一種含有海洋深層水的保健飲用液在製備預防或治療代謝綜合症的藥物或保健品中的應用的製作方法

2023-06-11 08:34:46 1

專利名稱：一種含有海洋深層水的保健飲用液在製備預防或治療代謝綜合症的藥物或保健品中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於海洋生物技術領域，涉及到海洋深層水的綜合利用，具體涉及ー種含有海洋深層水的保健飲用液在製備預防或治療代謝綜合症的藥物或保健品中的應用。
背景技術：
代謝綜合症是ー組以中心性肥胖、高血糖(糖尿病或糖調節受損)、高血脂以及高血壓等聚集發病，嚴重影響機體健康的臨床症候群，以多種代謝性疾病合井出現為臨床特點，是ー組在代謝上相互關聯的危險因素的組合。近年來，隨著經濟迅速發展、生活和飲食方式西化，代謝綜合症的患病率升高。代謝綜合症日漸成為我國，尤其是大中城市重要的公 共衛生問題。研究表明，胰島素抵抗(IR)是代謝綜合症的發病基礎，胰島素抵抗已成為近年來醫學領域的ー個研究熱點。胰島素抵抗是指一定量的胰島素與其特異性受體結合後生物效應低於正常，即生理濃度的胰島素沒有達到預期的效應，主要表現為胰島素抑制肝臟釋放葡萄糖的能力及促進周圍組織(主要是骨骼肌和脂肪)攝取和利用葡萄糖的能力下降。肝臟是胰島素抵抗的關鍵器官。肝臟胰島素抵抗主要是指胰島素抑制肝臟葡萄糖輸出的能力下降。肝糖輸出主要是由糖異生和糖原分解兩部分組成。糖異生是指非糖物質如乳酸、烯丙醇、生糖胺基酸、甘油等合成葡萄糖；糖原分解是指動用儲存在肝臟中的糖原提供葡萄糖。肝臟作為胰島素作用的主要靶器官，維持空腹狀態下的內生性糖的產生和輸出及進食後糖的吸收、利用和存儲。近年來對肝臟胰島素抵抗機制的研究已成為熱點。IRS-2/PI3K信號是胰島素在肝臟發揮生理效應的主要信號轉導通路。在動物或人類進食後，由胰島P細胞分泌產生的胰島素入血作用於肝細胞膜表面的胰島素受體(InsR)，使其位於胞漿內的P亞基的酪氨酸位點自磷酸化激活。激活的胰島素受體使胰島素受體底物(IRS-2)酪氨酸位點磷酸化後激活，進而激活磷脂醯肌醇3激酶(PI3K)，激活後的PI3K可以催化4，5- ニ磷酸磷脂醯肌醇(PIP2)生成三磷酸磷脂醯肌醇(PIP3)，其作為第二信使激活蛋白激酶B(Akt)，活化的Akt通過以下幾個途徑參與發揮胰島素的代謝調節作用(1)通過對細胞內葡萄糖運載體GLUT4囊泡的易位有重要作用。在胰島素刺激下，GLUT4囊泡從細胞內池移動到細胞膜，然後與膜融合，將GLUT4分子固定在細胞膜上，從而發揮轉運葡萄糖的作用；(2)通過糖原合成酶激酶-3(GSK-3)促進糖原合成。GSK-3是第一個被發現的PKB/Akt的生理底物，PI3K、PDK, Akt和GSK3形成了胰島素調節糖原合成的信號級聯繫統中的ー個重要支路。兩種形式的GSK3的異構體GSK3a和GSK3 P的氨基端都含有Akt的磷酸化位點，胰島素通過磷酸化和失活GSK3促進糖原合成；(3)抑制糖異生基因葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)的表達及糖異生，最終降低血糖。胰島素受體信號轉導缺陷是IR發生的主要原因，正常胰島素信號傳導的關鍵是各種激酶蛋白上的酪氨酸磷酸化過程。在絕大多數胰島素抵抗中，胰島素受體的酪氨酸磷酸化基本正常，發生胰島素抵抗的關鍵部位是IRS，其中IRS-1、IRS-2作為InsR後的主要信號蛋白，其基因表達的降低、蛋白表達的減少及磷酸化障礙都會造成其對PI3K的激活作用明顯下降，由此妨礙了胰島素信號傳導通路下遊信號的傳導而導致IR。能量代謝平衡失調是IR發生的重要原因。磷酸腺苷(AMP)激活的蛋白激酶(AMPK)信號通路是調節細胞能量狀態的中心環節，能感知細胞能量代謝狀態的改變，並通過影響細胞物質代謝的多個環節維持細胞能量供求平衡。AMPK磷酸化後激活，活性AMPK激活其下遊的多種靶分子，從而達到關閉合成代謝途徑，開啟分解代謝途徑的效果。在骨骼肌，使葡萄糖攝取和脂肪酸氧化增加，並促進線粒體的生物合成；在肝臟，抑制葡萄糖和脂質的合成，促進脂質氧化；在脂肪組織，減少了脂質分解和脂質生成。反之，當AMPK去磷酸化失活時，機體合成代謝佔主導地位，細胞內脂質、糖原合成増加。正常生理狀態下，激活的AMPK調控其下遊信號傳導通路，一方面増加GLUT4的轉位而增強骨骼肌對胰島素的反應，運動 和ニ甲雙胍就是通過這條途徑改善2型糖尿病患者；另一方面，活性AMPK可以抑制羥甲基戊ニ酸單醯輔酶A還原酶(HMGCR)、こ醯輔酶A羧化酶(ACC)等脂質合成酶活性，降低固醇調節元件結合蛋白(SREBP)-Ic和脂肪酸合酶(FAS)的表達，從而抑制脂肪合成，同時增加脂肪酸氧化途徑，減少肝臟內脂質含量。此外，AMPK途徑激活後，下遊可以通過增強線粒體功能、促進線粒體増殖而促進能量利用。因此，AMPK途徑損壞會導致機體IR和脂質異位沉積。氧化應激是胰島素抵抗發生與發展的ー個重要原因。長期的高血糖、高血脂可導致線粒體產生大量活性氧簇(R0S)，大量ROS的產生和積聚在組織，如不能被組織內的抗氧化系統清除，就會通過IKK、NF-k B、P38MAKP、JNK/SAPK等系統的活化，幹擾細胞胰島素受體信號轉導以及下遊的信號通路如Akt，胰島素受體及受體底物磷酸化，最終導致胰島素抵抗。礦物元素在IR的發生、發展過程中發揮重要作用。如Sudres等通過實驗發現鎂缺乏與胰島素受體酪氨酸激酶的活性降低有關；鉻可以通過調節胰島素基因表達影響胰島素的含量、增加胰島素受體數量、提高胰島P細胞敏感性、增強胰島素的結合力、增強胰島素內攝和激活胰島素受體酪氨酸激酶來增加胰島素敏感性；鋅、硒則可以通過提高機體的抗氧化能力而加快自由基的清除而抑制氧化應激，從而改善胰島素抵抗。海洋深層水通常是指陽光照射不到，不能進行光合作用，約200m深度以下的海水。海洋深層水處於無陽光進入的海洋無光層，而且遠離來自人類、陸地以及大氣的化學物質的影響和汙染。研究表明，海洋深層水具有以下幾個主要特點(I)低溫恆定性-不受陽光照射，不像海洋表層水溫度變化無常，海洋深層水終年溫度不變，恆定於5°C左右；(2)礦物元素豐富且穩定性-與海洋表層水相比，海洋深層水富含人體所必需的鈣、鎂、鉀、鈉、鐵、銅、鋰、鑰、錳、鋅、鍺、碘、磷、氟、硒、三價鉻、矽酸根離子等92種礦物元素，涵蓋了人體新陳代謝所需的元素種類。除了其含量豐富外，由於這些水以漫長的時光流動於「無光層」的海洋深層，無光合作用發生、不受外界影響，因此所含礦物元素的成分十分穩定，完美地解決了人體平衡攝取各種所需礦物元素的要求；(3)無菌清潔性-處於海洋「無光層」的深層水，除了遠離人類現代文明的影響以及不受陸地、大氣化學物質、病菌的汙染外，本身也無生成病原菌等細菌的條件。因此，海洋深層水是非常清潔的無菌自然之水；(4)海洋深層水水質呈弱鹼性。
由於具有以上特點，海洋深層水作為ー種新的天然資源正在受到世人的矚目。海洋深層水富含各種礦物質和微量元素，理論上它對胰島素抵抗及代謝綜合症具有很好的改善作用。我國海域寬廣，海岸線漫長，海洋資源豐富，但尚無海洋深層水開發應用方面的研究；而且我國水資源緊缺，水汙染嚴重，開發我國的海洋深層水資源具有十分重要的意義。我國海域寬廣，海岸線漫長，海洋資源豐富，但尚無海洋深層水開發應用方面的研究；而且我國水資源緊缺，水汙染嚴重，開發我國的海洋深層水資源具有十分重要的意義。

發明內容
針對目前我國水資源日益緊缺、水汙染日趨嚴重且代謝綜合症發病率急劇升高等熱點問題，本發明提供了ー種含有海洋深層水的保健飲用液在製備預防或治療代謝綜合症的藥物或保健品中的應用。為實現上述發明目的，本發明採用下述技術方案予以實現ー種含有海洋深層水的保健飲用液在製備預防或治療代謝綜合症的藥物或保健品中的應用，所述保健飲用液包括A液和B液，所述A液為淡水，所述B液經以下步驟製得海洋深層水經反滲透裝置後分離出的濃水部分，將濃水部分進行減壓濃縮，使其體積濃縮至原來體積的0. 67-3. 33%，然後過濾除去析出的氯化鈉，得到的高度濃縮液即為B液，所述保健飲用液的硬度在200-1000ppm，所述海洋深層水為海平面500m以下且經脫鹽處理後的海水。對上述技術方案的進ー步改進所述保健飲用液中鎂鈣鉀鈉元素的濃度比值為2. 5-3. 5 0.45-1 0.3-1 0. 3-1. 5，不含有機物，且水質呈弱鹼性。對上述技術方案的進ー步改進所述鎂鈣鉀的濃度最優比為3 : I : I。對上述技術方案的進ー步改進所述保健飲用液的水質呈弱鹼性，25°C測定的pH值 I. 5±0. 3。對上述技術方案的進ー步改進所述保健飲用液中的有益元素含量為鋅0. 0325-16. 4 u g/L ;硒 0. 0395-0. 712 y g/L ;鉻 0. 104-4. 54 u g/L ;錳 0. 156-5. 52 u g/L。對上述技術方案的進ー步改進所述保健飲用液中的有害元素含量為鉛
<5 u g/L ;萊< 0. 5 y g/L ;砷< 5 u g/L ;鎘< I u g/L。對上述技術方案的進ー步改進所述海洋深層水取自於距離海岸線20km以外。對上述技術方案的進ー步改進所述淡水來源於海洋深層水經反滲透裝置循環後分尚出的淡水。對上述技術方案的進ー步改進日常飲食對礦物質的攝取較少的代謝綜合症患者選用硬度為600-1000ppm的保健飲用液，反之選擇硬度為200-400ppm的保健飲用液。與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是本發明提供的含有海洋深層水的保健飲用液富含有益微量元素鎂、鈣、釩、鉻、錳、鋅、硒，而有毒微量元素汞和鉛的含量很低，本發明通過生物實驗表明，該保健飲用液在細胞水平上沒有毒性，安全性高，而且可以促進糖原的合成，從而減少肝糖輸出；可以通過激活AMPK抑制肝臟內的脂質合成途徑而改善胰島素抵抗；還可以通過增強機體的抗氧化能カ而改善胰島素抵抗。通過這些途徑顯著調節胰島素信號通路，對代謝綜合症等代謝性疾病具有較好的預防和治療作用。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發明的技術方案作進ー步詳細的說明。實施例I一、保健飲用液的製備本發明所述保健飲用液的製備方法如下
I)海洋深層水預處理將取自距離海岸線20km以外，海平面500m以深的海洋深層水放入儲水罐中，採用濾器過濾，除去海水中的浮遊植物及微生物，並通過活性炭過濾器過濾，進ー步除去有機物。2)淡水和濃水分離將預處理後得到的海洋深層水通過高壓泵進入反滲透裝置將海洋深層水分為淡水部分和濃水部分(淡水部分水質與純浄水相同，或水質接近純淨水；濃水部分中各種陰陽離子的濃度接近原海水中各種離子濃度的2倍)，分離出的淡水部分即A液進入淡水儲水罐，分離出的濃水部分進入濃水儲水罐。反滲透裝置的エ藝參數為運轉壓4MPa，功率I. 5KW，產水量IT/d。3)濃水脫鈉處理將濃水儲水罐中的濃水部分進行減壓濃縮，使其體積濃縮至原來體積的0. 67-3. 33%，然後過濾除去析出的氯化鈉，得到高度濃縮的濃縮液即為B液，所述濃縮液中鎂鈣鉀鈉元素的濃度比值為2. 5-3. 5 0. 45-1 0. 3-1 0. 3-1. 5，所述鎂、鈣、鉀、鈉元素在濃縮液中的含量濃度單位為mg/L。其中微量元素鉻，鋅，硒，錳等的濃度與濃縮倍數呈倍比關係。或者，也可以採用選擇性電滲析對反滲透後分離出的濃水部分進行脫鈉處理，電滲析裝置採用I價陽離子選擇性透過膜，陰膜採用普通離子交換膜。在電滲析過程中所有陰離子都可透過陰膜，僅單價陽離子透過陽膜，脫鈉之後的濃水中的多價陽離子與原濃水中的濃度相近。4)保健飲用液灌裝將經過步驟I)反滲透裝置出來的淡水A液和步驟3)所得到的B液可以按照需求混合製得不同硬度的保健飲用液，所述硬度以CaCO3的含量計算(GB5749-2006生活飲用水衛生標準)，其計算公式為硬度=Ca (ppm)) X2. 5+Mg(ppm) X 4. 1，經過高溫滅菌，分裝即可。採用電感耦合等離子質譜(ICP-MS)對保健飲用液中的無機元素含量進行測定以硬度為1000的保健飲用液為例，其中幾種主要礦物質及微量元素含量為鎂200-224mg/L ;鈣33-67mg/L ;鉀20-67mg/L ;鈉:20_100mg/L(鈉的含量越低越好);鋅
0.0325-16. 4 u g/L ；硒:0. 0395-0. 712 y g/L ;鉻:0. 104-4. 54 u g/L ；錳 0. 156-5. 52 u g/L,鉛< 5 u g/L ;汞< 0. 5 u g/L ;砷< 5 u g/L ;鎘< I y g/L。本發明所述200-1000硬度下的保健飲用液中礦物質及微量元素含量與其硬度成正比。所述保健飲用液中鎂I丐鉀鈉元素的濃度比值為
2.5-3.5 0. 45-1 0.3-1 0. 3-1. 5，富含有益微量元素鋅，硒，鉻，錳，有毒微量元素鉛，汞，神，鎘含量較低，不含有機物，且水質呈弱鹼性。所述有益微量元素含量如下鋅:0.0325-16. 4 U g/L； :0. 0395-0. 712 U g/L ；鉻0. 104-4. 54 u g/L M 0. 156-5. 52 u g/L。所述有毒微量兀素含量如下鉛< g/L ;萊< 0. 5 u g/L ;砷< 5 ii g/L ；鎘<1 U g/L。使用pH計對其pH值進行測定(25°C )，結果表明保健飲用液pH值在7. 5±0. 3範圍內，水質呈弱鹼性。ニ、保健飲用液對胰島素信號通路及胰島素抵抗的改善作用及機制I、實驗方法I)細胞培養人肝癌細胞H印G2細胞，細胞培養基為含10%胎牛血清的低糖DMEM(5. 5mmol/L)培養基，培養環境為37°C、5% CO2，每3天按I : 3比例傳代一次。2)保健飲用液對H印G2細胞的細胞毒性收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度接種於96孔板，每孔10000個細胞。37°C、5% CO2培養，待細胞匯合度達70%吋，換為不含血清的DMEM，飢餓過夜，然後加入如表I所示不同硬度的保健飲用液，每個濃度設6個平行孔。繼續培養24h，每孔加入新鮮配製的20 ii L MTT (5mg/mL)，繼續培養4h。然後吸掉上清，每孔加入150 ii L DMS0，低速振蕩lOmin，充分溶解結晶物，用酶聯免疫檢測儀在570-630nm測OD值，記錄結果，計算細胞的抑制率。3)胰島素抵抗H印G2(IR_H印G2)細胞模型的建立及給藥處理取對數生長期的HepG2細胞，用含10% FBS的DMEM培養液配成單個細胞懸液，根據實驗要求，按細胞密度為1.0父106(^11/111し接種於不同孔徑培養板中，培養箱37で，5(%ニ氧化碳條件下孵育。待細胞匯合度至70%，換為不含血清的DMEM培養液飢餓過夜，然後換為低糖(5. 5mmol/L)或高糖(30mmol/L)的無血清培養基繼續孵育24h。在低糖培養基中孵育的H印G2細胞為空白對照細胞，在高糖培養基中孵育的H印G2細胞為IR-HepG2細胞。在建立胰島素抵抗模型的同時給予不同硬度的保健飲用液，觀察保健飲用液對胰島素抵抗的預防作用。檢測胰島素信號通路相關蛋白表達時，收穫細胞前，IOOnM胰島素刺激lOmin。4)保健飲用液對IR_HepG2細胞糖輸出量的影響藥物孵育24h後，用無糖DMEM培養基洗滌細胞3次，然後加入葡萄糖輸出培養基(含有2mM丙酮酸鈉和20mM乳酸鈉的無糖無酚紅DMEM)繼續孵育16h，其中最後3h加入InM胰島素。孵育結束後，取上清測定葡萄糖含量，板中下層細胞裂解後BCA法測定蛋白含量。5)保健飲用液對IR-H印G2細胞糖原含量的影響藥物孵育24h後，PBS洗滌細胞，加入含有In M胰島素的培養基繼續孵育3h，棄去培養液，預冷PBS洗2次，細胞刮刮取，12000r/min，4°C離心15min，棄上清，細胞沉澱中加入0. 5mL 30% KOH，置100°C水浴20min，取出IOii L用BCA法測定蛋白含量，其餘加入1.5mL無水こ醇，過夜，4000r/min離心15min,棄上清,沉澱中加入蒸懼水0. 5mL,隨後加入ImL 0.2%蒽酮(0. 2g蒽酮溶於IOOmL98%硫酸)，100°C水浴20min。酶標儀檢測620nm波長處OD值，同時配製100、50、25、12. 5、6. 25,3. 125及I. 56 u g/mL的葡萄糖溶液，做糖濃度標準曲線。6)保健飲用液對IR_HepG2細胞脂質含量的影響藥物孵育24h後，吸除剰餘培養液，冰PBS洗2遍，加入100 ii L細胞裂解液，吹打均勻，冰水中孵30分鐘，期間不斷用細胞刮塗抹，使裂解液和細胞充分接觸；將裂解液轉移至I. 5mL ep管中，低溫超聲破碎IOs ；12000rpm，15min，4°C離心，_20°C冷凍保存，取少量細胞溶解液用BCA法測定蛋白質含量，其餘用於檢測細胞內的脂質含量。分別測定細胞內膽固醇和甘油三酯的含量単位以每毫克蛋白質含量O g/mg protein)計算。7)保健飲用液對IR_HepG2細胞胞內ROS含量的影響使用活性氧檢測試劑盒測定胞內ROS含量。依據說明書操作，藥物作用24h後，胰酶消化收穫細胞，PBS洗3次，重懸於 10 y M 2, 7-dichlorodihydrof luorescein diacetate (DCFH-DA),然後 37°C孵育 30min,螢光分光光度計測定胞內ROS含量，激發波長488nm，發射波長525nm。8) western blot檢測保健飲用液對胰島素信號通路、AMPK信號通路及JNK信號通路等相關蛋白的表達及磷酸化程度的影響細胞裂解液用BCA法測定蛋白濃度，等量上樣，10%分離膠 SDS-PAGE，轉膜 lh, 5% BSA 封閉 2h 後加入 IRS-2、pIRS-2 (Tyr612)、Akt、pAkt(Ser473)、GSK-3、G6Pase、AMPK、pAMPK、pHMGCR、pACC、SREBP-1、1 JNK、pJNK、actin 等ー抗工作液，4°C搖動過夜。ー抗孵育之後，TBST洗膜，加入I 5000稀釋的辣根過氧化物酶標記的ニ抗工作液，室溫搖動lh，ECL顯色。9)統計學處理數據均以均數土標準差表示,組間差異採用t檢驗方法進行。2、實驗結果 I)保健飲用液對H印G2細胞增殖的影響由表I可以看出，不同硬度的保健飲用液對HepG2細胞的増殖基本無影響，因此可用於下一歩實驗。表I :保健飲用液對H印G2細胞増殖的影響
權利要求
1.ー種含有海洋深層水的保健飲用液在製備預防或治療代謝綜合症的藥物或保健品中的應用，所述保健飲用液包括A液和B液，所述A液為淡水，所述B液經以下步驟製得 海洋深層水經反滲透裝置後分離出的濃水部分，將濃水部分進行減壓濃縮，使其體積濃縮至原來體積的0. 67-3. 33%，然後過濾除去析出的氯化鈉，得到的高度濃縮液即為B液，所述保健飲用液的硬度在200-1000 ppm，所述海洋深層水為海平面500m以下且經脫鹽處理後的海水。
2.根據權利要求I所述的ー種含有海洋深層水的保健飲用液在製備預防或治療代謝綜合症的藥物或保健品中的應用，其特徵在於所述保健飲用液中鎂鈣鉀鈉元素的濃度比值為2. 5-3. 5 :0. 45-1 :0. 3-1 :0. 3-1. 5，不含有機物，且水質呈弱鹼性。
3.根據權利要求2所述的ー種含有海洋深層水的保健飲用液在製備預防或治療代謝綜合症的藥物或保健品中的應用，其特徵在於所述鎂鈣鉀的濃度最優比為3:1:1。
4.根據權利要求2所述的ー種含有海洋深層水的保健飲用液在製備預防或治療代謝綜合症的藥物或保健品中的應用，其特徵在於所述保健飲用液的水質呈弱鹼性，25°C測定的 pH 值 7.5±0.3。
5.根據權利要求I所述的ー種含有海洋深層水的保健飲用液在製備預防或治療代謝綜合症的藥物或保健品中的應用，其特徵在於所述保健飲用液中的有益元素含量為鋅0. 0325-16. 4 l^g/L ;硒 0. 0395-0. 712Pg/L ;鉻 0. 104-4. 54 l^g/L ;錳 0. 156-5. 52吒/し
6.根據權利要求I所述的ー種含有海洋深層水的保健飲用液在製備預防或治療代謝綜合症的藥物或保健品中的應用，其特徵在於所述保健飲用液中的有害元素含量為鉛〈5/L ;萊 < 0. 5I^g /L ;砷 < 5Mg/L ;鎘 < IMg /し
7.根據權利要求I所述的ー種含有海洋深層水的保健飲用液在製備預防或治療代謝綜合症的藥物或保健品中的應用，其特徵在於所述海洋深層水取自於距離海岸線20km以外。
8.根據權利要求I所述的ー種含有海洋深層水的保健飲用液在製備預防或治療代謝綜合症的藥物或保健品中的應用，其特徵在於所述淡水來源於海洋深層水經反滲透裝置循環後分尚出的淡水。
9.根據權利要求I所述的ー種含有海洋深層水的保健飲用液在製備預防或治療代謝綜合症的藥物或保健品中的應用，其特徵在於日常飲食對礦物質的攝取較少的代謝症候群患者選用硬度為600-1000 ppm的保健飲用液，反之選擇硬度為200-400 ppm的保健飲用液。
全文摘要
本發明提供了一種含有海洋深層水的保健飲用液在製備預防或治療高脂血症的藥物或保健品中的應用，保健飲用液包括A液和B液，A液為淡水，所述B液為海洋深層水經反滲透裝置分離出的濃水部分，再經減壓濃縮得到的高濃度濃縮液，硬度範圍為200-1000ppm。該保健飲用液可以在體外水平上調節胰島素信號通路，改善胰島素抵抗，從而預防代謝綜合症。該保健飲用液來源於海洋深層水，具有資源豐富，易於產業化等優點，在代謝綜合症的防治方面具有廣闊的市場和應用前景。
文檔編號A61P3/10GK102652757SQ20121011460
公開日2012年9月5日 申請日期2012年4月18日 優先權日2012年4月18日
發明者何珊, 劉紅兵, 李春霞, 李海花, 管華詩, 郝傑傑 申請人:中國海洋大學