絲狀真菌啟動子、終止子和包含它們的質粒的製作方法

2023-06-11 21:31:56

專利名稱：絲狀真菌啟動子、終止子和包含它們的質粒的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，尤其涉及一種絲狀真菌啟動子、終止子和包含它們的質粒。
背景技術：
稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)是一種研究植物病原真菌-寄主植物相互作用的絲狀真菌模式生物，具有許多病原真菌共有的植物致病侵染循環，包括孢子產生、萌發、 附著胞形成、侵染栓形成、侵入菌絲生長等致病過程。由稻瘟病菌引起的稻瘟病是世界性的一種水稻上的毀滅性病害。世界上每年由稻瘟病造成的水稻產量損失在10 30%之間； 我國幾乎每年都有稻瘟病菌的流行爆發。許多發達國家正在進行研究其致病分子機制，期望通過此類研究開發具有抗瘟特徵的水稻品種，以及開發、設計新型抗真菌藥物。稻瘟病菌的致病過程是一個複雜的分子過程。目前已經克隆了許多與稻瘟病菌致病性相關的基因，如MPG1、CPKA, PMKU MAGB, PLSl、SMOl、PDEl、MPSl、PTHll、CBPl、ICLl、 BUFl、ALBl、ACRl、RSYl、HEXl、ATGs, MNH6 等(Nguyen et al.，2008 ；Egan et al.，2007 ； Veneault-Fourrey et al. , 2006 ；Dean,2005 ；Soundararajan et al. , 2004 ；Talbot,2003 ； Talbot, 1999 ；Choi and Dean, 1997 ；Mitchell & Hamer，1995 等)。儘管如此，稻癌病菌的分子致病機制還是不很清楚，絕大多數的基因功能還未知。鑑定、克隆植物病原真菌的致病性基因，尤其是與侵入過程相關的基因，可以為開發具有抗瘟特徵的水稻品種，以及設計、篩選抗真菌藥物提供有用的參考。目前根據稻瘟病菌無毒基因和水稻抗病基因的互作關係，選育了很多水稻抗瘟品種；也已經在包括稻瘟病菌在內的一些真菌中證明了一些藥物的靶點，如三環唑是一種很重要的稻瘟病菌殺菌劑， 其作用是抑制黑色素的合成，靶點是稻瘟病菌的三羥萘還原酶；多肽殺菌劑sorphenA的作用靶點是青黴的脫甲基酶(CYP51)。鑑定、克隆植物病原真菌的致病性基因，需要分析蛋白在細胞內的定位、蛋白過量表達對植物病原真菌的作用等，這都需要一種絲狀真菌細胞內蛋白快速表達和高效表達的系統。目前，每個基因研究還都需要各自建立一個基因表達系統(如NAR啟動子；RP27啟動子)，缺少高效的、通用的絲狀真菌蛋白表達系統。

發明內容
本發明提供了一種絲狀真菌啟動子，利用該啟動子可以在絲狀真菌菌絲、分生孢子、附著孢等各個階段高豐度表達蛋白、RNA或DNA。一種絲狀真菌啟動子(或者互補鏈)，具有SEQ ID N0.1所示的鹼基序列。一種絲狀真菌終止子(或者互補鏈)，具有SEQ ID N0. 2所示的鹼基序列。本發明提供了包含上述啟動子和/或終止子的質粒。該質粒可以是原始表達載體，該原始表達載體含有抗性基因SUR或抗性基因ΝΕ0， 也可以是重組表達載體；也可以是重組表達載體，其外源基因為GFP蛋白基因或紅色螢光蛋白基因。本發明提供了上述質粒在絲狀真菌中表達蛋白、DNA或RNA中應用。本發明提供了包含上述質粒的轉化子。本發明啟動子是一個強啟動子，在稻瘟病菌的菌絲、孢子和附著胞階段都高強度啟動。該啟動子基因屬於表達強度在稻瘟病菌細胞內穩定性在前100位以內的基因。該基因是一個清除細胞內活性氧的重要基因，對於維持細胞的正常運轉具有重要作用。該基因在活性氧誘導下可以大量誘導表達，用於合成大量的重組蛋白。


圖1是pKD6表達載體的構建過程示意圖。pKD6質粒具有卡那黴素(Kana)抗性和磺胺嘧啶(SUR)抗性篩選標記。圖2是pKD6-GFP表達載體的構建過程示意圖。pKD6_GFP質粒具有卡那黴素 (Kana)抗性和磺胺嘧啶(SUR)抗性篩選標記，含有eGFP綠色螢光基因。圖3是pKD6-DsRED表達載體的構建過程示意圖。pKD6_DsRED質粒具有卡那黴素 (Kana)抗性和磺胺嘧啶(SUR)抗性篩選標記，含有DsRED紅色螢光基因。圖4是PKD8表達載體的構建過程示意圖。pKD8質粒具有卡那黴素(Kana)抗性和新黴素(Neo)抗性篩選標記。圖5是pKD8-GFP表達載體的構建過程示意圖。pKD8_GFP質粒具有卡那黴素 (Kana)抗性和新黴素(Neo)抗性篩選標記，含有eGFP綠色螢光基因。圖6是pKD8-DsRED表達載體的構建過程示意圖。pKD8_DsRED質粒具有卡那黴素 (Kana)抗性和新黴素(Neo)抗性篩選標記，含有DsRED紅色螢光基因。圖7是SODl啟動子驅動的DsRED螢光蛋白在稻瘟病菌菌絲和孢子強烈表達。左方(A)為暗視場下拍攝，右方(B)為明視場下拍攝；紅色為DsRED發出的紅色螢光。圖8是SODl啟動子驅動的GAPDH-GFP融合蛋白在菌絲細胞中的定位。GAPDH-GFP 融合蛋白發出的綠色螢光分布於細胞質中；上方(A)為暗視場下拍攝，下方(B)為明視場下拍攝。
具體實施例方式實施例1獲得稻瘟病菌SODl啟動子序列。從稻瘟病菌Guyll菌株(Fungal Genetics Stock Center)的菌絲體中提取DNA 並作為模板，根據稻瘟病菌70-15菌株的基因組資料庫設計引物，利用高保真PCR方法擴增 SODl基因的啟動子序列。上遊引物al :5，-ATgaattcCGGTCATAACGCCAAGTTAATA-3，；下遊引物a2 5，-ATTCTAGACCCGGGGGATCCGACCATTTTGACGGTTGTTTGGTA-3，。在上遊引物中引入EcoRI位點；在下遊引物中引入BamHI-SmaI-XkiI位點。PCR體系為稻瘟病菌基因組DNA 1 μ 1，高保真DNA聚合酶0. 5 μ 1， dNTP(50mM)0. 4μ 1，上下遊引物各 0. 5μ l，10x PCR 緩衝液 5 μ 1，加水至 50 μ 1。PCR運行條件為94°C 3分鐘，35個循環(94°C 30秒，58°C 1分鐘，72°C 1分鐘30 #), 720C 10 分鐘。
PCR產物經瓊脂糖電泳，切下1. 5kb大小的目的條帶，經膠回收純化，連接到 PGEM-T EASY載體上，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取胺苄平板上長出的菌落進行培養，提取質粒、酶切鑑定，然後測序證實。經測序證實SODl啟動子的DNA編碼序列為SEQ ID NO. 1所示。實施例2獲得稻瘟病菌RP27終止子序列的從稻瘟病菌Guyll菌株的菌絲體中提取DNA並作為模板，根據稻瘟病菌70_15菌株的基因組資料庫設計引物，利用高保真PCR方法擴增RP27基因的終止子序列。上遊引物bl :5，-ATCTGCAGTAAGCGACACGCCATCACGATA-3，；下遊弓丨物b2 5，-ATAAGCTTTGTTGAAATTACCAGCGATTCGA-3，。在上遊引物中引入I3StI位點；在下遊引物中引入HindIII位點。PCR體系為稻瘟病菌基因組DNA為1 μ 1，高保真DNA聚合酶0.5 μ 1，dNTP (50mM) 0. 4 μ 1，上下遊引物各 0. 5μ Ι,ΙΟχ PCR 緩衝液 5 μ 1，加水至 50 μ 1。PCR運行條件為94°C 3分鐘，；35個循環(94°C 30秒，60°C 1分鐘，72°C 30秒)， 72 V 10分鐘。PCR產物經瓊脂糖電泳，切下1. 5kb大小的目的條帶，經膠回收純化，連接到 PGEM-T EASY載體上，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取胺苄平板上長出的菌落進行培養，提取質粒、酶切鑑定，然後測序證實。經測序證實RP27終止子的DNA編碼序列為SEQ ID NO. 2所示。實施例3構建攜帶SODl啟動子和RP27終止子的重組表達載體重組表達載體pKD6的構建利用抗性基因SUR的PCR引物從pCB15^經PCR獲得 SUR基因片段。上遊引物c 1 5，-GTGCCAACGCCACAGTGCC-3，下遊引物c2 5，-GCGAATTCACTAGTGATTGTGAATCGTGAGAGCATGCAATTCCC-3，克隆到pGEM-T EASY載體，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取胺苄平板上長出的菌落進行培養，提取質粒、酶切鑑定。重組載體然後用》ιοΙ和EcoRI酶切，2. Skb的酶切片段(SUR基因片段)插入pCAMBIA1300載體的BioI和EcoRI位點；重組載體轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取胺苄平板上長出的菌落進行培養，提取質粒、酶切鑑定。鑑定正確的載體再用I3StI和HinDIII雙酶切後，與RP27終止子相連；重組載體轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取胺苄平板上長出的菌落進行培養，提取質粒、酶切鑑定。驗證連接RP27終止子正確的載體用EcoRI和MlI酶切後，再與SODl啟動子相連；重組載體轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取胺苄平板上長出的菌落進行培養，提取質粒、酶切鑑定。將獲得的驗證正確的載體命名為pKD6(如附圖1所示)。(I)GFP蛋白重組表達載體pKD6-GFP的構建過程利用GFP的PCR引物從pGFP經PCR獲得GFP基因片段，上遊引物dl:5 『-AAcccgggATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3，下遊引物d2 5 『 -AATCTAGACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3，，克隆到pGEM-T EASY載體，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取胺苄平板上長出的菌落進行培養，提取質粒、酶切鑑定。重組載體然後用Small和^CbaI酶切，GFP基因片段插入表達載體PKD6的Small和)(baI位點；轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取胺苄平板上長出的菌落進行培養，提取質粒、酶切鑑定。將獲得的驗證正確的載體命名為PKD6-GFP (如附圖2所示)。(2)紅色螢光蛋白重組表達載體pKD6_DsRED的構建過程利用DsRED的PCR引物，從pDsRED2經PCR獲得DsRED基因片段，上遊引物el :5 『-AAcccgggATGGCCTCCTCCGAGAACGTCATC-3，下遊引物e2 5 『 -AATCTAGACAGGAACAGGTGGTGGCG-3，。克隆到pGEM-T EASY載體，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取胺苄平板上長出的菌落進行培養，提取質粒、酶切鑑定。重組載體然後用Small和^CbaI酶切，DsRED基因片段插入表達載體PKD6的Small和)(baI位點；轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取胺苄平板上長出的菌落進行培養，提取質粒、酶切鑑定。將獲得的驗證正確的載體命名為 pKD6-RED(如附圖3所示)。(3)重組表達載體pKD8的構建過程利用抗性基因NEO的PCR引物，從pSilent-DualIPCR擴增獲得NEO基因片段，上遊引物fl :5，-GCactagtGAGGTCAACACATCAATGC-3，下遊引物f2 :5，-TTctcgagTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG-3』,克隆到pGEM-T EASY載體，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取胺苄平板上長出的菌落進行培養，提取質粒、酶切鑑定。重組載體然後用》ιοΙ和EcoRI酶切，1. Ikb的酶切片段(ΝΕΟ基因片段)插入pCAMBIA1300載體的BioI和EcoRI位點；重組載體轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取胺苄平板上長出的菌落進行培養，提取質粒、酶切鑑定。鑑定正確的載體再用I3StI和HinDIII雙酶切後，與RP27終止子相連；重組載體轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取胺苄平板上長出的菌落進行培養，提取質粒、酶切鑑定。驗證連接RP27終止子正確的載體用EcoRI和MlI酶切後，再與SODl啟動子相連；重組載體轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取胺苄平板上長出的菌落進行培養，提取質粒、酶切鑑定。將獲得的驗證正確的載體命名為PKD8 (如附圖4所示)。(4) GFP蛋白重組表達載體pKD8-GFP的構建過程利用GFP的PCR引物從pGFP經PCR獲得GFP基因片段，上遊引物gl:5 『-AAcccgggATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3，下遊引物g2 :5 『-AATCTAGACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3，克隆到pGEM-T EASY載體，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取胺苄平板上長出的菌落進行培養，提取質粒、酶切鑑定。重組載體然後用Small和^CbaI酶切，GFP基因片段插入表達載體PKD6的Small和)(baI位點；轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取胺苄平板上長出的菌落進行培養，提取質粒、酶切鑑定。將獲得的驗證正確的載體命名為PKD8-GFP。 (如附圖5所示)。(5)紅色螢光蛋白重組表達載體pKD8_DsRED的構建過程利用DsRED的PCR引物從pDsRED2經PCR獲得DsRED基因片段，上遊引物hi :5 『-AAcccgggATGGCCTCCTCCGAGAACGTCATC-3，下遊引物h2:5 『-AATCTAGACAGGAACAGGTGGTGGCG-3，克隆到pGEM-T EASY載體，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取胺苄平板上長出的菌落進行培養，提取質粒、酶切鑑定。重組載體然後用Small和^CbaI酶切，DsRED基因片段插入表達載體PKD8的Small和)(baI位點；轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取胺苄平板上長出的菌落進行培養，提取質粒、酶切鑑定。將獲得的驗證正確的載體命名為 pKD8-RED(如附圖6所示)。實施例4S0D1啟動子驅動DsRED在稻瘟病菌菌絲中的強表達ATMT法轉化pKD6-RED載體到稻瘟病菌將載體pKD6_RED通過凍融法轉化到農桿菌菌株AGLl。然後ATMT法轉化稻瘟病菌萌發孢子中從新鮮培養的LB平板(含50mg/ ml卡那黴素)上挑選一農桿菌單菌落接種於5ml LB液體培養基(含50mg/ml卡那黴素)， 200rpm/minJ8°C過夜培養；第二天將200-400 μ 1培養液轉移到5ml含50mg/ml卡那黴素的誘導液體培養基(IM)中，OD值約0. 15d8°C培養5 6個小時使0D600達到0. 5 0. 6 ；稻瘟病菌分生孢子的收集用IOml滅菌蒸餾水從培養大約10天的CM平板上洗下稻瘟病菌的分生孢子，三層擦鏡紙過濾後用血球計數板計數，並用無菌水稀釋孢子濃度為106 個/ml ；取100 μ 1培養好的農桿菌AGL-I (含載體)菌液和100 μ 1稀釋好的稻瘟病菌分生孢子懸浮液混合，混合液QOO μ 1)均勻塗於IM平板上的硝酸纖維素膜表面，IM平板含 200ymol/L乙醯丁香酮(AS)或不含AS作為對照，22°C共培養48小時；然後將硝酸纖維素膜轉移到含真菌抗生素(磺胺嘧啶)與抗生素的選擇平板(DCM)上，選擇性培養基中含 100 μ g/ml磺胺嘧啶、400mg/ml頭孢黴素、60mg/ml鏈黴素，將平皿置於下培養到轉化子出現；將轉化子接種到含100 μ g/ml磺胺嘧啶DCM平板上再次鑑定。挑取具有磺胺嘧啶 (SUR)抗性的轉化子在螢光顯微鏡下檢測。結果表明SODl啟動子驅動RED螢光蛋白在稻瘟病菌菌絲細胞質中的強烈表達，見圖7。轉pKD6-RED稻瘟病菌的轉化子在CM培養基平板上培養12天，洗取稻瘟病菌孢子，稀釋至孢子濃度為IX 105個/ml。孢子液20 μ 1—滴點接種於附著胞誘導表面上，28°C 誘導培養觀-24小時，Trizol法提取RNA。DNase I處理RNA，然後RNA逆轉錄成cDNA，用 Real Time定量PCR檢測SODl啟動子驅動的DsRED基因的表達量，以β-tubulin的表達量最為對照。DsRED 的 Real Time qPCR 的引物為上遊引物i 1 5，-AAGGCCCTGAAGCTGAAG-3，下遊引物i2 :5，-GATGGTGTAGTCCTCGTTGTG-3，；β -tubulin 的 Real Time qPCR 的引物為上遊引物j 1 5，-TCCCATCAACATCAGAATCCG-3，下遊引物j 2 5，-GTTGTAAACTCCATTGCTGTCG-3，。Real Time定量PCR結果顯示SODl驅動的DsRED的基因表達量是β -tubulin的 18倍。實施例4GAPDH蛋白在稻瘟病菌細胞內的亞細胞定位螢光融合蛋白載體的構建根據GAPDH的cDNA序列設計合成PCR引物上遊引物kl :5，-TAggatccATGGTCAAGTGTGGTATC-3，下遊引物k2 :5，-TAcccgggCTTGCCACCGTCAACCTT-3，PCR擴增包含整個基因編碼區在內的GAPDH基因cDNA，然後克隆到pGEM_T EASY 載體，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，挑取胺苄平板上長出的菌落進行培養，提取質粒、酶切鑑定。重組載體然後用SmaI和^CbaI酶切，GAPDH基因片段插入pKD6_GFP載體的BamHI
7禾口 SmaI位點。 ATMT法將螢光融合蛋白載體轉化到絲狀真菌。挑取具有磺胺嘧啶(SUR)抗性的轉化子在螢光顯微鏡下觀察GAPDH-GFP融合蛋白在稻瘟病菌細胞中的分布。利用PKD6-GFP 載體構建的GAPDH-GFP融合蛋白在稻瘟病菌中的表達結果表明如附圖8所示，GAPDH蛋白定位於細胞質中。
權利要求
1.一種絲狀真菌啟動子，其特徵在於所述的絲狀真菌啟動子或它的互補鏈具有SEQ ID NO. 1所示的鹼基序列。
2.一種包含權利要求1所述的絲狀真菌啟動子的質粒。
3.—種絲狀真菌終止子，其特徵在於所述的絲狀真菌終止子或它的互補鏈具有SEQ ID NO. 2所示的鹼基序列。
4.一種包含權利要求3所述的絲狀真菌終止子的質粒。
5.一種包含權利要求1所述絲狀真菌啟動子和權利要求3所述絲狀真菌終止子的質粒。
6.根據權利要求5所述的質粒，其特徵在於，包含抗性基因SUR或抗性基因ΝΕΟ。
7.根據權利要求5所述的質粒，其特徵在於，包含GFP蛋白基因或紅色螢光蛋白基因。
8.權利要求2、3或5所述的質粒在絲狀真菌中表達蛋白、DNA或RNA中應用。
9.一種包含權利要求5 7任一所述質粒的轉化子。
全文摘要
本發明公開了一種絲狀真菌啟動子、終止子和包含它們的質粒，所述的絲狀真菌啟動子，具有SEQ ID NO.1所示的鹼基序列，所述的絲狀真菌終止子具有SEQ ID NO.2所述的鹼基序列。本發明啟動子是一個強啟動子，在稻瘟病菌的菌絲、孢子和附著胞階段都高強度啟動。該啟動子基因屬於表達強度在稻瘟病菌細胞內穩定性在前100位以內的基因。該基因是一個清除細胞內活性氧的重要基因，對於維持細胞的正常運轉具有重要作用。該基因在活性氧誘導下可以大量誘導表達，用於合成大量的重組蛋白。
文檔編號C12N1/15GK102154294SQ20111002739
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月26日 優先權日2011年1月26日
發明者盧建平, 張麗琳, 李海嬌, 林福呈 申請人:浙江大學