一種鞘氨醇單胞菌dx-t3-03菌株及其提取方法

2023-06-12 02:47:21 3

專利名稱：一種鞘氨醇單胞菌dx-t3-03菌株及其提取方法
技術領域：
本發明屬於鞘氨醇單胞菌菌株領域，特別涉及一種鞘氨醇單胞菌DX-T3-03菌株 及其提取方法。
背景技術：
隨著採礦業的發展和重金屬在電鍍、冶金、化工和製藥業等方面的應用，重金屬汙 染日趨嚴重。由於重金屬在土壤中難降解、難遷移、危害期長等特點，已使得土壤重金屬汙 染成為國內外普遍關注的環境問題之一。其中重金屬鋅既是重要的營養元素，也是汙染元 素。鋅曾被譽為「生命之花」，是維持機體正常生長發育、新陳代謝的重要物質。我國是產鋅 大國，最大的消費領域是鍍鋅工業，消費量約佔鋅總產量的30% 40%。除此之外，其它工業 產生的含鋅廢水也不容忽視。許多實驗和流行病學調查已經證實，如果鋅在人體內含量過 高，將會抑制吞噬細胞的活性和殺菌力，從而降低人體的免疫功能，對疾病易感性增加。最 近的科學研究表明，攝入過量的鋅，會對人體造成一定的傷害，甚至可引起中毒，以至死亡； 同時鋅中毒會導致胰腺、腎和體內多元系統(Muitisystem)功能紊亂甚至死亡。對於重金屬的處理，由於傳統的物理或化學方法常伴隨二次汙染，且運行費用高， 操作複雜，已越來越不適宜現代汙染治理的需要。近年來，微生物在重金屬汙染治理的潛在 應用前景，使得其在處理重金屬汙染問題上成為國內外一個新型的研究方向。因此，篩選新 的具有高抗性能力的微生物並研究它們的抗性機理也成為當前的主要任務之一。苯酚是造紙、煉油、製藥、焦化等工業過程中產生的一種有機汙染物，會對動、植物 產生有毒甚至致命的作用。大量酚類物質及其衍生物在土壤和水體中的排放和積累導致了 生態環境的日趨惡化，許多國家已將其列入環境優先控制汙染物的黑名單中。近年來，隨著 生物新技術的發展，利用微生物降解法處理高濃度含酚廢水是一種經濟高效且不會產生二 次汙染的方法，相關方面的研究越來越受到人們的關注。但含酚工業廢水中往往含有較高 濃度的重金屬離子，而高濃度重金屬離子的存在會抑制微生物對苯酚的生物降解。因此，獲 得有一定耐受重金屬能力的苯酚降解菌在含酚工業廢水的生物處理中將具有突出的應用 潛力。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種鞘氨醇單胞菌DX-T3-03菌株及其提取方 法，該菌株對鋅的耐受性高達4mM/L的同時，苯酚的降解率高達88 %，營養要求不高，對苯 酚有較好的降解能力，在生物治理含酚工業廢水和重金屬雙重汙染中具有重要應用潛力； 提取方法簡便快捷，成本低，對環境友好。本發明的一種鞘氨醇單胞菌DX-T3-03菌株，其特徵在於該菌株對鋅具有高抗性 並且具有降解苯酚能力。本發明的一種鞘氨醇單胞菌DX-T3-03菌株的提取方法，包括(1)定向馴化
在礦區取土製成土壤懸液按5wt%的接入量接種於無機鹽培養基中，以梯度壓力 式馴化法馴化2個月；(2)菌株的富集分離和純化將上述馴化後的樣品靜置，取上層水樣作梯度稀釋，然後每種稀釋濃度分別取ImL 菌液於接種到固體培養基進行富集培養，如此反覆多次確保長出純的單一菌株，再接種到 斜面培養基，即可。所述步驟(1)中的無機鹽培養基為(NH4)2SO410. OgjKH2PO4 7. 5g,Na2HPO4 10. Og, FeCl3 0. 0125g, MgSO4 · 7H20 0. 015g，蒸餾水 IOOOmL, pH = 6· 5 7· 0。所述步驟(1)中的梯度壓力式馴化法為在無機鹽培養基中，同時加入梯度濃度的 濾菌苯酚和濾菌Zn2+溶液，使培養基中同時含有苯酚和Zn2+且兩種物質濃度均依次升高，即 苯酚 300、400、500、600、700、800、900、100011^/1，2112+濃度0· 5,1. 0,1. 5,2. 0,2. 5,3. 0,3. 5、 4. OmM/L,改變濃度的間隔時間為6 7d，於30 35°C，振蕩速率150r/min條件下進行馴 化培養。所述步驟⑵中的梯度稀釋為ICT1 ICTki的梯度稀釋。所述步驟(2)中的固體培養基為富集液體培養基基礎上加入質量分數1. 5%的瓊 脂，IX IO5Pa滅菌30min，冷卻後而形成的培養基，其中富集液體培養基為蛋白腖0. 25g，胰 蛋白腖 0. 25g，酵母粉 0. 5g，葡萄糖 0. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 03g，蒸餾水 IOOOmL, pH = 6. 5 7. 0。斜面培養基為將固體培養基加熱溶化，取乾淨的試管，試管中倒入約5mL固體培養基， 將試管口端放在玻璃棒上，使管內培養基形成斜面而形成。所述步驟(2)中富集培養是指將菌液於接種到富集培養基後於30°C培養箱中培 養48h，挑取形態清晰的單一菌落，編號，在固體培養基上劃線，將培養皿倒置於30°C培養 箱中培養48h，再觀察結果，在電子顯微鏡下觀察菌落形態，反覆2 4次，確保長出純的單 一菌株。鞘氨醇單胞菌DX-T3-03菌株的16S rDNA序列如下CCAATGGCGGCTGCCTACACATGCAGTCGAACGAGATCTTCGGGTCTAGTGGCGCACGGGTGCGTAACG CGTGGGAATCTGCCCTTTGGTTCGGAATAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGGATGATGACGAAAGTCCAAAGA TTTATCGCCAGAGGATGAGCCCGCGTAGGATTAGCTAGTTGGTGTGGTAAAGGCGCACCAAGGCGACGATCCTTAGC TGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATAT TGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTTACCC GGGATGATAATGACAGTACCGGGAGAATAAGCTCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGAGCT AGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGCTTTGTAAGTTAGAGGTGAAAGCCTGGAGCTCAAC TCCAGAACTGCCTTTAAGACTGCATCGCTTGAATCCAGGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCG TAGATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGACTGGTATTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGA GCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGATAACTAGCTGTCCGGGGACTTGGTCTTTGGGT GGCGCAGCTAACGCATTAAGTTATCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCC TGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCGTTTGACATGTCCGGACGAT TTCCAGAGATGGATCTCTTCCCTTCGGGGACTGGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGAT GTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCTTTAGTTACCATCATTTAGTTGGGGACTCTAAAGGAACCGC CGGTGATAAGCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGCGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGTGACAGTGGGCAGCAAACTCGCGAGAGTGCGCTAATCTCCAAAAGCCGTCTCAGTTCGGATTGTTCTCTG CAACTCGAGAGCATGAAGGCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCAGGCCTTGT ACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGGTTCACCCGAAGGCGTTGCGCTAACTCGCAAGAGAGGCAGGCGACCA CGGTGCTAGCGTGT。菌株16S rDNA的基因全序列在NCBI資料庫中分析比較，鑑定為鞘氨醇單胞菌，鑑 定結果見圖 2，其系統進化樹見圖 3，與 Sphingomonas aquatilis strain JSS-7 (AF131295) 同源性高達 99%，命名為 Sphingomonas sp. Strain DX-T3-03。所述的鞘氨醇單胞菌Sphingomonas sp. Strain DX-T3-03為革蘭氏陰性短桿菌， 好氧，菌體大小約為(0. 4 0.6) μ mX (1.0 2.0) μ m，其電鏡掃面見圖4;在固體培養基 中菌落呈圓形，凸起，乳白略帶淡黃色，表面光滑溼潤，不透明，邊緣規則整齊，極易挑起；最 適生長條件PH為6. 7左右，溫度為30 35°C，搖床震蕩速率為150r/min。該鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas sp. strain DX-T3-03)可以有效地對重金屬鋅進 行生物吸附和生物積累，能夠在最高濃度為55mM/L鋅濃度固體平板中生長，並且12h培養 後就能在25mM/L鋅濃度的培養液中良好生長。該鞘氨醇單胞菌(Sphingomonassp. Strain DX-T3-03)能將濃度為 0. 2、0. 4、 0. 6g/L的苯酚，在24h內幾乎完全降解；苯酚濃度0. 8、1. Og/L時，能在36h降解率達70% 左右；要完全降解1. 2g/L苯酚，還需要一定時間，說明該菌株對苯酚有較好的降解能力，並 且加入4mM/LZn2+並不會對該菌降解苯酚產生明顯抑制作用，這對菌株在含重金屬汙染的 含酚工業廢水的處理應用中的作用十分重要。Sphingomonas sp. Strain DX-T3-03具有降解苯酚及抗重金屬的雙重功效，由於 重金屬與汙染物的共存抑制了汙染物降解菌的降解能力。因此，在重金屬汙染的極端環境 中，只具有降解有機物汙染單一能力的細菌將難以發揮其降解效能，而此菌株的篩選為利 用耐重金屬的苯酚降解菌進行生物修復提供了參考。有益效果本發明的菌株對鋅的耐受性高達4mM/L的同時，苯酚的降解率高達88%，營養要 求不高，對苯酚有較好的降解能力，在生物治理含酚工業廢水和重金屬雙重汙染中具有重 要應用潛力；提取方法簡便快捷，成本低，對環境友好。


圖1為苯酚的分子結構式；圖 2 為 Sphingomonas sp. Strain DX-T3-03 的 16S rDNA 序列的鑑定結果；圖 3 為 Sphingomonas sp. Strain DX-T3-03 遺傳發育樹圖；圖 4 為 Sphingomonas sp. Strain DX-T3-03 的掃描電鏡圖；圖5為添加4mM/L重金屬鋅時細菌對不同濃度苯酚降解率圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明 而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定
6的範圍。實施例1(1)取某礦山尾礦壩取土製成土壤懸液按5襯％的接入量接種於以苯酚為唯一 碳源的含鋅無機鹽培養基中，其中無機鹽培養基為(NH4)2SO4 10. 0g, KH2PO4 7. 5g, Na2HPO4 10. 0g, FeCl3 0. 0125g，MgSO4 · 7H20 0. 015g，蒸餾水 lOOOmL，pH = 6. 5 7. 0。同時加入 梯度濃度的濾菌苯酚和濾菌Zn2+溶液，使培養基中同時含有苯酚和Zn2+且兩種物質濃度均 依次升高，為苯酚 500、600、700、800、900、1000mg/L，Zn2+濃度 0. 5,1. 0,1. 5,2. 0,2. 5,3. 0、 3. 5,4. OmM/L，改變濃度的間隔時間為6 7d，於30 35°C，振蕩速率150r/min條件下進 行馴化培養2個月；(2)取馴化2個月後的樣品，靜置30分鐘，取上層水樣lmL，作10—1 10,梯度稀 釋。每種稀釋濃度分別取ImL菌液於培養皿內，倒入固體培養基後將培養皿放在桌上，來回 轉動培養皿後，將培養皿倒置於30°C培養箱中培養48h，挑取形態清晰的單一菌落，編號， 在固體培養基上劃線，將培養皿倒置於30°C培養箱中培養48h，再觀察結果，反覆幾次，並 在電子顯微鏡下觀察，確保是純的單一菌株後，將分離出的菌種接種到斜面培養基上，4°C 下保存於冰箱中待後續進行降解試驗。其中固體培養基為富集液體培養基基礎上加入質量 分數1. 5%的瓊脂，1 X IO5Pa滅菌30min，冷卻後而形成的培養基，其中富集液體培養基為蛋 白腖0. 25g，胰蛋白腖0. 25g，酵母粉0. 5g，葡萄糖0. 5g，MgSO4 ·7Η20 0. 03g,蒸餾水IOOOmL, pH = 6. 5 7. 0。斜面培養基為將固體培養基加熱溶化，取乾淨的試管，試管中倒入約5mL 固體培養基，將試管口端放在玻璃棒上，使管內培養基形成斜面而形成；(3)分別挑取經分離純化後的單一菌落於無機鹽培養基中，各無機鹽培養基中均 含有0. 6g/L的苯酚和4mM/L Zn2+，在30°C、150r/min、250mL錐形瓶中裝填量IOOmL的條件 下進行培養，培養時間為24h，培養後通過電子顯微鏡觀察細菌生長情況以及測定溶液中苯 酚的剩餘濃度，從而確定出具有抗鋅特性的苯酚高效降解菌株。本菌株在初始pH值為6. 7左右，溫度為30°C，振蕩速率為150r/min，250mL錐形瓶 的裝液量為IOOmL的條件下，苯酚初始濃度為0. 6g/L，重金屬Zn2+為4mM/L培養時間24h， 然後利用4-氨基安替比林法對苯酚濃度進行測定，測定波長為510nm;苯酚的降解率高達 88%。
權利要求
一種鞘氨醇單胞菌DX T3 03菌株，其特徵在於該菌株對鋅具有高抗性並且具有降解苯酚能力；其16S rDNA序列如下CCAATGGCGGCTGCCTACACATGCAGTCGAACGAGATCTTCGGGTCTAGTGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTGGGAATCTGCCCTTTGGTTCGGAATAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGGATGATGACGAAAGTCCAAAGATTTATCGCCAGAGGATGAGCCCGCGTAGGATTAGCTAGTTGGTGTGGTAAAGGCGCACCAAGGCGACGATCCTTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTTACCCGGGATGATAATGACAGTACCGGGAGAATAAGCTCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGAGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGCTTTGTAAGTTAGAGGTGAAAGCCTGGAGCTCAACTCCAGAACTGCCTTTAAGACTGCATCGCTTGAATCCAGGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGACTGGTATTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGATAACTAGCTGTCCGGGGACTTGGTCTTTGGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTATCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCTGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCGTTTGACATGTCCGGACGATTTCCAGAGATGGATCTCTTCCCTTCGGGGACTGGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCTTTAGTTACCATCATTTAGTTGGGGACTCTAAAGGAACCGCCGGTGATAAGCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGCGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGTGACAGTGGGCAGCAAACTCGCGAGAGTGCGCTAATCTCCAAAAGCCGTCTCAGTTCGGATTGTTCTCTGCAACTCGAGAGCATGAAGGCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCAGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGGTTCACCCGAAGGCGTTGCGCTAACTCGCAAGAGAGGCAGGCGACCACGGTGCTAGCGTGT。
2.一種鞘氨醇單胞菌DX-T3-03菌株的提取方法，包括(1)定向馴化在礦區取土製成土壤懸液按5wt%的接入量接種於無機鹽培養基中，以梯度壓力式馴 化法馴化2個月；(2)菌株的富集分離和純化將上述馴化後的樣品靜置，取上層水樣作梯度稀釋，然後每種稀釋濃度分別取ImL菌 液於接種到固體培養基進行富集培養；將培養的純的單一菌株，接種到斜面培養基，即可。
3.根據權利要求2所述的一種鞘氨醇單胞菌DX-T3-03菌株的提取方法，其特徵在於 所述步驟(1)中的無機鹽培養基為(NH4) 2504 10. 0g, KH2PO4 7. 5g, Na2HPO4 10. 0g, FeCl3 0. 0125g, MgSO4 · 7H20 0. 015g,蒸餾水 IOOOmL, pH = 6· 5 7· 0。
4.根據權利要求2所述的一種鞘氨醇單胞菌DX-T3-03菌株的提取方法，其特徵在 於所述步驟(1)中的梯度壓力式馴化法為在無機鹽培養基中，同時加入梯度濃度的濾菌 苯酚和濾菌Zn2+溶液，使培養基中同時含有苯酚和Zn2+且兩種物質濃度均依次升高，即苯酚 300、400、500、600、700、800、900、1000mg/L，Zn2+ 濃度 0. 5,1. 0,1. 5,2. 0,2. 5,3. 0,3. 5、 4. OmM/L,改變濃度的間隔時間為6 7d，於30 35°C，振蕩速率150r/min條件下進行馴化培養。
5.根據權利要求2所述的一種鞘氨醇單胞菌DX-T3-03菌株的提取方法，其特徵在於 所述步驟⑵中的梯度稀釋為10—1 10,的梯度稀釋。
6.根據權利要求2所述的一種鞘氨醇單胞菌DX-T3-03菌株的提取方法，其特徵在 於所述步驟(2)中的固體培養基為富集液體培養基基礎上加入質量分數1. 5%的瓊脂， IX IO5Pa滅菌30min，冷卻後而形成的培養基，其中富集液體培養基為蛋白腖0. 25g，胰蛋白 腖 0. 25g，酵母粉 0. 5g，葡萄糖 0. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 03g，蒸餾水 lOOOmL，pH = 6. 5 7. 0。
7.根據權利要求2所述的一種鞘氨醇單胞菌DX-T3-03菌株的提取方法，其特徵在於 所述步驟(2)中富集培養是指將菌液於接種到富集培養基後於30°C培養箱中培養48h，挑 取形態清晰的單一菌落，編號，在固體培養基上劃線，將培養皿倒置於30°C培養箱中培養 48h，再觀察結果，在電子顯微鏡下觀察菌落形態，反覆2 4次，確保長出純的單一菌株。
全文摘要
本發明涉及一種鞘氨醇單胞菌DX-T3-03菌株及其提取方法，該菌株對鋅具有高抗性並且具有降解苯酚能力。本發明的菌株從礦山尾礦壩土壤中分離提取，對鋅的耐受性高達4mM/L的同時，苯酚的降解率高達88％，營養要求不高，在生物治理含酚工業廢水和重金屬雙重汙染中具有重要應用潛力；提取方法簡便快捷，成本低，對環境友好。
文檔編號C12R1/01GK101974471SQ20101054158
公開日2011年2月16日 申請日期2010年11月12日 優先權日2010年11月12日
發明者付瑾, 張濤, 張萌, 張 誠, 柳建設, 王志樓, 王慧萍, 謝學輝, 鄭青鳳 申請人:東華大學