能提供植物對病毒抗性的多核酶和產生這種多核酶的抗性植物的製作方法

2023-06-11 15:27:06 2

專利名稱：能提供植物對病毒抗性的多核酶和產生這種多核酶的抗性植物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種稱為「多核酶」(「Polyribozyme」)能夠為植物提供對病毒抗性的核苷酸序列，以及使植物具有抗性的方法。本發明還涉及表達多核酶的植物。
現已發展了幾種為栽培植物提供對病毒抗性的途徑，即向植物病毒核酸序列基因組中整合入衣殼蛋白基團、非結構蛋白基因、反義病毒RNA序列和衛星病毒RNA(見，例如，Cuozzo等，1988，Bio/Technology6,549－557；Rezaian等，1988，Plant，Mol.Biol.11,463－471；Harrison等，1987，Nature 328,797－802)。
這些出版物報導了部分抗性或耐性的產生。但是，多數情況下只是延緩症狀或減輕症狀，而無完全抗性。
還有，這些方法中的一些－例如使用衛星病毒RNA的方法－可能引起新的問題。例如，在一種植物中減輕症狀的衛星病毒可能對另一種植物就是致命的。況且，引入植物中的衛星病毒核苷酸序列中的突變可能增加感染的嚴重性而不是減小它。
與此相似，使用衣殼蛋白提供抗性也有缺點。例如，某病毒的某一特殊毒株的衣殼蛋白不一定保護植物抵抗此病毒另一毒株的感染。用不同病毒間或不同毒株間的衣殼蛋白胺基酸的同源性程度難以預測該蛋白表達所提供的耐性程度。再者，通過衣殼蛋白的表達抗病毒感染保護植物，帶來誘導植物中表達的衣殼蛋白與感染轉基因植物其它病毒之間的異體衣殼化的危險。雖然這還沒有在轉基因植物因植物中得到證實，但這已在兩株BYDV間和ZYMY和PRSV間觀察到。
使用核酶(ribozyme)也被認為可提供植物對病毒的抗性。核是一些象酶一樣能特異性催化靶RNA裂解的RNA分子。在專利申請EP－A－321021中描述了用核酶在植物細胞中的第一批實驗。從那以後，幾位作者曾試圖優化核酶的結構和操作條件，以有效地裂解病毒RNA。
例如，Lamb和Hay(J.Gen，Virol.1990，712257－2264)已證實單核酶在體外對馬鈴薯卷葉病毒的RNA聚合酶及衣殼蛋的基因的編碼區RNA有裂解作用。但是，此體外裂解反應僅在40℃發生；迄今還不可能在0℃觀察到任何反應。根據不同的種類，植物一般在10到30℃間載培。而在體內使用時，Lamb和Hay建議要增加互補臂的長度。但如果臂太長，在靶RNA與核酶之間可產生穩定的雙螺旋，阻礙核糖酶的解離，使其不能催化另一裂解反應。再者，根據互補臂的長度和序列，核酶本身可形成二極結構，這減小了其裂解活性。
Edington和Nelson(「Gene Regulation；Biology ofAntisense RNA and DNAERICKSON和IZANT編輯，RavenPress Ltd，New－York，1992)已描述了在體外和體內使用單核酶滅活菸草花葉病毒(TMV)的聚合酶基因。他們觀察到根據體外還是體內使用，核酶表現非常不同的行為。因此核酶的體外活性不能用於預測同一核酶的體內活性。例如，體外裂解看來效力低，需要高於TMV基因組RNA濃度20倍的核酶濃度。另一方面，使用TMV感染的菸草原生質體的體內實驗中，核酶抑制病毒RNA增殖的90％。令人感興趣的是，注意到用作對照的反義RNA僅抑制病毒增殖的20％。這些作者還參考了Gerlach等的研究，後者使用了定向於TMV的聚合酶基因的多核酶。這種多核酶在體外不起作用，因為其長度使核酶與靶RNA間形成雙螺旋。而在體內，該多核酶可以裂解底物。表達單核酶或多核酶的轉基因菸草植物已顯示在用TMV感染後可延緩症狀但未提及完全抗性，即最終不存在症狀。作者得出結論說，必須通過實驗確定諸如互補臂的最佳長度、靶序列的選擇和啟動子的選擇這些參數，以使解決核酶的「compartment－alisation」問題成為可能。
EP－A－0421376描述了針對CMV的非編碼RNA的核酶。WO－A－9213090描述了通過用「第I類內含子」型的單核酶在序列中引入外源序列來滅活CMV衣殼蛋白的RNA。這些文件都沒有提到產生對CMV的完全抗性。
本發明提出要解決的技術問題是提供一種可使植物對病毒具有抗性而無所述缺點的可靠物質。
本發明者已通過針對病毒衣殼蛋白的多核酶的概念和應用解決了這一問題。這種多核酶能夠滅活編碼所述蛋白的基因，從而提供對病毒的完全抗性。
考慮到現有技術中使用衣殼蛋白基因的反義序列所得平凡結果，本發明的多核酶的效力是令的驚異的，因為這些方法都涉及相應RNA的滅活。另外，幾位作者還曾反對使用反式作用多核酶，因為此核酶不能相互獨立地起作用，還因為具有相同序列的催化區有時趨於相互雜交，這樣形成非活性結構(見，例如，Taira，Workshop」RNA－Editing－Plant Mitochondria」，AbstractBook，Berlin，September15－20，1992)。鑑於所選擇的靶標是衣殼蛋白和用於滅活此靶標的方法是多核酶，本發明所得結果是出人意外的。
除滅活的效力外，與已知方法相比，本發明的多核酶具有幾個優點－核酶的酶功能特異性地催化幾種病毒RNA的裂解而無結構修飾。這種酶切導致用於衣殼蛋白表達的病毒RNA全部破壞，它作為病毒增殖抑制劑抑制了病毒的感染功能。
－此核酶是一種非編碼RNA分子，它不能誘導異體衣殼化或產生新的病毒株。
－鑑於衣殼蛋白誘導的耐受性的特異性難於預測，如果互補臂相當於不同病毒株或不同相關病毒間保守的同源區，可以構建核酶使其特異性地裂解一種或多種病毒株，或數種相關病毒。
為了徹底理解本發明，將關於核酶的概括特徵具體化將是有用的。核酶是一種RNA分子，鑑於其序列和二級結構，它具有核糖核酸酶活性，它這使得它與第二個互補RNA分子雜交時可以裂解該第二種RNA。因此，後者稱為核酶的「底物」。
核酶具有兩個必需部分(i)以下將稱為「互補序列」的序列，選擇這種序列以使其與要裂解的底物互補，使這兩種分子雜交；和
(ii)催化區，它具有與所選底物無關不參與與底物的雜交的序列，構成其「環」形二級結構。
一般，催化區位於互補序列之內，這樣，一部分互補序列位於催化區的5』端，另一部分位於其3』端。在催化區每一側的這些具有互補序列的片斷常稱為「雜交臂」。
本發明的目的是一種多核酶。更具體地講，它是一種稱為「多核酶」的核酸序列，它具有核糖核酸內切酶活性，能夠使病毒衣殼蛋白的基因滅活，其特徵在於它包括i)與該基因或其轉錄本或其複製中間體的至少一部分互補的序列，在此互補序列中的不同位點包括ii)多重核酶催化區，和iii)任選的一種或多種不與所述基因的轉錄本互補的序列，所述非互補序列插入在互補序列的2個連續鹼基間。
本發明說明書中，術語「多核酶」指由一系列核酶從頭到尾構建而成的RNA分子，因此核酶是多核酶的主要單元。換句話說，它是通過雜交臂連結起來的一系列催化區，這些臂的總長構成了互補序列。多核酶一般作為對單一轉錄本的「單一分子」，而每個催化區的裂解位點位於同一轉錄本上衣殼蛋白質。本發明的多核酶還可包括除上述的2個必需部分〔(i)互補序列和(ii)催化區〕以外的，一種或多種對底物的非互補序列(iii)。下列將詳細描述這些非互補序列的性質和功能。
多核酶的兩個必需部分中，互補序列定決定底物的序列。對本發明來講，它是與病毒衣殼蛋白基因互補的序列，或與該基因的片斷互補的序列。當病毒是RNA(+)病毒時，其基因直接作為mRNA，互補序列與此基因真正互補。在另一情況下，它是與基因的轉錄本互補。它還可以與一複製中間體互補。
互補序列可與衣殼基因的全長雜交。此時互補序列的總長為所研究的衣殼蛋白基因長度的函數而變化。另一方面，互補序列可以僅與基因的片斷雜交。所述片斷必須足夠長以能在相應的多核酶序列中包括至少兩個催化區。總體來講，催化區不計在內，互補序列的長度(即雜交臂之和)可在約40－2000個鹼基間變化。優選400－1000鹼基的長度，許多病毒的衣殼蛋白基因有的1000個鹼基(如CMV，PLRV)。
本發明說明書中，術語「互補」指多核酶與此底物間具有足夠高的互補性使得能夠穩定地雜交，並有效地裂解底物。當多核酶不含有(iii)型序列(即「非互補」序列)時，互補度通常為100％。在序列中存在一定數量的失配是充許的，只要它不妨礙雜交和底物的裂解。
多核酶的第(ii)部分(即催化區)可來自任何類型適宜的核酶，例如「榔頭」型、「髮夾」型或「第I類內含子」型。同一種多核酶可含有來自不同類型核酶的催化區，例如「榔頭」型和「髮夾」型。催化區優選來自「榔頭」型核酶，

圖1A、B、C和D中表明了其序列結構。專利申請EP－A－321021和WO－A－9119789中詳細描述了這些核酶。
雖然圖1中所示催化區具有保守序列，但已觀察到某些核苷酸可以被缺失、插入、取代或修飾而不影響核酶的活性。本發明包括在多核酶中使用這些修飾的催化區，只要保留其催化活性即可。用下面描述的實驗可以驗證此活性。
例如，圖1A中所示催化區II的一個或多個核苷酸可被含有諸如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、甲基胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、肌苷或其它甲基化鹼基的核苷酸所置換。「保守」鹼基C－G一起形成催化環的第一個鹼基對，它可以用U－A代替(Koizumi等，FEBS Letts、228,2,228－230，1988)。
圖1中所示催化區的核苷酸還可以被化學修飾。核苷酸由鹼基、糖和單磷酸酯基因組成。這些基因每個都可以被修飾。在「Principles of Nucleic Acid Structure」(Ed.Wolfram Sanger，Springer Verlay，New York，1984)中描述了這種修飾。例如，鹼基可帶有取代基如滷原子、羥基、氨基、烷基、疊氮基、硝基、苯基等。也可以對核苷酸的糖部分進行修飾，用滷原子、氨基或疊氮基取代仲羥基，甚至進行2』甲基化。
核苷酸的磷酸酯基團可用N，S或C代替氧原子進行修飾，分別形成氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和膦酸酯。這些物質可能表現有用的藥代動力學性能。
催化區的鹼基和/或核苷酸還可帶有諸如胺基酸的取代基，例如，酪氨酸或組氨酸。
還觀察到可以在催化區的某些位點插入外加的核苷酸，而不影響核酶的活性。例如，選自A、G、C或U的外加鹼基可以插在圖1A或1B中的1A之後。
根據本發明的一種方案，核酶可含有諸如圖1D中所示的一個或多個結構作為催化區。該結構稱為「微小酶」，在國際專利申請WO－A－919789中有述。它代表一個「榔頭」型的催化區，其「環」已用「P」代替。P可以是G和1A間的共價連結，一個或多個核苷酸(RNA或DNA，或混合物，或甚至為上述的衍生物)或除核苷酸以外的不影響催化活性的任何原子或原子集團。當P代表多個核苷酸時，它可含有多個內部鹼基配。構成基團「P」的序列和核苷酸數目不是關鍵之處，可在1－20個核苷酸內變化，例如優選1－6個。最好選擇沒有Watson－Crick型的內部鹼基配對的序列。
通過將多核酶，或轉錄後產生多核酶的序列與底物接觸，然後證明裂解的發生，這樣可在體外證實本發明多核酶的催化活性。體外裂解反應的實驗條件如下溫度在4－60℃之間，優選20－55℃之間，PH在約7.0到9.0之間，存在二價金屬如Mg2+，濃度為1－100mM(優選1－20mM)。多核酶的量一般與底物等摩爾比，或過量。體外裂解反應最好按照Hamb和Hay描述的方法進行(J.Gen.Virol.，1990，71，2251－2264)。這篇文章中描述了從插入質粒的寡脫氧核糖核苷酸體外轉錄產生核酶的適當條件。
體內裂解條件是細胞中天然存在的條件。
「榔頭」型核酶從「靶」點XXX(優選XUX)的緊下遊裂解底物，其中X代表4個鹼基A、C、G、U中的一種，U代表尿嘧啶。一種特別優選的靶序列是XUY，其中Y代表A、C或U，X常為G，例如GUC。其它可能的但效力較差的靶點，例如是CAC、UAC和AAC。對於「髮夾」型核酶，優選的靶序列是AGUC。
這些靶序列在多核酶的構建和功能化中很重要，這不但是因為它們指示底物的裂解位置，而且因為它們定義了必須在互補序列中插入催化區的位置。實際上，多核酶的每個催化區必須位於互補序列中相當於轉錄本中XUX位點的位置。例如，如果一個XUX位點位於衣殼蛋白基因的108位，另一個在205位，則催化區一個插入在互補序列中相應的108位，另一個插入在205位。
XUX單元是RNA序列中存在的高頻單元。例如，在鹼基隨機等同分布的序列中，平均每64個鹼其中有一個GUC單元。這表明底物通常含有多個XUX裂解位點。如上所述，多核酶的催化區位於互補序列中相應於XUX位點的位置。但是根據本發明，為達到有效裂解，不必包括相應於底物的每個XUX靶序列的催化區。根據本發明，當多核酶含有至少2個催化區時，可達到有效裂解。互補序列中包含的催化區的總數等於或小於基因中存在的XUX總數。因此本發明的多核酶所含催化區的數目變化很大。例如，對CMV，當靶序列為GUC時，多核酶可含有的2個到的11或12個催化區。當決定在互補序列中包含數目少於底物中XUX位點數的催化區時，根據下列標準選擇位點a)2個XUX靶點間的距離，相應的多核酶中2個催化區間的距離必須足夠長，使得位於相應催化區之間的多核酶的雜交臂能與底物穩定雜交，並防止催化區與其自身雜交。至少8個鹼基，優選至少14個鹼基，例如約20個鹼基的距離是特別有利的。當然，只有當底物所含XUX位點非常靠近時才考慮這一標準。否則，如果底物的XUX位點間相互以大於8－20個鹼基分隔，該標準就不重要。
b)XUX靶點優選位於衣殼蛋白基因的沒有明顯二級結構的部分。這有助於多核酶與底物接近，並增加其效力。
c)XUX位點可形成同一病毒的不同株或不同的相關病毒所保守的同源性區域的一部分。根據這一標準構建的多核酶可特異性地裂解數個病毒株或數個相關病毒。例如，與相關病毒BWYV和BYDV的衣殼蛋白序列相比，PLRV的衣殼蛋白基因的中央區域是高度保守的。此中央區域內的XUX位點，特別是GUX，因此構成本發明的一種多核酶的優選位點。
另外，作為實例，在毒株I17F、FNY、M、I、O、Y、D和C之間，CMV衣殼蛋白質序列的5』末端(100多個鹼基長)是高度保守的。在該保守序列內的位置84處，所有這些毒株均有一保守的GUC位點。
根據本發明的這一方案，能使數個CMV毒株滅活的多核酶在催化區域中含有一個催化區，位於互補序列相當於位置84的位點(參見下文實驗例)。
d)XUX靶點的另一選擇標準是與被轉化植物的內源基因沒有同源性。事實上，儘管很少，但有些病毒擁有在植物基因組中能找到同源序列的序列。因此，避免XUX位點位於這種序列內是很重要的。
根據本發明一種特別優選的實施方案，除上述的2個必需部分(i)和(ii)外，多核酶還可含有第三個組分(iii)，即一個或多個與病毒衣殼蛋白基因不互補的序列。象催化區一樣，這些非互補序列被插入到互補區的不同位點，互補性因插入而被中斷。令人驚奇地是，本發明人觀察到在多核酶雜交臂內存在所述非互補序列並不妨礙多核酶與底物的雜交，而且在某些情況下，甚至可提高裂解反應的效率。
將這些非互補序列插入在互補序列的兩個連續的鹼其之間，從而非互補序列與互補序列形成一個共線性插入。在這種情況下，多核酶具有結構((雜交臂－催化區－雜交臂)－(非互補序列)n)p其中n＝0或1，p＞1。
作為本發明這一實施方案的一個實例，可提及由核酶序例、與底物的不同片段(連續的和鄰接的)互補並且由非互補序列連在一起的雜交臂組成的多核酶。換句話中，在所述結構中，雜交臂的聚集重新組成了與衣殼蛋白基因互補的序列。
在多核酶中非互補序列的存在表明，多核酶兩個催化區之間的距離大於底物中兩個相應GUC位點間的距離。根據本發明的這種方案，位於催化區每一側的雜交臂的長度必須至少是4個鹼基，而且優選的是每一側至少8個鹼基，並可多達800到1000個鹼基。
非互補序列的特性可隨其功能的不同而異。可以是具有「填充」功能的序列，即在底物相應的兩個XUX位點彼此非常近時，可以增大多核酶兩個催化區之間的距離。用這種方式，可以避免在兩個相鄰的催化區之間形成失活的雙螺旋。也可以用作非互補序列使用具有確定的二級結構的序列，其可具有防止可觀長度的多核酶，如有800多鹼基的多核酶在無活性的二級結構中自身再摺疊。作為這種結構類型的一個實例，可提及通過缺失一個或多個必需的鹼基而使其失活的核酶。由下文實施例中描述的多核酶136舉例說明了本發明實施方案的這種模式。
多核酶的非互補序列也可具有明確的功能，例如，它可以由用於篩選轉化株的編碼序列或者含有作用於衣殼蛋白以外之底物或者順式作用於多核酶某部分之核酶的序列構成。總而言之，非互補序列並不編碼蛋白質。它也可含有多克隆位點。非互補序列的長度通常在2到500個鹼基之間，如20到100個鹼基。當存在多個互補序列時，它們可共同構成核酶長度的高達約90％，例如50％。
本發明的多核酶通常由RNA組成。然而，可以由DNA取代多核酶的某些部分，如雜交臂或這些臂的部分，或者催化區的部分，特別是「環」，條件是保持催化活性(參見，如國際專利申請WO－9119789中描述的DNA取代RNA)。
可以構建本發明的多核酶以使任何病毒衣殼蛋白失活。衣殼蛋白是蛋白質亞單位，由病毒基因組編碼，構成多聚衣殼。所述衣殼由這些相同的蛋白質亞單位沿核酸一個接一個排列組成。衣殼亞單位的空間排列，根據病毒不同，要麼產生螺旋要麼是二十角結構。本發明涉及針對具有螺旋顆粒或二十角顆粒的病毒以及具有被膜之病毒衣殼蛋白的多核酶。所述被膜是位於核蛋白衣殼外周的脂蛋白膜。
作為適宜病毒的實例，可從下列各類中選擇花椰菜花葉病毒組，如花椰菜花葉病毒(CaMV)；雙聯病毒組，如EcoRI米線條病毒(MSV)；呼腸孤病毒科，如傷瘤病毒(WTV)；彈狀病毒科，如馬鈴薯黃矮病毒(PYDV)；蕃茄斑萎病毒(TSWV)；菸草花葉病毒組，如菸草花葉病毒(TMV)；馬鈴薯X病毒組，如馬鈴薯X病毒(PVX)；馬鈴薯Y病毒組，如馬鈴薯Y病毒(PVY)；荷蘭石竹隱潛病毒組，如荷蘭石竹隱潛病毒(CLV)；黃化病毒組，如甜菜黃化病毒(BYV)；菸草脆裂病毒組，如菸草脆裂病毒(TRV)；大麥病毒組，如大麥條斑花葉病毒；蕪菁病毒組，如蕪菁黃花葉病毒(TYMV)；黃症病毒組，如大麥黃矮病毒(BYDV)或馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)；蕃茄叢矮病毒組，如蕃茄叢矮病毒(TBSV)；南方菜豆花葉病毒，如南豆花葉病毒(SBMV)；菸草壞死病毒(TNV)；蠕傳多面體病毒組，如菸草環斑病毒(TRSV)；豇豆花葉病毒組，如豇豆花葉病毒(CPMV)；豌豆耳突花葉病毒(PEMV)；黃瓜花葉病毒組，如黃瓜花葉病毒(CMV)；雀麥花葉病毒組，如雀麥花葉病毒(BMV)；等軸不穩定環斑病毒組，如菸草線條病毒(TSV)，這些蛋白質的序列是已知的(如參見，在專著「Elements de VirologieVégétale」，Pierre Cornuet，.I.N.R.A.Paris，1987，ISBN2－85340－808－6中引述的大量文獻)。
根據一種特別優選的方案，衣殼蛋白是黃瓜花葉病毒(CMV)的衣殼蛋白質。由於CMV可以感染750種以上的植物，因此屬於黃瓜花葉病毒組的黃瓜花葉病毒有很大的農學重要性。CMV是一種多組分病毒，由含三個基因組RNA(RNA1－3)和一個亞基基組RNA(RNA4)的二十面體顆粒組成，RNA3含有一個拷貝的衣殼蛋白質基因；但得自RNA3的亞基因組RNA4用作合成衣殼蛋白質的基體。將不同的CMV株分成兩類含毒株C、D、FNY、Y、I17F和Chi的亞組I；毒株Q和WL所屬的亞組II。
比較屬於相同亞組的CMV毒株衣殼蛋白質的胺基酸序列表明有95％的同源性。亞組I和II之間的序列同源性較低，為80％左右。
已經發現抗CMV(毒株I17F)衣殼蛋白的本發明多核酶對於滅活不同CMV毒株是極為有效的，而且被轉化植物得到完全抗性。
除多核酶外，本發明還涉及生產抗病毒植物的方法，特徵在於將多核酶或如上述的編碼多核酶的序列導入植物。
通常，經遺傳轉化，由此將編碼多核酶的DNA序列穩定整合到植物其因組中，從而將多核酶導入植物。
可以使用所有將外源DNA導入植物的導入植物的方法，如土壤桿菌、電穿孔、厚生質體融合、用顆粒槍轟擊、或DNA滲入細胞如花粉、微孢子、種子和不成熟胚胎中，病毒載體如雙聯病毒或者衛星病毒。根瘤土壤桿菌和根毛土壤桿菌構成優選的工具。在這種情況下，將編碼多核酶的序列連同所有必需的調節序列如啟動子、終止子等以及篩選轉化株必需的任何序列一起導入適宜的載體中。
本發明還涉及由該方法得到的轉基因植物。更具體地說，涉及對病毒有抗性的轉基因植物，特徵在於它們在其基因組中含有轉錄後可產生本發明多核酶的序列。
在本發明中，術語「完全抗性」指完全沒有症狀，「耐受性」指植物被感染(即顯示出症狀)但隨後又恢復。術語「敏感性的」指植物表現出病症並複製病毒。「抗性型」指完全抗性植物和耐受性植物的總和。
可以用下列方法檢測本發明轉基因植物的「抗性」性質對第一子代完成自體受精或與未轉化的基因型雜交以得到T1。隨後，用所研究的病毒接種T1植物。根據本發明，75％的自體受精T1是有完全抗性。在與未被轉化之基因型雜交的情況下，50％的植物是完全抗性的(根據本發明，通過檢測已經經受轉化和再生過程的整個植物群體來得到這些數據。應注意這些植物中只有75％的是被轉化了的)。
可用「Southern印跡」分析證實植物的轉化性質，可用Northern印跡分析確定通過轉化導入的序列的表達。在下文實施例中將描述這些分析。
用本領域已知的植物轉化和再生方法可很好地生產由本發明多核酶保護的轉基因植物。一個實例是在專利公開No.EP－A－0412912中描述的甜瓜轉化和再生方法。
抗CMV的轉基因植物是特別優選的，如甜瓜，黃瓜，筍瓜(courgette)、蕃茄胡椒和菜豆。
下述附圖舉例說明了本發明的各個方面－圖1表示本發明多核酶催化區的優選結構，這些區在每一側均由與病毒衣殼蛋白的部分互補的序列包圍(i)在圖1A中X代表A、G、C或U；每個X是相同或不同的；n＋n』≥，6，n和n』是相同或不同的；(★)代表互補核糖核苷酸之間的氫鍵；X』和X」代表在至少其部分長度上彼此互補並可由至少一個核苷酸彼此相連，由此形成一個環的寡核糖核苷酸。可將選自A，G、C或U的附加核苷酸插入A』後。核酶的催化區由圖1A的部分(II)表示，部分(I)表示雜交臂。
(ii)在圖1B中，X，(★)，n，n』和A』具有與圖1A中相同的意思。M和M』≥1，並且是相同或不同的。B代表一個鍵，一個鹼基對，一個核糖核苷酸或含至少2個核糖核苷酸的寡核糖核苷酸。
(iii)圖1C代表核酶的一個優選模式(Haseloff and Gerlach，1988)，RNA底物在與核酶互補的GUC裂解位點周圍可以有任何序列(X)。箭頭表示裂解位點。用黑色顯示保守鹼基。
(iV)圖1D表示核酶(稱為「微小酶」)的結構，由元件「P」取代催化區的環。P可以是至少一個核苷酸(核核苷酸，脫氧核糖核苷酸，衍生物或混合物)，條件是在序列(X』)n和(X)n』及P僅由核糖核苷酸構成時，「P」基團的核糖核苷酸不是經「Watson－Crick」鹼基配對的鹼基對。「P」也可以是不影響核糖酶催化活性的鍵或任何原子或原子集團。X的意思與圖1A中的相同。
－圖2表示CMV(I17F)衣殼蛋白質的序列，下面劃線的是GUC位點。
－圖3顯示為了在CMV衣殼蛋白質序列中的不同位點處導入TobRSV催化位點而進行定點誘變實驗的寡脫氧核糖核苷酸A、B、C、E的結構(表明與DNA基質序列雜交)。
－圖4說明為了誘導對CMV抗性而構建的基因的結構(i)衣殼蛋白質(ii)多核酶136與帶有2個核酶的衣殼蛋白質互補的序列(ii)多核酶161與帶有3個核酶的衣殼蛋白質互補的序列(iv)多核酶163與攜帶3個核酶的衣殼蛋白質互補的片段；(v)多核酶165與帶4個核酶的衣殼蛋白互補的序列；－圖5顯示對表達多核酶136之轉基因甜瓜植物在某些情況下的原始轉化株，T1和T2後代)的Northern印跡分析結果T0原始轉化株；T1；T1後代；T2T2後代；A品系141.1NT未轉化的對照組。
－圖6顯示對表達多核酶136之轉基因甜瓜植物(在有些情況下的原始轉化株T1和T2後代)的Southern印跡分析結果
T0原始轉化株；T1T1後代；T2T2後代；NT未被轉化的對照組。
－圖7顯示對表達衣殼蛋白質基因之轉基因甜瓜植物(在某些情況下的原始轉化株，T1和T2後代)的Southern印跡分析結果T0原始轉化株；T1T1後代；T2T2後代；A品系88.105；B品系159.8；NT未轉化對照組。
－圖8顯示對由pBIOS135轉化的轉基因甜瓜植物(原始轉化株)的Western印跡分析結果A、B、C、D和E5個品系的原始轉化株；NT未被轉化的對照組；R用20ng CMV重新構建；－圖9表示在pBIOS135轉化的品系中，隨時間延長CMV症狀的發展情況D天數；無症狀植物；耐受性植物；敏感性植物。
－圖10表示在pBIOS135轉化的品系中，隨時間延長CMV症狀的發展情況D天數無症狀植物耐受性植物敏感性植物。
下列實施例描述了含3或4個核酶的4種多核酶的構建，所述核酶由24個鹼基的榔頭型保守序列(圖1)和與不同大小的CMV(I17F毒株)衣殼蛋白質序列互補的臂。在這些實施例中顯示的衣殼蛋白核苷酸序列的編號與專利申請EP－A－0412912中的相同。
這些核酶的每一種都裂解CMV衣殼蛋白質基因序列上的不同GUC序列。圖4中舉例說明了這些構建體的結構－多核酶1361074個鹼基長，含有核酶A(位置84)和B(位置108)及從中區缺失了一個G和一個A(位置20和21)的核酶C★(位置204)，所述核酶由下列長度的互補臂包圍·從5』末端到核酶A的82個核苷酸·核酶A和B之間的22個核苷酸；·核酶B和C★之間的94個核苷；·從核酶C★到3』末端的803個核苷酸。
－多核酶1611076個鹼基後，與多核酶136相同，區別僅在於核酶C在位置204有核酶C★中缺失的G和A。
－多核酶163426個核苷酸長，含有由下列長度的互補臂包圍的3個核酶A(位置84)，B(位置108)和C(位置204)
·從5』末端到核酶A的82個核苷酸；·核酶A和B之間的22個核苷酸，·核酶B和C之間的94個核苷酸；·從核酶C到3』末端的153個核苷酸。
－多核酶1651099個核苷酸長，含有由下列長度的互補臂包圍的4個核酶A(位置84)，B(位置108)，C(位置204)和E(位置608)·從5』末端到核酶A的82個核苷酸；·核酶A和B之間的22個核苷酸；·核酶C和E之間的94個核苷酸；·從核酶E到3』末端的399個核苷酸。
這些多核酶不含有對於其表達並整合到植物基因組中所需的信號。必須將構成性或非構成性啟動子(如病毒或細菌啟動子如NOS，或者植物啟動子如Rubisco的啟動子和遍在蛋白的啟動子)放在多核酶的5』末端，並且必須在3』末端放置poly(A)序列。可以用在植物中有功能的適宜啟動子；本發明人選擇了得自花椰菜花葉病毒(CaMV)的被人為是最強的構成性啟動子的35S啟動子。多聚腺苷酸化信號poly(A)可以是來自CaMV35S基因，從植物中分離的基因或者章魚鹼合成酶的基因；本發明人選擇了得自胭脂鹼合成酶(tnos)基因的poly(A)信號。將構建的表達盒導入得自pBI121載體的pBIOS4轉化載體中，所述pBI121載體含有卡那黴素抗性基因(編碼新黴素磷酸－轉移酶的基因neo)和編碼葡糖苷酸酶的iud A基因。遺傳轉化甜瓜子葉並再生轉基因甜瓜植物的方法與專利「轉基因甜瓜」，No.EP－A－412912(BIOSEM)中描述的相同。
實施例1；構建抗黃瓜花葉病毒株I17F衣殼蛋白質基因的核酶噬菌粒藍本(bluescribe)pBSIISK(SIRATAGENE)含有與稱為pBIOS113的CMV毒株I17F的RNA4互補的DNA(在歐洲專利公開EP－A－0412912中描述了它的生產方法)，用其作為構建不同核酶的起始點，用所述核酶得到抗不同CMV毒株的轉基因甜瓜。
衣殼蛋白質基因序列的不同位置導入衛星TobRV(菸草環斑病毒)的催化位點。EP－A－0412912的圖3中列出了與CMV毒株I17F的RNA4(1007個鹼基對長)互補的DNA序列；用胺基酸序列顯示編碼衣殼蛋白質的部分。
由於Hasehoff和Gerlach描述的的「榔頭」型核酶優先在GUC單元的C後裂解，所以在衣殼蛋白質編碼序列上選擇4個位置(圖2)*位置A，核苷酸84，*位置A，核苷酸108，*位置C，核苷酸204*位置E，核苷酸608為了在這些位置導入通常稱為「榔頭」的24鹼基核酶，決定使用KUNKEL研製的在單鏈DNA上誘變的方法(Proc.Nat.Acad，Sci.82488－492)，該方法需要與被誘變DNA部分雜交的並且在使用DNA聚合酶合成互補鏈時在3』末端作為引物的合成的寡脫氧核糖核酸。從EUROGENTEC公司訂購了下列4種寡核苷酸oligo A5′TCGACGGTTACCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACCAGCACTGGTTG 3′oligo B5′CGGGAACCACCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGCGGACGACG3′oligo C5′GTTAATAGTTGCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGACCAGCTGC 3′oligo E5′GAATACACGAGCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGGCGTACTTTC 3′用這4種寡核苷酸和購自BIORAD公司的定點誘變試劑盒(日錄號170－3576)，誘變由噬菌粒pBIOS113產生的單鏈DNA。圖3顯示4種寡核苷酸與靶單鏈DNA的雜交，箭頭指示DNA聚合物對合成互補鏈的作用。分析轉化大腸桿菌後得到的幾個重組克隆，首先用限制酶消化以檢測一些片段大小的增加。藉助從美國Biochemicals公司購得的「seguenasek」盒變體II，使用22個鹼基的寡核苷酸，oligo No.13(位置53到74)對顯然含3個催化位點的克隆pBIOS116進行測序。結果表明催化位點A和B完全插入，催化點C不完全插入。在位置20和21(G和A)發生兩個鹼基的缺失。儘管Lamb和Hay(Journal of Cencral Virology，1990，712257－2264)證明該位點對裂解沒有影響，但決定在表達載體pBIOS3(Perez al，Plant Mol，Biology 1989，13365－373)中的反方向上克隆約1100bp的DNA片段(1007bp＋21bp×2＋19bp＋在5』和3』的多接頭相鄰序列)，以研究在多核酶中存在無核酶活性的非互補序列的影響。為此目的在得自PROMEGA BIOTECH公司的質粒pGEH 72f(+)的KpnI－XbaI位點克隆pBIOS113的KpnI－XbaI片段；這樣在含催化位點的衣殼蛋白質序列的任一側都會含有BamHI位點。然後用BamHI消化所得的質粒pBIOS151，將所研究的片段(多核酶136，圖4)導入pBIOS3的BamHI位點。篩選在反義方向上含有位於花椰菜花葉病毒強構成性啟動子和胭脂鹼合成酶基因的終子止控制下之片段的重組克隆，稱為pBIOS125。
在二重載體pBIOS4的EcoRI位點處克隆含有處於上述轉錄調節序列控制下之核酶(帶2個功能催化位並缺失了一個的互補片段)的該質粒之EcoRI片段。後者是載體pBI121(Jefferson etal，1987EMBO Journal63901－3907)的衍生物，通過抑制位於編碼β－葡糖苷酸酶基因3』末端的EcoRI位點，而在同一基因的5』末端設定一個EcoRI位點而修飾之。在無御能力的根瘤土壤根菌RC58』3菌株的三親接合後，在不同的轉化實驗中使用所得的二元載體，pBIOS136，所述RC58』3菌株得自菌株C58』3(Muclineaux et al.，Plant Seience 63237－245，1989)而且事實上是抗利福黴素的自發突變體。
實施例2構建抗黃瓜花葉病毒株I17F衣殼蛋白質基因的不同核酶鑑於實施例1中所述的多核酶136(圖4)不含有針對位置608的催化位點，而且針對位置204的是不完全的，故開始進一步的定點誘變實驗。為此目的，將所述質粒的EcoRI片數克隆到經EcoRI消化的噬菌體M13mp18(得自PHARMACIA公司)中。確定充許包裹含兩個催化位衣殼蛋白基因編碼鏈的重組噬菌體的特徵，並用它作為使用寡脫氧核糖核苷酸C和E(一起或分別地)進行新的誘變實驗的基體。按前文實施例所述步驟完成誘變，由於起始物質是噬菌體，故單鏈基體的產率更高。用寡核苷酸No.13和19－mer寡核苷酸(位置694到位置676)對不同重組克隆測序，後者得以定序位置608處導入的催化位點。用含有與本發明一致之催化位點的克隆構建二重載體pBIOS161，pBIOS163和pBIOS165(見圖4)。除pBIOS161含有未缺失的催化位點C外，二重載體pBIOS161與pBIOS136完全相同。
對於編碼核酶的與衣殼蛋白質基因的全序列雜交並含有三個功能性催化位點A，B，C(對pBIOS161而言)或四個功能性催化位點A，B，C，E(對pBIOS165而言)的基因而言，在純化含35S啟動子、核酶、終止子NOS的EcoRI片段後，立即將所述基因克隆到二重載體pBIOS4的EcoRI位點處。對於含3個催化位點A，B，C並只與CMV之RNA45』末端的前360個鹼基雜交的核酶而言(就pBIOS163來說)，用限制酶HindIII消化後，缺失剩餘的3』部分(在衣殼蛋白質基因和該序列3』側HindIII位點處且得自多接頭的位置361)。然後將該質粒缺失的EcoRI片段克隆於二重載體pBIOS4的EcoRI位點上。
表達多核酶之甜瓜的轉化和再生將後3個二重載體導入土壤桿菌中並按專利申請EP－A－0412912中所述方法用於轉化。
實施例3；轉基因植物的分子分析Northern印跡分析藉助Northern印跡分析用pBIOS136轉化後得到的甜瓜植物(圖5)。按照Chandlor等的(Plant Physiology(1983)7447－54)所述方法，從培養在溫室中的轉基因和未轉基因植物的幼葉中提取總RNA。
在1％變性瓊脂糖凝膠中對其進行電脈分離，轉移到Hybond C上並與經由三重消化BamHI片段所得到的片段而構成的探針雜交，所說的片段相當於衣殼蛋白質基因的完整互補片段，其攜帶有3個核酶，其中兩個是有功能活性的(多核酶136)。三重消化有利於同源序列間的雜交並使之有可能得到更強的信號。
用亞甲蘭著染膜以證實加於凝膠上的總量RNA的同質性和RNA的質量。在轉錄水平上得到的初級轉化株和相應的T1和T2後代的結果示於圖2中並顯示－在所有得自被圍化植物的樣品中均觀察到1.45kb的主轉錄本，但陰性對照樣品中則沒有；－依據初級轉化株的不同，轉錄本的數目有相當大的變化。這種變化可以解釋為T－DNA和T－DNA的片段整合在植物基因組的不同位點並因此而受到環境的影響所造成的。
－初級轉化株的轉錄水平和它們的T1與T2後代的轉錄水平間沒有相關性。
Southern印跡分析藉助Southern印跡分析用pBIOS136或pBIOS135轉化後得到的甜瓜植物(圖6和7)。按照Dellaporta等人(Plant MolecularBioloygy Reporeter(1983)1；19－21)方法，從培養在溫室中的轉基因(初級轉化株，有些情況下使用T1和T2後代)以及非轉基因植物的幼葉中提取總DNA。因EcoRI(在pBIOS4中所研究基因之表達盒的克隆位點)水解該DNA，在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳，轉移到Hybond N+上並與三個探針基因nptII、三重消化的多核酶136(參見Northern印跡分析)和基因gus雜交。
用pBIOS136 5次轉化過程的結果(圖6)表明－品系146.42在初級轉化株146.42、其T1後代和T2後代的情況下，與3個探針的雜交特徵完全相同，此表明T－DNA的片段已沒有分離，並且可能有一個單一的座位。多核酶136的幾個拷貝存在於植物基因組中。事實上，可見到大小為1.75kb、4.4kb、8.3kb和8.8kb的4個雜交帶。1.75kb帶相應於預期成對的理論大小的帶(EcdRI，多核酶)。4.4kb帶與多核酶136和基因nptII雜交。此外，用EcoRI/nwptII對進行分析並沒有測出該帶，這表明在植物基因組中存在nptII基因的單一拷貝。8.3kb和8.8kb的帶與多核酶136和gus基因雜交。用EcoRI/gus對只測到這兩個帶，表明存在所有或部分gus基因的兩個拷貝。3個探針均與用XhoI消化之T0、T1和T2的DNA雜交也提示存在一單一座位。
－品系146.34在初級轉化株146.34和其T1後代的情況下，只有初極轉化株的某些雜交帶仍存在於個別T1中，此結果進一步表明T－DNA的某些片段已被除去。就EcoRI/多核酶136的分析來說，分子大小為1.75kb、3kb和5.3kb的3個帶對於T0和T1植物是共同的，而另外3條大小為7.3kb、6.8kb和4.25kb的帶則是T0的特徵帶。這一結果表明在T1和T0植物中分別存在多核酶的3個和6個拷貝。在nptII雜交中，於T0植物中檢測到兩條3kb和5.3kb的EcoRI帶，顯示存在所有或部分nptII基因的兩個拷貝。在T1基因中只看到3kb的EcoRI帶，表明存在nptII基因的單個拷貝。在gus雜交中，於T0植物中發現有3條大小為4.25的、5.3kb和6.8kbr EcoRI帶，而T1後代中只存在5.3kb的帶。這一結果揭示在T0和T1植物中分別存在整個或部分gus基因的3個拷貝和1個拷貝。再者，3個探針均與XhoI消化的T0和T1植物的DNA雜交提示存在2個座位。
－品系146.30和146.28在初極轉化株146.30和146.28以及它們的相應T1後代中，觀察到相似情況。
－品系141.1在初極轉化株141.1和其後代的情況下，雜交特徵是相似的。1.75的、10kb和10kb的EcoRI帶分別揭示了與探針多核酶136、nptII和gus的雜交。這表明存在有整合到植物基因組中的T－DNA的單一拷貝。
最後，在對轉化株146.42和其後代(T1和T2)以及轉化株141.1和其後代T1的分析中觀察到了遺傳穩定性。所研究的4條泳道揭示了T－DNA或T－DNA片段的高拷貝數特徵，而品系141.1則只具有一個已整合的T－DNA拷貝。
此外，注意到在用pBIOS135轉化的品系中也存在T－DNA拷貝和/或T－DNA部分的拷貝(圖7)。
Western印跡分析(比較分析)藉助Western印跡分析用含有衣殼蛋白質基因的表達盒的PBIOS4轉化的轉基因甜瓜植物。BIOSEM的專利申請EP－A－0412912(1989年8月11日)詳細描述了所使用的方法學和所得到的結果。然而，應強調的是，衣殼蛋白質基因的表達水平佔總蛋白質含量的0.001％至0.4％不等。藉助少數實例，圖8說明了取決於葉齡和對植物基因組的可能環境影響而造成的這種表達水平的變化。
實施例4由多核酶136和衣殼蛋白質特化的甜瓜對CMV的抗性試驗(比較試驗)使表達衣殼蛋白質基因或多核酶136之基因的轉基因甜瓜植物(基因型TEZIER10)自體受精或與基因型TEZIER10的未被轉化植物雜交。將得自這些自身受精的種子(T1代)和繼後自體受精的種子(T2代等)播種於人工氣候室(以16小時光照周期變化的氣候小室)中。
在2至4片葉階段，將用CMV毒株TL28感染之新鮮葉的粉碎製劑機械接種到源於後代的23株植物上。
感染16天後(最佳時期)，估計症狀(花葉病，葉片拆迭、黃化)。將被感染的植物分成三類－沒有症狀的抗性植物(R)；－有症狀的敏感植物(S)；－「恢復」的耐受植物(T)，即新生的葉發育沒有症狀，而老葉表現有症狀。
可以出現幾次「恢復」循環。新生的健康葉是否變成新感染的葉取決於氣候條件。
「抗性型」植物包括沒有症狀的植物和耐受植物。
用於抗CMV抗性試驗中的對照組包括
－敏感對照組TEZIER10和Vedrantais；－至少有CMV、Virgos和Free Cucumber的三個隱性基因的抗性對照組。
表達衣殼蛋白質基因之T1代甜瓜品系對CMV毒株TL28的抗性表1中給出了所得的20個品系的結果並顯示－用TL28感染導致3至30％沒有症狀的T1植物產生。接種TL28的未轉化的對照組TEZIER10產生0％沒有症狀的植物。抗性對照組Virgos和Free Cucumber分別產生92％和100％無症狀植物，並且均沒有顯示任何耐受現象。
－恢復現象以高比例存在。所研究的14個品系顯示沒有較明顯比例(22至59％)的耐受性T1植物。
－抗性和耐受T1植物的百分比與衣殼蛋白質的表達水平向沒有相關性。事實上，例如品系159.8和164.2有相同的衣殼蛋白質表達水平(0.01％)而表現出不同的抗性水平。159.8品系的T1個體都是敏感性的，而在164.2品系中則26％是沒有症狀的且有48％是耐受性的。
－經自體受精得到大多數表達衣殼蛋白質基因的品系。在接種CMV的T1植物中，預期的衣殼蛋白質基因的理論頻率為75％。抗性型植物(沒有症狀和耐受性的)的百分比根據轉基因品系的不同而25％和82％間有所變化。
表1表達衣殼蛋白質基因的T1代甜瓜植物對CMV毒株TL28的抗性
說明I自體受精BC與未被轉化的基因型TEZIER 10雜交％CP；作為可溶性總蛋白質百分比的衣殼蛋白質表達水平％R抗性植物或沒有證狀植物的百分比％T耐受性植物的百分比％S敏感植物的百分比*表達多核酶136的T1代中甜瓜植物對CMV毒株TL28的抗性表2中給出了所得到的13個品系的結果並顯示
－在10個品系的病例中，因TL28感染後30％至87％的T1個體沒有症狀；－「恢復」現象很少存在。只有4個品系顯示有耐受性T1植物，範圍達9％至26％。
經與未被轉化的品系TZ10雜交得到大多數表達多核酶136的品系。在接種CMV的T1植物中，預期的多核酶的理論頻率為50％。根據轉基因品系的不同。「抗性型」植物的百分比在30％至65％之間不等。
最後，在使用「核酶」戰略的情況下，較大數目的T1代的品系沒有症狀並有很少的耐受性植物。
表2表達多核酶136的T1代甜瓜植物對CMV毒株TL28的抗性
說明I自身受精BC與未被轉化的基因型TEZIER 10雜交％R抗性植物或沒有症狀植物的百分比％T耐受性植物的百分比％S敏感性植物的百分比*對CMV毒株TL28的抗性和藉助對某些系的GUS試驗估計分離的試驗總結表3中給出的結果顯示－產生兩個品系(品系88.105和153.8)的表達衣殼蛋白質基因的抗性型植物(沒有症狀的植物和耐受植物)，以及一個表達多核酶136(品系146.42)的完全抗性品系(沒有症狀的植物)；－產生兩個表達多核酶136(品系141.1和146.28)的耐性品系(耐性植物)。
表3對CMV毒株TL28的抗性試驗和GUS基因及抗性基因在後代中的行為
說明X雜交的類型；I自體受精；BC與未被轉化的基因型TEZIER 10雜交GEN代；T0初始轉化株；T1No.1代；T2No.2代KnptII基因，CP衣殼蛋白質基因；RZ多核酶136；Ggus基因+存在；-不存在；QT數量％G表達gus基因之植物的百分比％R抗性植物或沒有症狀植物的百分比％T；耐性植物的百分比％S敏感性植物的百分比1)對各品系的遺傳學研究能夠根據gus基因的表達水平確定分離的類型和純合性狀態。
就88.105和153.8兩個品系來說，在自體受精得到的T1代中gus基因的表達水平分別是80％和73％。這表明在單一座位有T－DNA整合之顯性基因的孟德爾型分離(3∶1)。分子分析已顯示存在被整合到植物基因組中的單一拷貝。
此外，兩個品系的T2代中gus基因的表達水平均為100％，從而進一步證實被整合基因的純合性狀態。
就品系146.42來說，在自體受精得到的T1代中gus基因的表達水平為77％，此表明在單一座位有T－DNA整合之顯性基因的孟德爾型分離。分子分析已顯示在植物基因組的單一座位存在幾個T－DNA和/或T－DNA片段。
再者，在T2代中gus基因的表達水平為90％這一事實強調，對於被整合的基因所試驗的品系不是純合的(表3)。就品系146.42來說，在T3中得到純合性。對於品系141.1，在與未被轉化的TEZIER10基因型雜交後得到的T1代中，gus基因的表達水平為57％。這一事實也與在單一座位有T－DNA整合的顯性基因的孟德爾型分離(1∶1)相符。分子分析已顯示被整合到植物基因組中的單一T－DNA的存在。
就品系146.28來說，在與未被轉化的TEZIER10基因型雜交後得到的T1代中，gus基因的表達水平為73％。這一事實表明在幾個座位有T－DNA整合的顯性基因的分離。分子分析已顯示在植物基因組的兩個座位上存在幾個T－DNA或T－DNA片段。
2)針對病毒的行為所有抗性型植物都表達gus基因。某些敏感植物表達gus基因(表3)。
就品系88.105來說，在自體受精後的T1代中得到25％的抗性型植物和75％的敏感植物。這表明對抗性基因之隱性基因的孟德爾型分離(1∶3)。
就品系153.8來說，在自體受精的T1代中得到55％的抗性型植物和45％敏感植物。根據這一事實難以對抗性基因的行為作出結論。
就品系141.1來說，在與未被轉化的TEZIER10基因型雜交的T1代中，得到40％的耐受植物和60％的敏感植物。這一結果表明對抗性基因之顯性基因的孟德爾型分離(1∶1)。因此多核酶136的行為相似於gus基因的行為。
就品系146.42來說，經自體受精後產生的T1代中，得到79％沒有症狀的植物和21％敏感植物。這一結果暗示對抗性基因之顯性基因的孟德爾型分離(3∶1)。因此多核酶136的行為相似於gus基因的行為。
3)估計病毒的量用ELISA檢測法測定的病毒量在沒有症狀植物中相當低；但還比Free Cucumber抗生對照植物中高些(表10)。
耐受植物含有可估計量的病毒。
敏感植物具有很高量的病毒。
表達多核酶的植物(品系146.42，T2和T3)比表達衣殼蛋白質的抗性型植物(系153.8，T2)含有較小量的病毒。
雖然在所測得的病毒量與症狀嚴重程度間有著相當好的相關性。
4)隨時間CMV引起的症狀的發展用CMV毒株TL28感染圖1和2中所示品系的植物。接種後第6、8、12、14、16和19天記錄症狀。結果以直方圖形式給出(圖9和10)。
16天後得到的值沒有顯示進一步的變化。就「衣殼蛋白質」品系來說，注意到無症狀植物的數目有可波動的迅速減少趨勢有利於有症狀植物的出現。就品系88.105和153.8來說(T1代)，分別在第16天和14天增加了以「恢復」現象為特徵的耐性植物。此外，在品系88.105的T2代中，在第8天100％無症狀的植物轉變為100％耐受植物並直到第19天仍繼續存在(圖9)。
這種無症狀植物突然變成耐受植物的現象可解釋為氣候條件的顯著影響。
在品系153.8的T2代中，注意到耐受植物的逐漸出現。從第16天以後，有50％的T2植物無症狀並有50％植物是耐受性的。
就「多核酶」品系來說，在品系141.1和146.28中強調無症狀T1植物數目的減少有利於有症狀植物(圖10)。
此外，就品系141.1來說，從第16天後記錄到40％的耐受性T1植物。在品系146.28中，從D14天有耐受性T2植物發育並且在第16天達到26％。
再者，在品系146.42中，在第6天出現80％的沒有症狀的T1植物，並且隨時間進程仍幾乎保持在穩定水平(第8、12和14天為78％，第16天為79％)。
品系146.42的T2植物表現有相似的行為。這一結果顯示出該系的很高的抗性水平並後代中抗性基因的穩定性。
最後，得到兩個表達衣殼蛋白質基因的「抗性」型的品系，以及一個表達多核酶136完全抗性品系。就兩個表達衣殼蛋白質基因的品系來說，所觀察到的抗性與完全抗性相比更相似於耐受性。帶實上，在某些條件下，有些病毒感染的表現嚴重症狀的植物能夠發育新的健康葉。
就表達多核酶136的完全抗性品系來說，沒有觀察到耐受現象。就兩個表達衣殼蛋白質的品系來說，在抗性植物中觀察到相對大量的病毒，對在表達多核酶136的抗性植物中病毒的量幾乎是與Free Cucumber抗性對照植物是同樣的。
實施例5表達多核酶165的T1代甜瓜品系對CMV毒株TL28感染的抗性。
就表達多核酶165的13個T1品系所得到的結果示於表4中並表明－被TL28感染後，12個品系的15％至100％和T1個體沒有症狀；－只輕微地存在「恢復」現象。只有5個品系有6％至60％的T1耐受植物。
經自體受精已得到了大部分表達多核酶的品系。在接種CMV的T1植物中，多核酶165的理論頻率為75％。根據轉基因系的不同，「抗性型」植物的百分比為15％至100％。
最後，同表達多核酶136的品系一樣，大多數表達多核酶165的品系沒有症狀並且只有很少的耐受植物。多核酶165不同於多核酶136在於有兩個附加的功能性核酶。就對CMV感染的抗性來說，兩種構建得到了相似的結果。
表4表達多核酶165的T1代甜瓜植物對CMV毒株TL28感染的抗性<
說明I自體受精BC與未被轉染的TELIZIER10基因型雜交％R抗性植物或無症狀植物的百分比％T耐受植物的百分比％S敏感植物的百分比
權利要求
1.一種具有核糖核酸內切酶活性並能夠滅活病毒衣殼蛋白基因的，稱為「多核酶」的核酸序列，其特徵在於它包括i)與所述基因或其轉錄本或其複製中間體的至少一部分互補的序列，和在此互補列中不同位點上包含ii)多個核酶催化區域；和iii)任選的，與所述基因的轉錄本不互補的一種或多種序列，所述非互補序列插入在互補序列的兩個連續鹼基間。
2.權利要求1的多核酶，其特徵在於所述催化區源自榔頭型核酶或髮夾型核酶或兩者的混合物。
3.權利要求2的多核酶，其特徵在於每個催化區位於互補序列中相應於所述基因轉錄本或其片斷中的XUX位點的位置。
4.權利要求3的多核酶，其特徵在於互補序列中包含的催化區的數目等於或小於相應轉錄本或轉錄本片斷中存在的XUX位點的總數。
5.權利要求4的多核酶，其特徵在於互補序列催化區的插入位點全部相應於轉錄本中存在於相同病毒的不同毒株間或不同相關病毒間保守的同源性區域中的XUX位點。
6.根據以上權利要求中任一項的多核酶，其特徵在於除催化區外，互被序列中含有一個或多個非互補序列，其插入在互補序列的兩個鹼基間，這樣非互補列與互補序列形成共線插入。
7.根據以上權利要求中任一項的多核酶，其特徵在於互補序列與選自下組的植物病毒的衣殼蛋白基因互補花椰菜花葉病毒組，如花椰菜花葉病毒(CaMV)；雙聯病毒組，如玉米線條病毒(MSV)；呼腸孤病毒科，如傷瘤病毒(WTV)；彈狀病毒科，如馬鈴薯黃矮病毒(PYDV)；蕃茄斑萎病毒(TSMV)；菸草花葉病毒組，如菸草花葉病毒(TMV)；馬鈴薯X病毒性，如馬鈴薯X病毒，馬鈴薯Y病毒組，如馬鈴薯Y病毒(PYV)荷蘭石竹潛伏病毒組，如荷蘭石竹潛伏病毒(CLV)；黃化病毒組，如甜菜黃病毒(BYV)；菸草脆裂病毒組，如菸草脆裂病毒(TRV)；大麥病毒組，如大麥條斑花葉病毒；蕪菁病毒組，如蕪菁黃花葉病毒(TYMV)；黃症病毒組(Luteoviruses)，如大麥黃矮病毒或馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)；蕃茄絲矮病毒組，如蕃茄絲矮病毒(TBSV)；南方菜豆花葉病毒組，如南方菜豆花葉病毒(SBMV)；菸草壞死病毒(TNV)；蠕傳多面體病毒組，如菸草環斑病毒(TRSV)；豇豆花葉病毒組，如豇豆花葉病毒(CPMV)，豌豆耳突花葉病毒(PEMV)；黃瓜花葉病毒組，如黃瓜花葉病毒(CMV)；雀麥花葉病毒組，如雀麥花葉病毒；等軸不穩環斑病毒組，如菸草線條病毒。
8.權利要求7的多核酶，其特徵在於互補序列源自黃瓜花葉病毒的衣殼蛋白基因的轉錄本。
9.根據以上權利要求中任一項的多核酶，其特徵在於，它由RNA組成。
10.含有編碼上述權利要求中任一項之多核酶的序列的DNA序列。
11.一種提供植物對病毒抗性的方法，其特徵在於，向植物中引入多核酶或編碼權利要求1－10中任一項之多核酶的序列。
12.權利要求11的方法，其特徵在於，通過用編碼多核酶的DNA序列對植物的一部分進行遺傳轉化來引入多核酶，然後將轉基因植物再生。
13.權利要求12的方法，其特徵在於，用根瘤土壤桿菌或根毛土壤桿菌為媒介進行轉化。
14.抗病毒的轉基因植物，其特徵在於在其基因組中含有轉錄時產生權利要求1－9中任一項的多核酶的序列。
15.權利要求14的轉基因植物，其特徵在於，它對CMV有抗性。
16.權利要求15的轉基因植物，其特徵在於，它是甜瓜、黃瓜、筍瓜(courgette)、馬鈴薯、甜胡椒或菜豆。
17.權利要求14－16中任一項的轉基因植物的果實和種子。
18.用權利要求10的序列轉化的植物細胞。
全文摘要
本發明涉及一種具有核糖核酸內切酶活性並能夠滅活病毒衣殼蛋白基因的，稱為多核酶」的核酸序列，其特徵在於它包括(i)與所述基因或其轉錄本或其複製中間體的至少一部分互補的序列，和在此互補列中不同位點上包含(ii)多個核酶催化區域；和(iii)任選的，與所述基因的轉錄本不互補的一種或多種序列，所述非互補序列插入在互補序列的兩個連續鹼基因。
文檔編號C12N15/82GK1118609SQ94191308
公開日1996年3月13日 申請日期1994年2月25日 優先權日1993年2月26日
發明者P·萊尼, P·普裡茲, V·格魯伯, G·保多特, C·奧利沃 申請人:基因剪切公司