幾乎不含亞基的糖蛋白的組合物的製作方法
2023-06-11 09:15:46 1
專利名稱：幾乎不含亞基的糖蛋白的組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質藥物的純化領域。尤其涉及含有治療不孕症的糖蛋白水溶液的冷凍乾燥方法。
背景技術：
治療不孕症的糖蛋白是一類結構接近的物質，包括絨毛膜促性腺激素(HCG)、絕經期促性腺素(HMG)、卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)，其中絕經期促性腺素是含有卵泡刺激素和黃體生成素且兩者成一定比例(1 0.1-1)的混合物。HCG、FSH、LH都是由α鏈和β鏈兩個亞基通過非共價鍵的形式結合，其中它們的α亞基完全相同，具有92個胺基酸，分子量約為14500D，第52和78位置上的天冬醯胺是發生N-糖基化的胺基酸。HCG的β亞基有145-147個胺基酸，分子量22200-39000D，其中第13、30位置上的天冬醯胺以及第121、127、132、145位置是發生糖基化的地方。FSH的 β亞基由111個胺基酸組成，分子量約為18000D，其中第7和24位置上的天冬醯胺是發生 N-糖基化的胺基酸。而LH的β亞基由121個胺基酸組成，分子量約為14800D。臨床上HCG、HMG、FSH、LH主要用於治療不育症以及體外輔助生殖。它們可以從特定婦女(孕期或絕經期)的尿液中提取出來，也可通過DNA重組技術而製備。治療不孕症的糖蛋白的第一代產品是上世紀60年代Serono公司的 Profasi (HCG)、Pergonal (HMG)，它們的純度都較低，含有大量雜質。上世紀80年代之後， Serono公司分別推出了 Metrodin-HP，它是一種雜質含量很低的高純度的FSH製劑；後來又推出利用DNA重組技術生產的Gonal-F(rFSH)、Luveris (rLH)等，另外，Ferring公司也推出了高純度絕經期促性腺素-Menopur。由此可見，目前市場上都在致力於高純度糖蛋白的開發和應用，來替代普通的低純度產品，以克服普通低純度產品中的雜蛋白造成的過敏反應。但是，通過各種純化手段獲得的高純度糖蛋白都要經過兩個階段，即原料藥階段和製劑成品階段。這兩個階段可以是固體形式，也可以是液體形式。一般應儘量採用固體形式而不採用液體形式，對於原料藥來說，液體形式不容易保存和運輸，因為液體形式必須保存在-20°C以下，否則糖蛋白容易失活；液體形式由於會遇到凍結-溶解過程，甚至是反覆的凍結_溶解過程，更容易導致糖蛋白失活；液體形式還會遇到包裝容器在低溫下接近脆性點容易破裂的危險等。而對於製劑成品來說，液體形式除了不容易運輸外，還遇到液體形式的糖蛋白藥物的穩定性較差，而且必須要加防腐劑才能保證在有效期內微生物不會滋生，如公開號為CN1309567A的專利申請。而固體形式的獲得主要是通過冷凍乾燥的手段，但高純度的糖蛋白在冷凍乾燥的過程中很容易發生變性失活，其變性失活主要表現為完整分子降解成α鏈和β鏈兩個亞基，而這些亞基也是雜質，它們是沒有療效或可能產生副作用的異構物，因此目前的高純度糖蛋白的凍幹製劑在投料時都要多加10-30%的量，以抵消冷凍乾燥過程的失活情況，而且成品中還會產生一定量的亞基，降低了產品的純度。造成降解失活的原因，一方面是原輔料的配方不合理，一方面是冷凍乾燥的工藝需要完善。 因此，本領域迫切需要開發出一種適合治療不孕症的糖蛋白的冷凍乾燥方法，並由此獲得幾乎不含亞基的糖蛋白藥物。
發明內容
本發明旨在提供一種含有糖蛋白的水溶液的冷凍乾燥方法，並由此獲得幾乎不含亞基的糖蛋白藥物。在本發明的第一方面，提供了一種亞基含量不超過10wt%的糖蛋白的組合物。在另一優選例中，所述的糖蛋白選自絨毛膜促性腺激素、絕經期促性腺素、卵泡刺激素、黃體生成素、或其混合。在另一優選例中，所述絨毛膜促性腺激素是人尿來源和/或重組的人絨毛膜促性腺激素、或其變體；所述絕經期促性腺素是人尿來源和/或重組的人絕經期促性腺素、或其變體；所述卵泡刺激素是人尿來源和/或重組的人卵泡刺激素、或其變體；所述黃體生成素是人尿來源和/或重組的人黃體生成素、或其變體。在另一優選例中，所述糖蛋白的組合物的亞基含量不超過5wt%。在另一優選例中，所述的組合物是冷凍乾燥粉末。在本發明的第二方面，提供了一種含糖蛋白水溶液的冷凍乾燥方法，所述的方法包括步驟(a)真空下將經過預凍的含有糖蛋白水溶液以0. 05-5°C /分鐘的升溫速率將擱板溫度升到溶液共晶點以下1-20°C，並維持1-30小時；和(b)以0. 05_5°C /分鐘的升溫速率將擱板溫度升到彡0°C，並維持1-20小時，得到含有糖蛋白的凍乾粉末。在另一優選例中，步驟(a)中的升溫速率為0. 07-30C /分鐘；步驟(b)中的升溫速率為0. 06-1. 5°C /分鐘；更佳地，在步驟(a)前還包括下述步驟將含有糖蛋白水溶液預凍0. 5-5小時。在另一優選例中，所述的含有糖蛋白水溶液中糖蛋白的濃度為1 μ g/mL-80mg/mL ； 更佳地,濃度為500 μ g/mL-60mg/mL。在另一優選例中，步驟(a)中所述的含有糖蛋白水溶液中的糖蛋白是高純度糖蛋白。在另一優選例中，在步驟(b)中得到含有亞基含量< 10wt%的糖蛋白的凍乾粉末；更佳地，亞基含量< 5wt% ；最佳地，亞基含量< 3wt%。在另一優選例中，步驟(a)中所述的含有糖蛋白水溶液中還含有選自下述一種或多種糖類保護劑乳糖、蔗糖、海藻糖、甘露醇、右旋糖酐；所述的糖類保護劑在含有糖蛋白水溶液中的濃度為2-60mg/ml。在另一優選例中，所述的糖蛋白選自絨毛膜促性腺激素、卵泡刺激素、黃體生成素、絕經期促性腺素、或其混合。
在另一優選例中，所述絨毛膜促性腺激素是人尿來源和/或重組的人絨毛膜促性腺激素、或其變體；所述絕經期促性腺素是人尿來源和/或重組的人絕經期促性腺素、或其變體；所述卵泡刺激素是人尿來源和/或重組的人卵泡刺激素、或其變體；所述黃體生成素是人尿來源和/或重組的人黃體生成素、或其變體在本發明的第三方面，提供了一種如上所述的本發明提供的組合物在用於製備治療不育綜合症的藥物中的用途。在本發明的第四方面，提供了一種如上所述的本發明提供的方法製備得到的糖蛋白。在本發明的第五方面，提供了一種如上所述的本發明提供的方法製備得到的糖蛋白在用於製備治療不育綜合症的藥物中的用途。據此，本發明提供了一種適合治療不孕症的糖蛋白的冷凍乾燥方法，並由此獲得幾乎不含亞基的糖蛋白藥物。
圖1顯示了實施例1中冷凍乾燥前的FSH的液相圖譜。圖2顯示了實施例1中冷凍乾燥後的FSH的液相圖譜。
具體實施例方式發明人在實驗中發現，冷凍乾燥過程中，同樣的凍幹工藝對於象胰蛋白酶抑制劑 (UTI)等單鏈結構的蛋白質和象HCG、FSH、LH等雙鏈結構的糖蛋白的影響是不同的，前者幾乎沒有任何失活現象，而後者很容易降解出亞基並表現出失活的結果。因此，本發明人經過廣泛而深入的研究，驚奇地發現，在冷凍乾燥過程中，過快的升溫過程是導致糖蛋白的降解從而發生變性失活的主要原因。正如前所述，此類糖蛋白都由兩條鏈以非共價鍵的形式結合，也就是以疏水作用、氫鍵等較弱的力來維繫，它們與輔料等其它組成物在預凍過程均勻分布在水分子的冰晶中，然而在過快的升溫過程中，擱板會以較大的熱流速率傳遞給產品的冰晶結構，而且此時凍幹機腔內的真空度非常高，因此就使得冰晶內的水分子在較短的時間內迅速升華變成水蒸氣分子，在這個快速升華的過程中，水分子以很快的速率「飛」出冰晶結構，就會促使此類雙鏈糖蛋白的亞基之間的氫鍵、疏水作用等較弱的維繫力發生改變，從而導致亞基解離，產品發生失活。在探索過程中，本發明人注意到，通過在冷凍乾燥過程中控制合理的升溫速率，可以降低或幾乎不產生亞基的降解，從而保持了產品的活性，減少雜質的產生。定義如本文所用，「糖蛋白」選自下述的一種或多種混合絨毛膜促性腺激素 (chorionic gonadotropin, CG)、卵泡刺激素(follicule-stimulating hormone, FSH)、黃體生成素(luteotropic hormone, LH)、絕經期促性腺素(human menopausal gonadotropin, HMG)。如本文所用，「含糖蛋白水溶液」、「含有糖蛋白水溶液」、「含糖蛋白的水溶液」和 「含有糖蛋白的水溶液」可以互換使用，都是指一種水溶液，其中包括糖蛋白，或者包括糖蛋白和藥學上/食品學上可接受的載體。
如本文所用，「糖蛋白的組合物」是指含有糖蛋白的組合物，是一種固體，其中包括糖蛋白，或者包括糖蛋白和藥學上/食品學上可接受的載體；優選含有糖蛋白的凍乾粉末。
如本文所用，「含有糖蛋白的凍乾粉末」是一種固體粉末，其中包括糖蛋白，或者包括糖蛋白和藥學上/食品學上可接受的載體。如本文所用，「亞基」是指CG、FSH、LH、HMG的經過解離後產生的單獨的α鏈亞基或β鏈亞基。如本文所用，「高純度糖蛋白」是指純度大於90 %，優選大於95 %的糖蛋白。在本發明的優選例中，將高純度糖蛋白進行冷凍乾燥，得到亞基含量< 10wt%的糖蛋白。如本文所用，術語「藥學上可接受的」或「食品學上可接受的」的成分是適用於人和 /或動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態反應)的，即有合理的效益/風險比的物質。如本文所用，術語「藥學上可接受的載體」指用於治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體它們本身並不是必要的活性成分，且施用後沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在《雷明頓藥物科學》 (Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Pub. Co. ,N. J. 1991)中可找到關於藥學上可接受的賦形劑的充分討論。所述的「藥學上可接受的載體」可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如填充劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、泡騰劑、潤溼劑或乳化劑、矯味劑、PH緩衝物質等。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中PH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。術語「卵泡刺激素」和「FSH」可互換使用，都是指一類用於促進精子或卵泡產生、 促進卵巢發育的激素或其變體。在天然情況下由垂體前葉分泌，也可從絕經期婦女的尿液中提取或可通過重組技術獲得的。本發明中的FSH可採用本領域常用的任何方式獲得，例如天然產生、通過重組技術獲得或合成，其中的雜質包括LH或CG。在本發明的一個實施方式中，所述卵泡刺激素是人卵泡刺激素或其變體，優選人尿來源的卵泡刺激素或是重組的人卵泡刺激素。優選在採用本發明的方法純化FSH前，採用本領域常規方法對原料FSH進行初步純化，以分離除LH或CG以外的其它雜質。如本文所用，術語「黃體生成激素」和「LH」可互換使用，指在含有FSH的原料製備或獲取過程中摻雜於其中的與天然LH具有相同或相似結構和功能的激素。類似地，術語「絨毛膜促性腺激素」和「CG」可互換使用，指在含有FSH的原料製備或獲取過程中摻雜於其中的與天然CG具有相同或相似結構和功能的激素。如本文所用，術語「擱板」是指一種冷凍乾燥機的傳熱裝置結構，每層擱板內都有導熱介質如矽油進行循環傳熱。本領域技術人員所熟知的冷卻/加熱裝置中一般都有這樣的結構。如本文所用，術語「擱板溫度」是指擱板內的導熱介質所達到的溫度。如本文所用，術語「冷胼」是指在冷卻的表面上以凝結方式捕集氣體的講。置於真空容器和泵之間，用於吸附氣體或捕集油蒸汽的裝置。 如本文所用，術語「升華乾燥」是指在共晶點以下1-20°C的溫度範圍內進行真空乾燥以使得冰直接轉變為水蒸氣的乾燥過程。如本文所用，術語「解析乾燥」是指將升華乾燥後還不能完全去除的結構水通過加熱蒸發去除的乾燥過程。 如本文所用，術語「預凍」是指真空冷凍乾燥前先使被乾燥的糖蛋白或其組合物形成凍結狀態。在預凍階段，要嚴格控制預凍溫度(通常比樣品的共晶點低10度以上)，較佳地為-30--50°C。冷凍乾燥本發明提供的含糖蛋白水溶液的冷凍乾燥方法，包括步驟(a)真空下將經過預凍的含有糖蛋白水溶液以0. 05-50C /分鐘的升溫速率將擱板溫度升到升華乾燥溫度，並維持1-30小時；和(b)以0. 05-50C /分鐘的升溫速率將溫度升到解析乾燥溫度，並維持1-20小時， 得到含有糖蛋白的凍乾粉末。在本發明的一個優選例中，含糖蛋白的水溶液冷凍乾燥方法包括步驟(1)將含有糖蛋白的水溶液預凍0. 5-5小時；(2)真空下以0. 05-50C /分鐘的升溫速率將溫度升到升華乾燥溫度(最佳地升溫速率為0. 07-30C /分鐘)，並維持1-30小時(最佳地在升華乾燥溫度維持6-20小時)；和(3)以0. 05-50C /分鐘的升溫速率將溫度升到解析乾燥溫度(最佳地升溫速率為 0. 1-1. 5°C /分鐘)，並維持1-20小時(最佳地在解析乾燥溫度維持3-10小時)，得到含有糖蛋白的凍乾粉末。更佳地，本發明用本發明提供的方法對含有高純度糖蛋白的水溶液進行冷凍乾燥，得到的含有糖蛋白的凍乾粉末中，糖蛋白中亞基含量< 10% (最佳地<5%)。本發明還提供糖蛋白的組合物的製備方法，所述的方法包括步驟(a)真空下將經過預凍的含有糖蛋白水溶液以0. 05-50C /分鐘的升溫速率將溫度升到升華乾燥溫度，並維持1-30小時；和(b)以0. 05-50C /分鐘的升溫速率將溫度升到解析乾燥溫度，並維持1-20小時， 得到含有糖蛋白的組合物，所述的組合物優選含有糖蛋白的凍乾粉末。所述的組合物是亞基含量不超過IOwt %的糖蛋白的組合物。本發明的優點在於提供的冷凍乾燥方法，可以降低或幾乎不產生亞基的降解，從而保持了糖蛋白的活性，減少雜質的產生，可以獲得幾乎不含亞基的糖蛋白或其組合物。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件、或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。實施例中的亞基含量均由以下方法測定得到液相色譜法色譜柱Superdex7510 X 400mm 或類似柱；流動相0·2M Na2HPO4 (ρΗ6· 5)乙腈=10 2
流速0· 5ml/min進樣濃度和體積約60 μ g/ml X 100 μ 1檢測波長215nm亞基峰與主成分峰的保留時間比約為1. 2，用面積歸一法進行亞基含量的計算。實施例1FSH的冷凍乾燥配製50mL 0. OlM磷酸二氫鈉溶液(用NaOH調pH約6. 5)，加入2g乳糖，攪拌溶解後，用0.22 μ m過濾器過濾。取IOmL濾過液，加入10. Omg上述高純度FSH(購自上海天偉生物製藥有限公司)(生物效價為8817國際單位/mg)，完全溶解後，此溶液的共晶點約為_2°C，裝盤放入凍幹機(購自Virtis)中，按如下程序進行冷凍乾燥1.擱板溫度至-40 V預凍3小時；2.冷阱至-45°C;3.啟動真空泵；4.擱板溫度以0. 1250C /min的速率從_40°C升溫至-10°C，擱板溫度達到-10°C後維持15小時;5.擱板溫度以0. 30C /min的速率從_10°C升溫至+20°C，擱板溫度達到+20°C後維持5小時；6.出箱，得392mg凍乾粉末。經測定，FSH的生物效價結果如下
權利要求
1. 一種糖蛋白的組合物，其特徵在於是由如下方法製備而成 計算出的一定量的以生物效價為單位的HCG精品溶解於50mL注射用無熱原水中，用 HCl或NaOH調節pH 6. 5 士 0. 2，然後用0. 22 μ m過濾器進行無菌過濾；將300g甘露醇和10. 9g NaH2PO4 · 2H20溶解於3L注射用無熱原水中，用NaOH調節pH 7. 0士0. 2，用0. 22 μ m過濾器進行無菌過濾；然後加入到FSH溶液中，用注射用無熱原水定容至7. 5L，混勻；將上述溶液分裝入安瓿瓶中，每瓶0. 75mL，按如下程序進行冷凍乾燥(1)擱板溫度至_40°C預凍3小時；(2)冷阱至-450C；(3)啟動真空泵；(4)擱板溫度以0.5°C /min的速率從_40°C升溫至-10°C，擱板溫度達到-10°C後維持 10小時；(5)擱板溫度以0.3750C /min的速率從-10°C升溫至+35°C，擱板溫度達到+35°C後維持10小時；(6)壓塞，出箱。
全文摘要
本發明公開了幾乎不含亞基的糖蛋白的組合物，所述的方法包括步驟(a)真空下將經過預凍的含有糖蛋白水溶液以0.05-5℃/分鐘的升溫速率將擱板溫度升到溶液共晶點以下1-20℃的範圍，並維持1-30小時；和(b)以0.05-5℃/分鐘的升溫速率將擱板溫度升到不低於0℃，並維持1-20小時，得到含有糖蛋白的凍乾粉末。
文檔編號A61K38/24GK102309744SQ201110199948
公開日2012年1月11日 申請日期2008年9月17日 優先權日2008年9月17日
發明者嚴惠敏, 季斌, 季曉銘, 洪雲海, 高霄梁 申請人:上海天偉生物製藥有限公司