小麥育性恢復基因Rf6的分子標記及其獲得方法
2023-06-11 14:02:56
專利名稱：小麥育性恢復基因Rf6的分子標記及其獲得方法
技術領域：
本發明小麥育性恢復基因Rf6的分子標記及其獲得方法，提供了與T型小麥細胞質雄性不育育性恢復基因Rf6緊密連鎖的共顯性分子標記，屬於作物育種學領域。專用於T型小麥雄性不育育性恢復系種質的創建、選育與鑑定。並可用於克隆恢復基因及其轉基因育種。
二、技術背景細胞質雄性不育(CMS)是一種母性遺傳，它不能產生正常有功能的花粉但雌性生殖器官不受影響。位於細胞核內的育性恢復基因Rf可以恢復其育性。研究表明，育性恢復基因一般都為顯性。CMS及其育性恢復系統在作物雜交種生產中發揮極大的作用。它一方面去除了手工去雄的繁瑣性，另一方面保證了雜交種子的純度。同時還是研究細胞核與細胞質互相作用的良好材料。雜交種生產的前提條件是具有良好農藝性狀及育性恢復能力強的恢復系，所以創建優良的恢復系對雜交育種是至關重要的。雖然在水稻、玉米、油菜等作物中，雜交種生產應用的十分廣泛。但是在小麥中，雜交育種發展較為緩慢，其重要原因在於缺乏優良的恢復系。
小麥T型細胞質雄性不育是應用較為廣泛與深入的一種。其細胞質來源於提莫菲維小麥。迄今為止已經發現數個T型細胞質雄性不育的育性恢復基因，Rf6就是其中之一。Maetal(1991)利用附加小傘山羊草6U染色體的中國春附加二體與蘇三雜交，創建四個可恢復T型細胞質不育系的易位恢復系。同時指出易位系2114在四個易位系中恢復能力最強。將位於小傘山羊草6U染色體上的恢復基因命名為Rf6(Ma.ZQ，Zhao YH，Liu DJ Incorporation ofrestoring gene from Aegilops umbellulata into wheat.Genome 34727-732)。研究表明，在恢復能力最強的易位系2114中，小傘山羊草6U染色體易位於小麥染色體的片段中包含了恢復基因Rf6。2114具有較強的恢復能力，分別利用難恢復和易恢復的雄性不育系與之進行測交，結果發現恢復基因Rf6的恢復能力分別為82％和93.3％，且外顯度高，是較理想的恢復基因。但是採用傳統的育種方法利用該基因費時費力，而且由於育性易受環境的影響，表型鑑定有一定難度。因此通過鑑定恢復基因緊密連鎖分子標記來輔助育種可以有效解決這一問題。
Ma et al利用RFLP將易位斷裂點定在6A染色體的末端(Inheritance andchromosomal location of fertility restoring gene transferred fromAegilops umbellulata Zhuk to Triticum aestivum L Ma et al，Mol GenGenet 1995 247351-357)。關榮霞等分別找到與Rf6連鎖的一個RAPD(小麥T型雄性不育恢復基因的遺傳分析及RAPD標記，農業生物技術學報，2001，9(2)159-162)和兩個ISSR(小麥T型細胞質雄性不育恢復基因Rf6的ISSR分析，中國農業科學，2002，35(11)1297-1301)標記，遺傳距離為3.4cM，7.9cM和4.9cM。同時報導沒有找到緊密連鎖的SSR標記，並預測估計是由於圖譜不飽和的原因。目前與Rf6連鎖的分子標記包括RFLP，RAPD及ISSR，都為顯性標記，即不能確定恢復基因是以純合狀態還是以雜合狀態存在。而在恢復系的選育過程中需要知道恢復基因的存在狀態，才可以方便的開展選育工作。目前還沒有緊密連鎖的共顯性SSR標記報導。並且已知分子標記遺傳距離最小的為3.4cM。
本實驗所用材料N2114為2114的自交後代，是攜帶有位於小傘山羊草6U染色體易位片段上的Rf6基因的小麥小傘山羊草易位系，其細胞質為T型細胞質，因此，易位系的育性直接反映了Rf6恢復育性的能力。
發明內容
技術問題本發明的目的是提供與小麥育性恢復基因Rf6緊密連鎖的分子標記，通過檢測緊密連鎖的分子標記，可以預測Rf6的存在與否及存在狀態和小麥植株的育性，在苗期就可鑑定出攜有恢復基因以及恢復基因以純合或雜合狀態存在的單株，加快T型小麥細胞質雄性不育恢復系的選育與選擇進度。提高鑑定效率，鑑定方便，節約成本。並可用於克隆恢復基因及後續的恢復系品種鑑定。
技術方案小麥育性恢復基因Rf6的分子標記，其特徵在於用標記引物MAG218左端引物序列為AGTCGTGCACCTCCATTTTGG右端引物序列為CATTGGACATCGGAGACCTGAG擴增小麥小傘山羊草育性恢復材料或品種DNA，獲得的擴增片段為194bp，即為小麥育性恢復基因Rf6的分子標記MAG218標記，此標記片段在小麥小傘山羊草易位系N2114中，位於小傘山羊草6U染色體易位於小麥染色體的片段中，該小傘山羊草6U染色體的易位片段包含了Rf6基因，MAG218標記為共顯性分子標記，利用Mapmaker Macintosh V 2.0測得與Rf6基因的遺傳距離為1.9cM；或者用標記引物gwm88左端引物序列為CACTACAACTATGCGCTCGC右端引物序列為TCCATTGGCTTCTCTCTCAA擴增小麥小傘山羊草育性恢復材料或品種DNA，獲得的擴增片段為75bp，即為小麥育性恢復基因Rf6的分子標記gwm88標記，此標記片段在小麥小傘山羊草易位系N2114中，位於小傘山羊草6U染色體易位於小麥染色體的片段中，該小傘山羊草6U染色體的易位片段包含了Rf6基因，gwm88標記為顯性分子標記，利用Mapmaker Macintosh V 2.0測得與Rf6基因的遺傳距離為1.9cM。
上述小麥育性恢復基因Rf6的分子標記，是通過以下方法獲得的(一)N2114與蘇三F2代的創建與表型鑑定(1)小麥小傘山羊草易位系N2114(♀)與小麥品種蘇三(♂)進行雜交得到雜種F1，F1自交產生F2群體；(2)F2代在抽穗期對各單株套袋自交以檢測各單株的育性，環境為自然生長條件；(二)F2代群體的分子標記分析(3)用SDS法提取F2代群體各單株的DNA，應用簡單重複序列標記SSR與BSA結合的方法進行多態性篩選，將完全可育與完全不育F2單株DNA等量混合，構成可育池(F池)與不育池(S池)。
(4)首先用654對SSR引物對N2114，CS，蘇三及F、S池DNA多態性進行初步分析PCR反應體積為25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mM MgCl2 1.5微升，2.5mM dNTPs 2微升，Taq酶5單位/微升0.2微升，模板DNA 20納克，加水至25微升；SSR反應體系為DNA 94℃預變性3min後，94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸展1min，循環35次，最後72℃延伸10min；(5)在PTC-225擴增儀上進行PCR擴增，擴增產物在8％非變性聚丙烯醯胺凝膠上進行電泳分離，然後在紫外透射儀上照相，記錄結果選擇在親本間和F2代群體的F、S池間擴增出相同有多態型的引物為與Rf6連鎖的候選分子標記5對，將這5對分子標記在F2代群體單株中擴增獲取群體各單株的基因型資料；(三)分子標記獲得根據連鎖交換規律，利用擴增獲得的F2代群體各單株基因型資料與田間鑑定獲得的對應各單株的育性資料構建5對分子標記與N2114恢復基因Rf6的連鎖圖，所用軟體為Mapmaker Macintosh V 2.0，獲得了與Rf6最為緊密連鎖的分子標記MAG218標記和gwm88標記，利用Mapmaker Macintosh V 2.0測得與Rf6基因的遺傳距離為1.9cM。
有益效果1.本發明在國際上首次獲得了與恢復基因Rf6緊密連鎖的分子標記。小麥基因組巨大，是水稻基因組的40倍，是小麥遺傳育種研究的障礙。本發明利用654個SSR標記首次找到與恢復基因Rf6緊密連鎖的分子標記MAG218標記和gwm88標記，為恢復基因Rf6快速準確地轉入栽培小麥中應用取得了突破。可用於T型細胞質雄性不育恢復系的選育工作，使恢復基因快速準確地轉入栽培小麥中。可加快恢復基因Rf6在雜種小麥育種中的利用，MAG218標記和gwm88標記在所有已知分子標記中與Rf6連鎖最為緊密，遺傳距離最小為1.9cM，同時MAG218也是唯一的共顯性分子標記。
2.鑑定方便。SSR標記為共顯性，具有檢測方便、擴增穩定、簡便等優點。用MAG218標記檢測育性恢復基因Rf6，可以確定Rf6的存在與否以及存在狀態，並預測小麥植株的育性，進而快速篩選攜有Rf6的植株並用於恢復系的選育。同時利用分子標記進行實驗室檢測可以避免環境對品種的影響。
3.提高恢復系的選擇鑑定效率，節約成本。在傳統恢復系的選育中，首先要將具有恢復基因的親本與栽培品種進行一系列雜交，而且要對後代群體單株與不育系測交以鑑定其育性恢復能力。因此需要進行大量雜交，育性的鑑定還必須等到下一代。另外，育性表型鑑定易受環境的影響，表型鑑定有一定的誤差。因此恢復系選育不僅費時，而且難度大，成本高。通過檢測與恢復基因Rf6緊密連鎖的分子標記，可以將與不育系測交和育性恢復力鑑定的工作減少到最低限度，並且在苗期就可鑑定出攜有恢復基因Rf6的單株並確定其以純合或雜合狀態存在，從而淘汰非目標植株。因此，利用恢復基因Rf6的分子標記MAG218標記和gwm88標記進行選擇，不僅節約育種成本同時大大提高恢復系的選擇效率。
4.可用於克隆恢復基因Rf6研究。圖位克隆恢復基因Rf6的前提在於獲得與Rf6緊密連鎖的分子標記。MAG218標記和gwm88標記是目前與Rf6最緊密連鎖的分子標記。
四
圖1 MAG218標記和gwm88標記與T型細胞質雄性不育育性恢復基因Rf6的遺傳連鎖圖，左邊為染色體遺傳連鎖圖，標記間的圖距已用數據標出。rf為Rf6基因。
圖2 MAG218擴增帶型N2114，cs，su3為親本，u為小傘山羊草。1-20為可育株，21-28為不育株。箭頭所指為194bp特異擴增條帶。
圖3 gwm88擴增帶型N2114，cs，su3為親本，u為小傘山羊草，17，65，15，18，59，20，86，87，92，95為不育株，其餘為可育株。箭頭所指為75bp特異擴增條帶。
五具體實施例方式
N2114為2114的自交5代後代，經測交鑑定，是攜帶有位於小傘山羊草6U染色體易位片段上的Rf6基因的小麥小傘山羊草易位系，其細胞質為T型細胞質，因此，易位系的育性直接反映了Rf6恢復育性的能力。通過將Rf6的供體親本N2114與小麥品種或稱受體親本雜交，對後代進行自交或回交，同時利用分子標記MAG218標記和gwm88標記選擇含有Rf6的單株，就可以選育出含有恢復基因Rf6但遺傳背景不同的雄性不育育性恢復系。在恢復系的選育過程中，由於採用了分子標記，對雜交中母本的細胞質無特殊要求。在傳統選育方法中，如果細胞質是來源於普通小麥，從表型上我們就很難知道哪些單株攜有恢復基因Rf6以及恢復基因存在狀態。另外，在優質恢復系選育中常常需要將多個恢復基因轉入到同一品系中，因而需要有特異的標記來追蹤各個恢復基因。因此分子標記MAG218標記和gwm88標記的應用，可以大大節省恢復系選育的時間和勞力，並加強預測的準確性。MAG218標記和gwm88標記是當前最好的可用於Rf6分子標記輔助選擇的分子標記。由於MAG218標記和gwm88標記與Rf6的緊密連鎖關係，以該標記為路標，可以進行Rf6的精細定位或通過染色體步移法接近Rf6基因，從而為育性恢復基因Rf6的克隆打下基礎。
(一)N2114與蘇三F2代的創建與表型鑑定(1)小麥小傘山羊草易位系N2114(♀)與小麥品種蘇三(♂)進行雜交得到雜種F1，F1自交產生F2群體。
(2)F2代群體植株種在南京農業大學校內試驗田。由於群體內各單株的細胞質來自N2114，為T型細胞質，因此，各單株的育性直接反映了育性被恢復的情況。在抽穗期對各單株套袋自交以檢測各單株的育性。環境為自然生長條件。
(3)F2代可育單株套袋自交所得種子為F3家系。隨機從F3家系中任選10個家系，每個家系任選15粒種子種于田間。每個家系分別觀察育性分離比。結果見表1。
(二)F2代群體的分子標記分析(1)用SDS法(Ma and Sorrells，1995)提取F2代群體各單株的DNA，應用簡單重複序列標記SSR與BSA(Bulk segregant analysis，Michelmore R W，Paran I，Kesseli R V.Identification of markers linked to diseaseresistance genes by bulked segregant analysisa rapid method todetect markers in specific genomic region by using segregatingpopulations.Proc Natl Acad Sci USA，1991，889828-9832.)結合的方法進行多態性篩選。將6株完全可育與6株完全不育F2單株DNA等量混合，構成可育池(F池)與不育池(S池)。
(2)首先用654對SSR引物對N2114，CS(中國春，常規育種材料，見Ma.ZQ，Zhao YH，Liu DJ Incorporation of restoring gene from Aegilopsumbellulata into wheat.Genome 34727-732)，蘇三及F、S池DNA多態性進行初步分析。PCR反應體積為25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mM MgC121.5微升，2.5mM dNTPs 2微升，Taq酶(5單位/微升)0.2微升，模板DNA 20納克，加水至25微升。SSR反應體系為DNA 94℃預變性3min後，94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸展1min，循環35次，最後72℃延伸10min。在PTC-225擴增儀上進行PCR擴增，擴增產物在8％非變性聚丙烯醯胺凝膠(100ml聚丙烯醯胺溶液中含7.6克丙烯醯胺和0.4克甲叉雙丙烯醯胺)上進行電泳分離，然後在紫外透射儀上照相，記錄結果。在親本間和F2代群體的F、S池間擴增出相同有多態型的引物為與Rf6連鎖的候選標記。共得到5對這樣的標記，MAG218標記和gwm88標記就在其中(圖2，圖3)。將這5對分子標記在F2代群體單株中擴增獲取群體各單株的基因型資料。
(3)根據連鎖交換規律，利用擴增獲得的F2代群體各單株基因型資料與田間鑑定獲得的對應各單株的育性資料構建5對標記與N2114恢復基因Rf6的連鎖圖，所用軟體為Mapmaker Macintosh V 2.0(通用作圖軟體)。找到了與Rf6最為緊密連鎖的分子標記MAG218標記和gwm88標記，它們與Rf6的遺傳距離都為1.9cM。MAG218標記為共顯性標記，即攜帶和不攜帶恢復基因Rf6的單株分別具有不同的特徵帶型(見圖2)。gwm88標記為顯性標記(見圖3)。
(4)F2代單株套袋自交所得種子為F3家系。
隨機從F3家系中任選10個家系，每個家系任選15粒種子種于田間。每個家系分別觀察育性分離比，得到的結果見(表2)。即MAG218標記在F2代鑑定為恢復基因純合的植株，F3代表現全為可育；而鑑定為雜合的植株，F3代發生育性分離(見表1)，驗證了MAG218標記在F2代鑑定恢復基因純合或雜合的植株是正確的，同時也證實了MAG218標記的共顯性。
(三)結果與分析1.利用Mapmaker Macintosh V 2.0軟體對各個分子標記的群體基因型資料和與其對應每個單株的育性鑑定結果進行連鎖分析，獲得了MAG218標記和gwm88標記與位於小麥小傘山羊草易位系N2114中恢復基因Rf6的連鎖最緊密，遺傳距離都為1.9cM(圖1).
MAG218標記為左端引物序列AGTCGTGCACCTCCATTTTGG右端引物序列CATTGGACATCGGAGACCTGAG該標記為共顯性分子標記，擴增小麥小傘山羊草育性恢復材料或品種DNA，獲得的擴增片段為194bp(表2)gwm88標記為左端引物序列為CACTACAACTATGCGCTCGC右端引物序列為TCCATTGGCTTCTCTCTCAA該標記為顯性分子標記，在小麥小傘山羊草易位系N2114中特異擴增片段大小為75bp(表2)。
MAG218標記和gwm88標記片段均在小麥小傘山羊草易位系N2114中，位於小傘山羊草6U染色體易位於小麥染色體的片段中，該小傘山羊草6U染色體的易位片段包含了Rf6基因。
2.在F2代利用MAG218標記鑑定為恢復基因純合的單株，其F3代個體表現全為可育；而鑑定為雜合的單株，其F3代個體發生育性分離(見表1)，證實了MAG218標記的共顯性特徵，因此該標記可用於恢復基因純合性的鑑定。
表1 田間觀察F3家系育性分離比
表2標記引物的序列及擴增片段大小標記左端引物序列 右端引物序列 片段大小(bp)MAG218 AGTCGTGCACCTCCATTTTGG CATTGGACATCGGAGACCTGAG 194gwm88 CACTACAACTATGCGCTCGC TCCATTGGCTTCTCTCTCAA 75本發明利用654個SSR標記找到與恢復基因Rf6緊密連鎖的分子標記MAG218標記和gwm88標記，它們與Rf6之間的遺傳距離僅為1.9cM。本發明顯示了在將恢復基因快速準確地轉入小麥品種的研究中取得的突破。利用分子標記MAG218標記和gwm88標記輔助Rf6恢復系的選育，具有檢測方便、穩定、簡便等優點。利用MAG218標記，可以確定Rf6的存在與否以及存在狀態，並預測小麥植株的育性，進而快速篩選攜有Rf6的單株或株系。同時利用分子標記進行實驗室檢測可以避免環境對育性的影響。通過檢測與恢復基因緊密連鎖的分子標記，可以在苗期就鑑定出攜有恢復基因以及恢復基因以純合或雜合狀態存在的單株，淘汰非目標植株，可節約成本並大大提高恢復系的選擇效率。利用緊密連鎖的分子標記MAG218標記和gwm88標記，還可以進行Rf6的精細定位或通過染色體步移法接近Rf6基因，從而為育性恢復基因Rf6的克隆打下基礎。並可用於Rf6轉基因育種及品種的檢測鑑定。
權利要求
1.小麥育性恢復基因Rf6的分子標記，其特徵在於用標記引物MAG218左端引物序列為AGTCGTGCACCTCCATTTTGG右端引物序列為CATTGGACATCGGAGACCTGAG擴增小麥小傘山羊草育性恢復材料或品種DNA，獲得的擴增片段為194bp，即為小麥育性恢復基因Rf6的分子標記MAG218標記，此標記片段在小麥小傘山羊草易位系N2114中，位於小傘山羊草6U染色體易位於小麥染色體的片段中，該小傘山羊草6U染色體的易位片段包含了Rf6基因，MAG218標記為共顯性分子標記，利用Mapmaker Macintosh V 2.0測得與Rf6基因的遺傳距離為1.9cM；或者用標記引物gwm88左端引物序列為CACTACAACTATGCGCTCGC右端引物序列為TCCATTGGCTTCTCTCTCAA擴增小麥小傘山羊草育性恢復材料或品種DNA，獲得的擴增片段為75bp，即為小麥育性恢復基因Rf6的分子標記gwm88標記，此標記片段在小麥小傘山羊草易位系N2114中，位於小傘山羊草6U染色體易位於小麥染色體的片段中，該小傘山羊草6U染色體的易位片段包含了Rf6基因，gwm88標記為顯性分子標記，利用Mapmaker Macintosh V 2.0測得與Rf6基因的遺傳距離為1.9cM。
2.權利要求1所述小麥育性恢復基因Rf6的分子標記的獲得方法，包括(一)N2114與蘇三F2代的創建與表型鑑定(1)小麥小傘山羊草易位系N2114(♀)與小麥品種蘇三(♂)進行雜交得到雜種F1，F1自交產生F2群體；(2)F2代在抽穗期對各單株套袋自交以檢測各單株的育性，環境為自然生長條件；(二)F2代群體的分子標記分析(1)用SDS法提取F2代群體各單株的DNA，應用簡單重複序列標記SSR與BSA結合的方法進行多態性篩選，將完全可育與完全不育F2單株DNA等量混合，構成可育池(F池)與不育池(S池)；(2)首先用654對SSR引物對N2114，CS，蘇三及F、S池DNA多態性進行初步分析PCR反應體積為25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mM MgCl2 1.5微升，2.5mM dNTPs 2微升，Taq酶5單位/微升0.2微升，模板DNA 20納克，加水至25微升；SSR反應體系為DNA 94℃預變性3min後，94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸展1min，循環35次，最後72℃延伸10min；(3)在PTC-225擴增儀上進行PCR擴增，擴增產物在8％非變性聚丙烯醯胺凝膠上進行電泳分離，然後在紫外透射儀上照相，記錄結果選擇在親本間和F2代群體的F、S池間擴增出相同有多態型的引物為與Rf6連鎖的候選分子標記5對，將這5對分子標記在F2代群體單株中擴增獲取群體各單株的基因型資料；(三)分子標記獲得根據連鎖交換規律，利用擴增獲得的F2代群體各單株基因型資料與田間鑑定獲得的對應各單株的育性資料構建5對分子標記與N2114恢復基因Rf6的連鎖圖，所用軟體為Mapmaker Macintosh V 2.0，獲得了與Rf6最為緊密連鎖的分子標記MAG218標記和gwm88標記，利用Mapmaker Macintosh V 2.0測得它們與Rf6基因的遺傳距離都為1.9cM。
全文摘要
本發明小麥育性恢復基因Rf6基因的分子標記及其獲得方法，屬於作物育種與生產領域。對小麥小傘山羊草易位系N2114(♀)與蘇三(♂)雜交獲得的F2代群體的各單株的基因型及其育性進行遺傳連鎖分析，獲得與T型細胞質不育育性恢復基因Rf6緊密連鎖的共顯性SSR標記MAG218標記和顯性標記gwm88標記，它們與基因Rf6的連鎖最緊密。可以用來確定Rf6的存在與否以及存在狀態，並預測小麥植株的育性，進而快速篩選檢測攜有Rf6的植株，避免環境對品種的影響，大大提高T型細胞質不育育性恢復系選育的速度與鑑定效率。
文檔編號A01H1/04GK1570103SQ200410014828
公開日2005年1月26日 申請日期2004年5月8日 優先權日2004年5月8日
發明者馬正強, 楊鬱文 申請人:南京農業大學