恢復至可培養狀態，使其得到復甦。
[0044]本發明的VBNC菌誘導和復甦方法均可推廣至其它啤酒易感乳酸菌研究上，對啤酒生產過程微生物監控以及進一步了解啤酒易感乳酸菌在啤酒釀造環境下生存機制的研究具有十分重要的意義。
[0045]以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，並非對本發明作任何形式上的限制，故凡是未脫離本發明技術方案內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬 於本發明技術方案的範圍內。
【權利要求】
1.一種VBNC狀態啤酒易感乳酸菌的誘導方法，其特徵在於:該誘導方法包括如下步驟: 1)原始菌株的培養 將啤酒易感乳酸菌採用MRS固體培養基進行純化復壯，挑取固體平板上較大的菌落接種於液體MRS培養基中培養； 2)採用低溫儲藏工藝進行VBNC狀態菌的誘導 取耐乙酸乳桿菌(Lactobacillus acetotolerans) 2011-8培養物放入冰箱內保存，並且每隔7天進行一次MRS平板計數，本試驗重複三次且設定正常培養下的L.acetotolerans2011-8為對照組,直至平板25_28°C厭氧培養14天無單菌落出現,此時可認為該菌不可培養，下同； 3)VBNC狀態菌的檢測，該檢測方法包括以下步驟: a)首先測定細菌總數 將新鮮培養的菌液進行10倍系列稀釋，取適當濃度的稀釋液加終濃度2%的甲醛固定，再取ImL固定後的稀釋液加吖啶橙溶液染色，再將黑色微孔濾膜置於無自發螢光的載玻片上，取適量樣品滴於濾膜上，待菌液略幹蓋上載玻片並壓緊，在載玻片上滴一滴無自發螢光的香柏油，用螢光顯微鏡於暗室中觀察並計數； b)採用試劑盒檢測細菌活性 取ImL計數平板上無單菌落存在的培養物於7000g離心5min，用無菌生理鹽水洗滌兩次，儘可能地除去細菌培 養液，以免培養基產生自發光而幹擾觀察結果；再加入50 y L的無菌蒸餾水重懸菌體沉澱，加入各25 y L的綠色染料和紅色染料，吹吸混勻後避光染色15-20min ;取適量樣品滴於無自發突光的載玻片上,蓋上載玻片，並在載玻片上滴I滴無自發螢光的香柏油，用螢光顯微鏡於暗室中觀察並計數。
2.根據權利要求1所述的VBNC狀態啤酒易感乳酸菌的誘導方法，其特徵在於:步驟I)中，所述培養是在25-28 °C厭氧條件下培養3-5天。
3.根據權利要求1所述的VBNC狀態啤酒易感乳酸菌的誘導方法，其特徵在於:步驟3)中，所述試劑盒由兩種專染核酸染料組成:一種是綠色螢光染料SYT0-9，能滲入完整細胞膜結構的菌體內；一種是紅色染料PI，僅能滲到細胞膜破損的菌體內，並且與SYT0-9競爭核酸著染位點。
4.一種VBNC狀態啤酒易感乳酸菌的誘導方法，其特徵在於:該誘導方法包括如下步驟: 1)原始菌株的培養 將啤酒易感乳酸菌採用MRS固體培養基進行純化復壯，挑取固體平板上較大的菌落接種於液體MRS培養基中培養； 2)採用啤酒內連續傳代工藝進行VBNC狀態菌的誘導 以步驟I)中的L.acetotolerans2011-8的培養物作為起始代(即0#)，取ImL的0#培養物接種於IOmL滅菌後的脫氣啤酒中，25-28°C厭氧培養6天至出現絮狀沉澱，即作為第I代(1#);再取ImL的1#培養物接種於IOmL滅菌後的脫氣啤酒中，於25_28°C厭氧培養6天，另外吸取0.1mL的1#培養物塗布於MRS固體平板上進行細菌計數，重複上述操作直至計數平板25-28°C厭氧培養14天無單菌落出現；3) VBNC狀態菌的檢測，該檢測方法包括以下步驟: a)首先測定細菌總數 將新鮮培養的菌液進行10倍系列稀釋，取適當濃度的稀釋液加終濃度2%的甲醛固定，再取ImL固定後的稀釋液加吖啶橙溶液染色，再將黑色微孔濾膜置於無自發螢光的載玻片上，取適量樣品滴於濾膜上，待菌液略幹蓋上載玻片並壓緊，在載玻片上滴一滴無自發螢光的香柏油，用螢光顯微鏡於暗室中觀察並計數； b)採用試劑盒檢測細菌活性 取ImL計數平板上無單菌落存在的培養物於7000g離心5min，用無菌生理鹽水洗滌兩次，儘可能地除去細菌培養液，以免培養基產生自發光而幹擾觀察結果；再加入50 μ L的無菌蒸餾水重懸菌體沉澱，加入各25 μ L的綠色染料和紅色染料，吹吸混勻後避光染色15-20min ;取適量樣品滴於無自發突光的載玻片上,蓋上載玻片，並在載玻片上滴I滴無自發螢光的香柏油，用螢光顯微鏡於暗室中觀察並計數。
5.根據權利要求4所述的VBNC狀態啤酒易感乳酸菌的誘導方法，其特徵在於:步驟I)中，所述培養是在25-28 °C厭氧條件下培養3-5天。
6.根據權利要求4所述的VBNC狀態啤酒易感乳酸菌的誘導方法，其特徵在於:步驟3)中，所述試劑盒由兩種專染核酸染料組成:一種是綠色螢光染料SYTO-9，能滲入完整細胞膜結構的菌體內；一種是紅色染料PI，僅能滲到細胞膜破損的菌體內，並且與SYTO-9競爭核酸著染位點。
7.權利要求1-6中任一項所述的一種能促進VBNC狀態啤酒易感乳酸菌復甦生長的方法，其特徵在於:將常規檢測培養 基上不生長的前培養菌種通過過氧化氫酶處理可獲得部分菌種恢復生長，該復甦生長方法包括以下步驟: 1)首先，準確稱取2mg過氧化氫酶(Sigma產品，2000~5000U/mg)溶解於ImL磷酸鹽緩衝液(50mM,pH7.0)中，充分混勻後,3000r/min離心5min取上清，隨後通過0.45 μ m無菌濾膜過濾除菌，酶液現用現配以確保活力； 2)隨後吸取50 μ LUO6 個 /mL 的 VBNC 狀態 L.acetotolerans2011_8 加入到 200 μ L 的上述過氧化氫酶溶液中，混勻並於25-28°C靜置2h後塗布於MRS平板上；同時以不添加過氧化氫酶的VBNC菌懸液作為對照。
【文檔編號】C12N1/20GK103525736SQ201310496576
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月21日 優先權日:2013年10月21日
【發明者】鄧陽, 李惠萍, 李琳, 房慧婧, 塗京霞, 陳江 申請人:廣州南沙珠江啤酒有限公司, 廣西珠江啤酒有限公司