能降解2,4–滴丁酯和敵敵畏的菌株及其製備修復菌劑的方法
2023-06-11 20:56:16 3
能降解2,4–滴丁酯和敵敵畏的菌株及其製備修復菌劑的方法
【專利摘要】本發明公開了一種能降解2,4–滴丁酯和敵敵畏的菌株及其製備修復菌劑的方法，所述菌株為革蘭氏陰性菌，顯微鏡下可見菌株菌體為短杆狀。透射電鏡下，具有極生鞭毛。在LB平板上培養菌落呈圓形、油滴狀、黃色、不透明，表面溼潤、粘稠，邊緣整齊。在短時間內對2,4-滴丁酯和敵敵畏降解率分別為99.82%和99.65%，該菌株為Pseudomonassp.LT1菌株，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC?No.7947。該菌株可用於上述農藥的生物降解，以及農藥汙染的土壤及農產品的生物修復和生物淨化。
【專利說明】能降解2, 4 -滴丁酯和敵敵畏的菌株及其製備修復菌劑的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於化學農藥生物降解【技術領域】,涉及一株土生細菌Pseudomonas sp.LTl菌株，及其對農藥2，4 -滴丁酯和敵敵畏的降解作用，可用於土壤農藥汙染的原位修復工程。
【背景技術】
[0002]農、獸藥是目前世界各國防治農作物病蟲害和養殖業病害的有效手段。大量化學農、獸藥，特別是高毒、高殘留農獸藥的使用，成為食品安全和危害人們健康的主要「殺手」。
[0003]目前，主要使用的化學農藥按其功能不同，主要分為殺蟲劑(Insecticide)、除草劑(Herbicide)和殺菌劑(Fungicide)三大類。依據化學結構不同，可分為有機氯類、有機磷類、擬除蟲菊脂類、氨基甲酸脂類和無機農藥等多種類型。這些化學農藥的共同特點是:①有毒性，且靶向性差殘留性，一般分為高殘留、中殘留和低殘留等；③遷移性和累積性，可通過空氣、土壤或地下水發生遷移，甚至在生物體內累積。有機磷類殺蟲劑成為目前使用量最大的農藥之一，多屬於高效農藥。目前，有機磷農藥包括甲拌磷、乙拌磷、內吸磷、對硫磷、甲胺磷、乙醯甲胺磷、殺螟硫磷、特普、敵百蟲、樂果、馬拉硫磷、甲基對硫磷、二甲硫吸磷、敵敵畏、甲基內吸磷、氧化樂果、久效磷等。有機氯農藥有滴滴涕、六六六、林丹、甲氧、高殘毒DDT、 硫丹。常用的擬除蟲菊脂類農藥有溴氰菊脂、氯氰菊脂、氯菊脂、胺菊月旨、甲醚菊脂等。氨基甲酸酯類有西維因、葉蟬散、涕滅威、呋喃丹和異索威等。
[0004]在我國的農藥品種結構中，具有高毒和「三致性」的殺蟲劑佔全部農藥的40%以上，我國農藥劇毒、高毒農藥品種居多，存在著「3個70%」，即:農藥中殺蟲劑佔70% ;殺蟲劑中有機憐類品種佔70% ;有機憐類中少數幾個聞毒品種佔70%。
[0005]目前，世界上有機憐農藥(Organophosphorus pesticides, OPs)的種類已達150多種，成為使用量最大的農藥之一，我國生產的有機磷農藥的品種就有20餘種，年產量超過IOOkt,佔我國農藥總產量的80%以上。
[0006]據統計，我國施用農藥面積在218億hm2以上，每年用量50~60萬噸。這些施用的農藥，有50%~60%殘留於土壤。目前，我國約有87~107萬hm2的農田土壤受到有機磷農藥嚴重汙染，危害也越來越大。主要表現為:
[0007]一是有機磷農藥在殺死靶標生物的同時，也或多或少地殺死非靶標生物，對周圍環境乃至整個生態環境造成嚴重的破壞。
[0008]二是土壤中有機磷的成分含量過高，通過糧食、蔬菜、水果等間接影響人體和動物的健康。有機磷農藥對人體的危害不僅表現在幹擾人體化學信息的傳遞，破壞身體的酶，而且它阻礙器官發揮正常的生理功能，導致神經系統功能失調。癌症、不孕症、內分泌紊亂等疾病均與有機磷農藥汙染有關。
[0009]三是有機磷農藥對土壤微生物數量、種群結構和生物活性產生嚴重影響，造成土壤生產力下降。土壤微生物是調節土壤肥力的重要因素。高毒性有機磷農藥的不斷使用，破壞了土壤微生物的繁殖，使敏感性的菌種受到抑制，土壤微生物的多樣性遭到破壞，種群趨於單一化，引起原有的平衡紊亂功能失調從而影響土壤物質和能量的循環，影響土壤微生物的氨化硝化和呼吸作用等，由此破壞了土壤結構和理化性質，土地肥力持續下降。
[0010]為治理有機磷農藥對生態環境的危害，各國的研究人員做了大量的農藥降解方法研究，建立了生物降解、化學降解、光化學降解、超聲波、洗滌劑和電離輻射等。而土壤中有機磷農藥汙染的治理主要是通過微生物降解有機磷農藥。從上個世紀60年代開始，在汙染物降解菌的分離、汙染土壤微生物多樣性以及微生物中汙染物降解基因的克隆等方面均有一定的研究。到目前為止，已分離到多種降解有機磷農藥微生物，包括細菌、放線菌、真菌及藻類，其中細菌和真菌最多，細菌研究的較為透徹。細菌中優勢菌主要為假單胞菌、芽胞桿菌、產鹼桿菌、無色桿菌、黃桿菌等，真菌主要是黴菌。有的微生物專一降解某種農藥，表現出降解惰性，如節桿菌和氣桿菌等。有的能同時降解多種農藥，比較典型的有假單胞菌和芽胞桿菌等，可降解同類農藥的多種品種或不同類型農藥品種。有的不直接降解農藥，而是通過共代謝完成降解過程。許多研究 者從自然土壤和環境中分離或篩選了大量的農藥降解菌，如從長期使用毒死蜱的土壤中分離了一株可降解毒死蜱的真菌麴黴和一株可降解毒死蜱和甲胺磷的真菌木黴；通過富集培養和亞硝基肌誘變處理得到一株降解甲胺磷活性較高的華麗麴黴，它同時能降解樂果和對硫磷等有機磷農藥；分離得到一株能以甲胺磷為唯一碳源、氮源和能源生長的麴黴M-2;從農藥廠汙泥中分離得到一株具有較高降解氧樂果活性的黑麴黴；從汙泥中分離得到一株可降解樂果的不動菌屬菌株，它以共代謝方式降解樂果，還能降解敵敵畏和對硫磷等農藥；還分離得到一株能降解甲胺磷、敵敵畏和對硫磷的地衣芽抱桿菌。這些研究大大豐富了有機磷農藥降解菌陣營。但是，據《國際微生物學會聯盟通訊》有關專家估計，全球約有50萬~60萬種微生物，而今已被研究和記載的還不到5%，在如此豐富的微生物資源庫中，由於自然環境及其它理化條件的差異，尤其是長期受農藥脅迫的環境中，仍有很多能降解農藥的微生物未被發現，現在分離到的還只是滄海一粟。因此，降解農藥的微生物還需進一步的發現和研究。
[0011]研究發現新的農藥降解菌，可豐富降解農藥微生物的種類，為土壤生物修復技術的研究和應用提供依據，為構建有機磷降解高效工程菌提供新的資源，推進生物修復工程的發展，造福人類具有重要意義。
【發明內容】
[0012]本發明從土壤樣本中分離篩選得到一株對2，4 -滴丁酯和敵敵畏具有高效降解能力的細菌菌株；本發明提供該菌株的鑑定特徵和16S rDNA序列、菌株的分離篩選、菌株的生理生化特徵、菌株對2，4-滴丁酯和敵敵畏的降解作用。本發明在發現和確定該菌株對2，4 -滴丁酯和敵敵畏具有高效降解特性的基礎上，還提供應用該菌株降解土壤中2，4 -滴丁酯和敵敵畏菌劑發酵的方法。
[0013]本發明的技術方案概述如下:
[0014]能降解2，4-滴丁酯和敵敵畏的菌株，該菌株為革蘭氏陰的假單胞菌屬，命名為Pseudomonas sp.LTl菌株，於2013年7月22日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編 100101 ;保藏號為 CGMCC N0.7947。
[0015]所述的能降解2，4 -滴丁酯和敵敵畏的菌株，該菌株16S rDNA序列為SEQ ID N0.1所示。
[0016]所述的能降解2，4 -滴丁酯和敵敵畏的菌株製備修復菌劑的方法，步驟如下:
[0017]步驟一,將Pseudomonas sp.LTl菌株接種於LB培養基中，振蕩培養至對數期；
[0018]步驟二，將步驟一培養好的種子液按照體積比為10%接種於種子罐的培養基中，通入無菌空氣，振蕩培養至對數期；
[0019]步驟三，將步驟二培養後的種子液以體積比10%接種入生產罐發酵培養至菌體數量達到8億個/ml以上。
[0020]所述的能降解2，4 -滴丁酯和敵敵畏的菌株製備修復菌劑的方法，步驟一中振蕩培養條件可以為30°C，100轉/小時。
[0021]所述的能降解2，4 -滴丁酯和敵敵畏的菌株製備修復菌劑的方法，步驟二中振蕩培養條件可以為30°C，180轉/分鐘。
[0022]所述的能降解2，4 -滴丁酯和敵敵畏的菌株製備修復菌劑的方法，步驟二中無菌空氣的通入量可以為0.55-0.65m3/分鐘。
[0023]所述能降解2，4-滴丁酯和敵敵畏的菌株製備修復菌劑的方法，步驟二中的培養基組分以及含量可以如 下:可溶性澱粉3%，KNO30.1%, NaCl0.05%, K2HPO40.05%,MgSO40.05%和FeSO40.001% ;以上均為質量比。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1為菌株Pseudomonas sp.LTl的透射電鏡照片(Iym)；
[0025]圖2為菌株Pseudomonas sp.LTl的透射電鏡照片(0.2 μ m)；
[0026]圖3 為菌株 Pseudomonas sp.LTl 菌落形態；
[0027]圖4為2，4-滴丁酯為唯一碳源的固體培養基形成的水解圈(濃度為300mg/L)；
[0028]圖5為敵敵畏為唯一碳源的固體培養基形成的水解圈(濃度為300mg/L)；
[0029]圖6為菌株Pseudomonas sp.LTl的系統發育地位分析。
【具體實施方式】
[0030]下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規方法。
[0031]下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。
[0032]實施例1:菌株分離與純化
[0033]菌株Pseudomonas sp.LTl從甘肅省張掖市大弓農藥廠汙水處理池的活性汙泥中分離得到，具體馴化、篩選、分離步驟為:取50g汙泥，置於裝有IOOmL培養基A的500mL三角瓶中，先後加入100mg/L敵敵畏和相同量2，4-滴丁酯，30°C，100r/min,振蕩培養14d。取上層濁液10mL，置於含有40mL培養基A的250mL三角瓶中，加入300mg/L敵敵畏和相同量2，4-滴丁酯，300C，100r/min,振蕩培養14d。再取上層濁液10mL，同法培養3次，在這3次中，敵敵畏和2，4-滴丁酯逐級分別提高到500mg/L、800mg/L、1200mg/L。分別取ImL菌液於滅菌的平皿中，加入15mL含300mg/L的敵敵畏和2，4-滴丁酯，再加入冷卻至451:左右的培養基B，300C，培養3d。挑取有透明降解圈的單菌落，在同樣的培養基上純化3次，得到純化菌株。
[0034]所述的各培養基的組分及配比為:
[0035]培養基A(g.L-1) =NH4NO30.5，Na2HPO4L 19，KH2PO40.45，MgSO40.5，去離子水 1000ml，ρΗ6.8ο
[0036]培養基B (g.L—1):在培養基A中加20g瓊脂。
[0037]富集培養基:即LB液體培養基，胰蛋白腖10g，酵母提取物5g，NaCllOg，搖動容器直至溶質溶解。用5mol/L的NaOH調pH至7.0。
[0038]該菌株為革蘭氏陰性菌，顯微鏡下可見菌株菌體為短杆狀。透射電鏡下，具有極生鞭毛(圖1和圖2)。在LB平板上培養24h後菌落形態呈圓形、油滴狀、黃色、不透明，表面溼潤、粘稠，邊緣整齊(圖3)。
[0039]該菌株在以2，4-滴丁酯(濃度為300mg/L)為唯一碳源的固體培養基平板上培養48h後形成的水解圈示意圖(圖4),在以敵敵畏(濃度為300mg/L)為唯一碳源的固體培養基平板上培養48h後形成的水解圈示意圖(圖5)。
[0040]該菌株的理化特徵為葡萄糖發酵液體培養基變成了黃色，能夠利用葡萄糖，產生有機酸，但是不產生氣體；不能產生澱粉酶水解澱粉，為陰性反應。V.P試驗中培養基兩天內不顯現紅色，不能產生乙醯甲基甲醇，為陰性反應；甲基紅試驗中，培養基呈黃色，在糖代謝過程中不能產生丙酮酸，為陰性反應；吲哚試驗中，沒有吲哚存在，乙醚層沒有玫瑰紅色環狀物生成，不能分解蛋白腖中的色氨酸形成吲哚，此為陰性反應；石蕊牛乳試驗，培養48h後，培養基呈現粉色，能夠發酵乳糖產酸。氧化酶試驗，加鹽酸二甲基對苯二銨溶液，呈現粉紅色，並逐漸加深，能夠產生氧化酶；接觸酶試驗，滴加I滴3%的過氧化氫後，有氣泡產生，具有接觸酶活性，能夠產生接觸酶，為陽性反應；硝酸鹽還原試驗，能使硝酸鹽還原為氮氣。其生理生化特徵見表1。
[0041]表1菌株為Pseudomonas sp.LTl的生理生化特徵
[0042]
【權利要求】
1.能降解2，4-滴丁酯和敵敵畏的菌株，其特徵在於，該菌株為革蘭氏陰的假單胞菌屬，命名為 Pseudomonas sp.LTl 菌株，保藏號為 CGMCC N0.7947。
2.根據權利要求1所述的能降解2，4-滴丁酯和敵敵畏的菌株，其特徵在於，該菌株16S rDNA 序列為 SEQ ID N0.1 所示。
3.權利要求1所述的能降解2，4-滴丁酯和敵敵畏的菌株製備修復菌劑的方法，其特徵在於，步驟如下: 步驟一,將sp.LTl菌株接種於LB培養基中,振蕩培養至對數期； 步驟二，將步驟一培養好的種子液按照體積比為10%接種於種子罐的培養基中，通入無菌空氣，振蕩培養至對數期； 步驟三，將步驟二培養後的種子液以體積比10%接種入生產罐發酵培養至菌體數量達到 8億個/ml以上。
4.根據權利要求3所述的能降解2，4-滴丁酯和敵敵畏的菌株製備修復菌劑的方法，其特徵在於，步驟一中振蕩培養條件為30°C，100轉/小時。
5.根據權利要求3所述的能降解2，4-滴丁酯和敵敵畏的菌株製備修復菌劑的方法，其特徵在於，步驟二中振蕩培養條件為30°C，180轉/分鐘。
6.根據權利要求3所述的能降解2，4-滴丁酯和敵敵畏的菌株製備修復菌劑的方法，其特徵在於，步驟二中無菌空氣的通入量為0.55-0.65m3/分鐘。
7.根據權利要求3所述能降解2，4-滴丁酯和敵敵畏的菌株製備修復菌劑的方法，其特徵在於，步驟二中的培養基組分以及含量如下:可溶性澱粉3 %，KNO3 0.1 %，NaCl 0.05%,K2HPO4 0.05%, MgSO4 0.05% 和 FeSO4 0.001% ；以上均為質量比。
【文檔編號】C12R1/38GK104004689SQ201410256536
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月10日 優先權日:2014年6月10日
【發明者】李同祥, 孫會剛, 黃天姿, 候進慧, 王陶, 懂玉瑋, 高兆建, 劉全德, 王慶芝 申請人:徐州工程學院