一株能同時降解鄰苯二甲酸酯和農藥的真菌及其應用的製作方法

2023-06-11 07:59:31 2

一株能同時降解鄰苯二甲酸酯和農藥的真菌及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一株能同時降解鄰苯二甲酸酯和農藥的真菌及其應用。該菌株名稱為地黴屬DY4(Geotrichum?sp.DY4)，於2014年5月11日保藏於位於中國武漢武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO：M2014194。該菌株能同時降解鄰苯二甲酸酯和農藥，可用於降解多種PAEs和農藥混合物汙染，用於土壤生物修復，並為土壤中PAEs和農藥的降解機理研究提供了一種新的種質資源。
【專利說明】一株能同時降解鄰苯二甲酸酯和農藥的真菌及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於環境有機汙染物生物處理【技術領域】，特別涉及一株能同時降解鄰苯二 甲酸酯和農藥的真菌及其應用。

【背景技術】
[0002] 人類為了滿足日益增長的各種物質需求，在農業生產中大量使用地膜、有機農藥、 化肥等農用化學品，造成多種有機物對土壤的複合汙染。農田土壤中覆蓋地膜對農作物具 有保溫保溼的效果，尤其是在大棚蔬菜和水果的種植過程中起著非常重要的作用。但是地 膜中的增塑劑-鄰苯二甲酸酯（phthalic acid esters, PAEs)與塑料本身很難牢固結合， 穩定性相對較差，PAEs易從塑料地膜中滲出，造成土壤環境汙染。PAEs汙染不僅影響農田 土壤質量和植物的生長，影響土壤微生物的數量和多樣性，其具有的雌激素效應和生物累 積效應，對人類健康也具有潛在的風險。我國優先汙染物黑名單中列出3種PAEs，分別是鄰 苯二甲酸二甲酯（DMP)、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP)和鄰苯二甲酸二辛酯（D0P)。
[0003] 農藥也是重要的農業生產資料，對於防治病蟲害、去除雜草、調節農作物生長具有 重要的作用。但是近年來，隨著農藥的大量生產和使用，農藥汙染事件頻繁發生，危害也越 來越嚴重。農藥在滅殺有害生物的同時，也會破壞農田的生物多樣性和生態平衡，農藥汙 染土壤和水體、糧食、蔬菜、水果等與人類的生活、生產密切相關的產品，會造成人畜中毒。 毒死蝶（chlorpyrifos)是一種廣譜高效、低殘留的有機磷殺蟲殺蟎劑，被國家發改委和農 業部列為替代高毒農藥的重要品種，位居有機磷殺蟲劑市場的第一位。擬除蟲菊酯類農藥 (pyrethroids)是一類模擬天然除蟲菊素仿生合成的廣譜性殺蟲劑，含有多個苯環結構，高 效低毒，殺蟲毒力比有機氯、有機磷農藥等老一代殺蟲劑提高10?100倍，被廣泛使用。擬 除蟲菊酯類農藥主要品種有溴氰菊酯、氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、氰戊菊酯、甲氰菊酯和聯苯 菊酯等50多種產品，其品種數和使用量僅次於有機磷農藥，位居殺蟲劑市場的第二位，其 中最常用的為氰戊菊酯。
[0004] 微生物降解是土壤中有機汙染物礦化的主要途徑。生物修復被認為是目前去除環 境中有機物的最經濟有效的方法。近年來，關於PAEs及農藥的細菌降解已得到廣泛研究， 但關於真菌降解的報導較少。其微生物降解研究也都是針對單一的汙染物或同一類型汙染 物，但對於實際土壤環境而言，有機物汙染往往是多種有機物同時存在的複合汙染，PAEs和 農藥是農田土壤中最常見有機汙染物，篩選出可以同時降解兩者的真菌菌株並進行降解過 程及機理的研究，將有助於提高土壤中PAEs和農藥的降解效率，更好地應用於PAEs和農藥 有機物複合汙染農田土壤的生物修復。


【發明內容】

[0005] 本發明的首要目的在於克服現有技術PAEs和農藥複合汙染農田土壤生物修復技 術中存在的不足，提供一株能同時降解鄰苯二甲酸酯和農藥的真菌。
[0006] 本方面的另一目的在於提供所述的能同時降解鄰苯二甲酸酯和農藥的真菌的應 用。
[0007] 本發明的目的通過下述技術方案實現：一株能同時降解鄰苯二甲酸酯和農藥的真 菌，名稱為地黴屬DY4(Geotrichum sp. DY4)，於2014年5月11日保藏於位於中國武漢武漢 大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M2014194。
[0008] 所述的鄰苯二甲酸酯包括鄰苯二甲酸二甲酯（DMP)、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP)和 鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯（DEHP);
[0009] 所述的農藥為毒死蜱和擬除蟲菊酯類農藥中的一種以上；
[0010] 所述的擬除蟲菊酯類農藥優選為氰戊菊酯和溴氰菊酯中的至少一種；
[0011] 所述的能同時降解鄰苯二甲酸酯和農藥的真菌可用於處理受鄰苯二甲酸酯和農 藥汙染的土壤，進行環境汙染修復。
[0012] 本發明相對於現有技術具有如下的優點及效果：本發明提供的真菌在純培養條件 下7天內對鄰苯二甲酸二甲酯（DMP)、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP)、鄰苯二甲酸二（2-乙基己） 酯（DEHP)三種PAEs的混合體系的總降解率為63. 5%?90. 9%，對毒死蜱、氰戊菊酯和溴 氰菊酯三種農藥的混合體系的總降解率為31. 6?37. 1% ;在DBP和氰戊菊酯的混合體系 中，DY4對DBP和氰戊菊酯的降解率最高達到65. 4%和55. 8% ;30天內，DY4將滅菌土壤中 1001^*1^1的08?和氰戊菊酯分別降解67.3(%和57.5 (%，室內模擬田間土壤有機物降解， 人工染毒，對照不進行滅菌處理，DY4對土壤中DBP和氰戊菊酯均有很好的降解效果。本發 明菌株可用於降解多種PAEs和農藥混合物汙染，用於土壤生物修復，並為土壤中PAEs和農 藥的降解機理研究提供了 一種新的種質資源。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1是地黴屬DY4對液體混合體系中DBP和氰戊菊酯的降解效果圖。
[0014] 圖2是地黴屬DY4對滅菌土壤中DBP的降解效果圖。
[0015] 圖3是地黴屬DY4對滅菌土壤中氰戊菊酯的降解效果圖。
[0016] 圖4是地黴屬DY4對自然土壤介質中DBP的降解效果圖。
[0017] 圖5是地黴屬DY4對自然土壤介質中氰戊菊酯的降解效果圖。

【具體實施方式】
[0018] 下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限 於此。
[0019] 實施例1地黴屬（Geotrichum sp. )DY4的篩選分離及其對PAEs和農藥降解性能
[0020] (1)地黴屬（Geotrichum sp. )DY4 的篩選分離
[0021] 從廣東省某地受PAEs和農藥汙染農田的耕層（0?20cm)取土樣。稱取土樣 l〇g，裝入有90mL去離子水、4?5粒玻璃珠的250mL三角瓶，28°C、180rpm振蕩30min，靜 置30min。取10mL上清液，在上清液中加入140mL含複合PAEs和農藥的無機鹽培養基【無 機鹽培養基組成如下：(NH 4)2S041. 0g/L、ΚΗ2Ρ041· 0g/L、MgS04 · 7Η200· 2g/L、CaCl20. lg/L、 FeCl30. 01g/L，調節pH值為7. 0,121°C高壓蒸汽滅菌20min，下同】中進行3次梯度馴化。每 個梯度3種PAEs (DMP、DBP和DEHP，下同）和3種農藥（毒死蜱、氰戊菊酯和溴氰菊酯，下 同）的濃度分別為100、200和400mg/L (總濃度為600U200和2400mg/L)，每次取10mL菌 液轉入140mL新鮮含複合PAEs和農藥的無機鹽培養基中，28°C、120rpm培養7d，加入氯黴 素（終濃度為質量體積比〇. 02% )抑制細菌生長。最後取lmL菌液塗布平板，平板培養基 為馬丁氏培養基【葡萄糖l〇g/L、蛋白腖5g/L、KH2P0 4l. 0g/L、MgS04 ·7Η200. 5g/L，調節pH值 為7. 0,115°C高壓蒸汽滅菌20min後冷卻至55?60°C，加入氯黴素（終濃度為質量體積比 0.02% )，固體培養基需加瓊脂（終濃度為質量百分比1.5?2.0% )】，28°C培養7d，將不 同形態的菌落分別在馬丁氏培養基平板固體培養基上劃線得到單菌落，斜面保存。以上操 作均在無菌條件下進行。
[0022] 接種環挑取篩選出來的真菌，分別接入馬丁氏液體培養基，搖床28°C、120rpm培 養48h誘導孢子萌發和菌絲生長。分光光度計測定菌液660nm下的0D值，適當稀釋使其濃 度一致。將10mL菌液分別加入90mL複合農藥無機鹽培養基（3種農藥的濃度均為50mg/L， 總濃度150mg/L)，28°C，120rpm培養7d，以不接種的複合農藥無機鹽培養基為非生物降解 對照。檢測農藥降解率和菌絲體乾重。菌重測定採用乾重法，將菌液用濾紙過濾後，冷凍幹 燥24h後稱重。同樣的方法檢測PAEs降解率和菌絲體乾重。試驗結果見表1和表2。
[0023] 表1四株真菌對農藥的降解率
[0024]

【權利要求】
1. 一株能同時降解鄰苯二甲酸酯和農藥的真菌，其特徵在於：名稱為地黴屬 DY4(Geotrichum sp.DY4)，於2014年5月11日保藏於位於中國武漢武漢大學內的中國典 型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M2014194。
2. 根據權利要求1所述的能同時降解鄰苯二甲酸酯和農藥的真菌，其特徵在於：所述 的鄰苯二甲酸酯為鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二丁酯和鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯 中的一種或至少兩種形成的混合物。
3. 根據權利要求1所述的能同時降解鄰苯二甲酸酯和農藥的真菌，其特徵在於：所述 的農藥為毒死蜱和擬除蟲菊酯類農藥中的一種以上。
4. 根據權利要求3所述的能同時降解鄰苯二甲酸酯和農藥的真菌，其特徵在於：所述 的擬除蟲菊酯類農藥為氰戊菊酯和溴氰菊酯中的至少一種。
5. 權利要求1?4任一項所述的能同時降解鄰苯二甲酸酯和農藥的真菌的應用，其特 徵在於：所述的真菌用於處理受鄰苯二甲酸酯和農藥汙染的土壤，進行環境汙染修復。
【文檔編號】C12R1/645GK104087517SQ201410317731
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月3日 優先權日:2014年7月3日
【發明者】蔡信德, 王冬瑩, 吳文成, 方曉航, 李詩殷 申請人:環境保護部華南環境科學研究所