分離dna汙染物降低的經純化的rna的方法
2023-06-12 00:45:01
專利名稱：分離dna汙染物降低的經純化的rna的方法
分離DNA汙染物降低的經純化的RNA的方法 本發明涉及從含RNA和DNA的樣品中分離經純化的RNA的方法，其中經純化的RNA中DNA汙染物含量降低。另外，本發明涉及用於所述目的的組合物和方法。分離純化的、完整的RNA是分子生物學、臨床和生物技術應用中基因表達分析的關鍵步驟。現有技術中發展了許多達到該目標的方法。分離RNA最常用的方法是基於苯酚提取、用離液鹽沉澱以及二氧化矽吸附的方法。例如在US4，843，155和US2008/057560中描述了使用離液鹽的基於苯酚一氯仿的方法。相應方法使得從同一樣品中分離純RNA，或分離RNA、DNA和任選的蛋白質。相應方法的原理是將樣品於含苯酚和離液劑的變性組合物中勻化。該勻化物通過添加不溶於水的有機溶劑，例如氯仿，來分相。接著離心，所述混合物分成含RNA的水相以及含DNA和蛋白質的中間相和有機相。為分離RNA，收集所述水相併從中分離RNA，例如通過在所述水相中加入醇來沉澱RNA。相應方法提供了基本上純化的、未降解的RNA。然而，根據相應基於苯酚一氯仿的方法所分離的RNA中含DNA殘量,該殘量可通過例如逆轉錄聚合酶鏈反應試驗(RT-PCR)檢測。所述殘留DNA汙染物會干擾所純化RNA的下遊應用。這就產生了問題，因為汙染DNA可作為DNA聚合酶的模版，因此可能產生附加的擴增產物並因此影響RNA —依賴性RT-PCR的實施。因此，使用相應方法分離的RNA必須進一步純化來得到不含DNA的純化RNA。因此，可嘗試通過降低純化RNA中的DNA汙染物含量來改進現有技術中分離的RNA的品質。一種移除汙染DNA的常用實踐是用DNA酶處理含RNA的樣品。然而，實施相應的DNA酶處理有缺點，因為其增加了成本和處理步驟，而且DNA酶可能包含痕量RNA酶，因而產生RNA降解的風險。其他降低DNA汙染物的嘗試包括從水相中沉澱DNA的附加步驟。改進的方法中另外還使用了核酸結合固相以及需要合適的結合條件來將DNA結合到所述固相，以將DNA汙染物從含RNA的水相中移除。然而，相應方法也有缺點，因為其必須使用額外的核酸結合固相以及額外的處理步驟因而增加了成本。另一種降低DNA汙染物的方法是基於在苯酚提取期間將pH值降至4以下(例如請參考US2008/0057560)然而，所述方法中分離的RNA中的DNA汙染物也沒有得到令人滿意的降低。因此，本發明的一個目的是特別提供一種從含RNA、DNA和任選的蛋白質的樣品中分離RNA的方法，所述方法產生純RNA並降低經分離的RNA中DNA汙染物的含量另外，本發明的一個目的是降低含RNA的水相(尤其是通過苯酚/氯仿提取或相似的分相生產方法所獲得的)中的DNA含量。
發明內容
本發明是基於以下發現:向樣品中添加至少一種陽離子去汙劑可顯著減少經分離的RNA中DNA含量，所述樣品經過以下處理:添加含離液劑和苯酚的酸性變性組合物。添加所述陽離子去汙劑產生了令人意外的效果:通過添加不溶於水的有機溶劑，例如氯仿，獲得含RNA的水相，所述水相中的DNA殘留量顯著減少。不受理論的限制，可認為添加陽離子去汙劑具有以下效果:更多DNA從含R NA的水相中移除並由此導入相分離期間形成的中間相和/或有機相中。因此，通過添加陽離子去汙劑，所述DNA有效地從含RNA的水相中移除並聚集在所得的中間相和/或有機相中。其顯著減低了後續從所述水相中分離的RNA中DNA汙染物的含量。因此，本發明提供了相對於現有技術的顯著優點，並免去了從含RNA水相中去除DNA汙染物的處理，例如DNA酶處理或使用特異性核酸結合相去除DNA汙染物或額外的純化步驟。根據本發明的第一方面，提供一種從含RNA和DNA的樣品中至少分離RNA的方法，所述方法包括以下步驟:a)向樣品中加入包含離液劑和苯酚的酸性變性組合物；b)加入不溶於水的有機溶劑並分離所得相，因此形成包含水相、任選的中間相和有機相的多相混合物，其中RNA聚集於所述水相且DNA聚集於所述有機相和/或中間相；以及 c)從所述水相分離所述RNA。其中在最終分離所述各相前添加至少一種陽離子去汙劑。如上文所述，如果使用含離液劑和苯酚的酸性變性組合物製備樣品，那麼在最終分離各相前添加至少一種陽性去汙劑可產生如下效果:含RNA的水相中的DNA汙染物顯著降低。根據本發明的第二方面，提供一種用於本發明所述方法的試劑盒，包括:a)含離液劑和苯酚的酸性變性組合物；b)至少含一種陽離子去汙劑的用於降低DNA汙染物的溶液；c)任選的核酸結合固相以及
d)任選的洗滌和洗脫緩衝液。根據本發明的第三方面，本發明提供一種降低含RNA水相中DNA含量的方法，形成所述含RNA水相的RNA分離方法涉及使用含離液劑和苯酚的酸性變性組合物，其中，將至少一種陽離子去汙劑加入經所述酸性變性組合物勻化的樣品中，之後通過添加不溶於水的有機溶劑將所得相分為水相、任選的中間相和有機相。根據第四方面，本發明涉及用至少一種陽離子去汙劑來降低含RNA水相中DNA含量，所述含RNA水相通過以下步驟得到:-將樣品置於含離液劑和苯酚的酸性變性組合物中勻化；-添加不溶於水的有機溶劑並且-將混合物分成水相、任選的中間相和有機相。其中在最終分離所述各相前添加陽離子去汙劑。根據第四方面，本發明涉及使用至少一種陽離子去汙劑，通過降低含RNA水相中DNA含量，來提高任選的中間相和/或有機中DNA含量，其可通過以下步驟得到:-將樣品置於含離液劑和苯酚的酸性變性組合物中勻化；-添加不溶於水的有機溶劑並且-將混合物分成水相、任選的中間相和有機相。其中在最終分離所述相前添加陽離子去汙劑。如上文所述，當在含離液劑和苯酚的酸性變性組合物中製備樣品時，添加陽離子去汙劑之後再分離所述相可顯著降低含RNA水相中的DNA含量。所述方法使得例如分離到含較少DNA汙染物的純RNA。
通過以下說明書和附加的權利要求書，本領域技術人員能明白本發明的其它目的、特徵和優點。然而，應當理解雖然下述詳細說明，附加的權利要求和具體實施例描述了本發明的優選實施方式，其僅通過舉例方式給予。通過閱讀以下內容，本領域的技術人員很容易明白在本發明所公開的主旨和範圍中所做的各種改變和修改。發明詳述本發明涉及基於使用苯酚、離液劑和不溶於水的有機溶劑(例如氯仿)的RNA分離方法。在相應方法中，形成包含含有RNA的水相、任選的中間相和有機相的多相混合物。DNA和蛋白質(如果包含在樣品中)包含在中間相和/或有機相中。本發明基於以下發現:如果在最終分相前添加至少一種陽離子去汙劑，可顯著降低含RNA水相中的DNA含量。添加至少一種陽離子去汙劑具有以下效果:更多的DNA從含RNA水相中移除並因此聚集在中間相和/或有機相中。因為DNA更有效地從含RNA水相中移除，所以從相應的已去除DNA的水相中分離RNA，該RNA含更少量的DNA，因而含更少量的DNA汙染物。因此，本發明針對純化的RNA中殘留DNA汙染物的這一問題提供解決方法，該方法有效、簡便、而且不危害RNA品質。相反，RNA品質甚至比不添加陽離子去汙劑的方法更好。另外，本發明所述方法經濟有效，因為該方法不必使用額外的材料例如固相或酶，如DNA結合柱或DNA酶。因此，本發明具有顯著優點。根據本發明的第一方面，提供一種從含RNA和DNA的樣品中至少分離RNA的方法，所述方法包括以下步驟:a)向樣品中加入包含離液劑和苯酚的酸性變性組合物；b)加入不溶於水的有機溶劑並分離所得相，因此形成包含水相、任選的中間相和有機相的多相混合物，其中RNA聚集於所述水相且DNA聚集於所述有機相和/或中間相；以及c)從所述水相分離所述RNA。其中在最終分離所述相前添加至少一種陽離子去汙劑。步驟a)至c)是本領域已知的分離RNA所實施的方法.在步驟a)中，樣品置於含離液劑和苯酚的酸性變性組合物中處理，通常是裂解和/或勻化。通過添加步驟b)中的不溶於水的有機溶劑，例如氯仿，將所得混合物分成有機相、通常有中間相(取決於樣品)和水相。可用離心促進所述相的形成。在步驟c)中，將RNA從水相中分離。本發明的改進在於在混合物最終分相前添加至少一種陽離子去汙劑。令人驚奇地發現，如果在製備樣品時使用含離液劑和苯酚的酸性變性組合物，添加所述陽離子去汙劑可顯著降低含RNA水相中的DNA含量。用於本發明所述方法的試劑組合(尤其是離液劑、苯酚、陽離子去汙劑和非水溶性有機溶劑)對於實現本發明的優點是至關重要的。例如，僅僅添加離液劑或陽離子去汙劑無法實現本發明的益處。因此本文所述的精確組合很關鍵。所述優點通過本發明所教導的特定的步驟組合來實現，並通過文中提供的實施例來證實。據一個實施方式，使用至少一種具有以下分子式的陽離子去汙劑:Y R1R2R3R4X其中Y是氮或磷；RU R2、R3和R 4獨立地選自於支鏈或非支鏈C1-C20烷基殘基、C3-C6烯基殘基、C3-C6炔基殘基和/或C6-C26芳烷基殘基，其中，優選R1、R2、R3或R4中至少一種是C6-C20烷基殘基，且甚至更優選是至少ClO烷基殘基。X是無機或有機一元酸或多元酸的陰離子。陽離子去汙劑的示例包括但不限於季銨鹽、帶有醯胺鍵的胺、聚氧乙烯烷基和脂環胺、N，N，N』，N』四取代乙二胺、2-烷基1-羥乙基2咪唑啉乙氧基化胺和烷基銨鹽。根據一個實施方式，適用的陽離子去汙劑包含作為極性頭部基團的帶有永久性電荷的季銨陽離子。優選的陽離子去汙劑為十六烷基三甲基銨鹽。優選陽離子去汙劑包括溴化銨或氯化銨。最優選地，所述陽離子去汙劑選自下組:十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、四癸基三甲基溴化銨(TTAB)和十二烷基三甲基溴化銨(DTRB)或以氯替代溴的相應化合物。其它的陽離子去汙劑包括但不限於二癸基二甲基氯化銨、苯扎氯胺、正十二烷基三甲基溴化銨(DTAB)、三甲基四癸基溴化銨、N, N』 二甲基十二烷基胺-N-氧化物二鹽酸奧替尼啶、烷基三甲基銨鹽、 蠟鯨基三甲基溴化銨、氯化臘鯨基嘧啶(CPC)、聚乙氧基牛油胺
(POEA)、苯扎氯胺(BAC)、苄索氯銨(BZT)、5-溴-5-硝基-1，3- 二丨丨惡烷、二甲基雙十八烷基
氯化銨、雙十八烷基二甲基溴化銨(DODAB)、十六烷基三甲基溴化銨(HTAB)、氯化臘鯨基嘧
啶、二甲基雙十八烷基溴化銨、可可烷基二甲基苄基氯化銨、可可烷基二甲基苄基氯化銨、烷基羥乙基二甲基氯化銨、二油酸三乙醇胺酯季銨鹽、二硬脂基二甲基氯化銨、二牛脂酸三乙醇胺酯季銨鹽、三乙醇胺酯季銨鹽。根據一個實施方式，以某濃度添加至少一種陽離子去汙劑，得到在步驟a)中勻化的樣品中，和/或步驟b)中添加不溶於水的有機溶劑後所得的混合物中的陽離子濃度，該陽離子濃度選自下組:按總體積計0.01%到10%,0.03%到7.5%、0.03%到5%、0.04%到2.5%、
0.04%到2%和0.03%到1.7%。優選地，陽離子去汙劑或陽離子去汙劑混合物包括選自下組的濃度:至少0.03%、至少0.04%、至少0.05%、至少0.06%、至少0.08%、至少0.09%、至少0.1%和至少0.15%。如上文所述，也可使用陽離子混合物，優選CTAB和TTAB混合物。根據一個優選實施例，以溶液形式加入至少一種陽離子去汙劑。在所述溶液中，所述陽離子去汙劑優選包括選自下組的濃度:按溶液總體積計0.1%至20%、0.5%至10%、0.1%至5%、0.5%至5%、0.1%至3%、0.5%至3%，並最優選以下濃度:按溶液總體積計0.1%至1%和
0.5%至1%。使用陽離子混合物的情況下同樣適用。包含至少一種陽離子去汙劑的所述溶液可包含其他組分，例如鹽。包含於所述溶液中的所述鹽優選地選自下組:鹼性金屬鹽、例如氯化鈉、氯化鋰、氯化鉀、氯化銨、醋酸鈉、硝酸鈉、硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鋰、硫酸鉀和其混合物。添加相應的鹽對於在溶液中保留陽離子去汙劑尤其有利。優選地，溶液中的所述鹽濃度選自下組:0至10M、優選0.5至5M、更優選 0.5 至1.5M。分離所述相前添加陽離子去汙劑的方法有數種選擇。根據一個實施方式，在步驟
a)中，向樣品中添加酸性變性組合物前、添加酸性變性組合物時或添加酸性變性組合物後添加陽離子去汙劑。陽離子去汙劑也可包含在酸性變性組合物中。另外，所述陽離子可在步驟b)中與不溶於水的有機溶劑一起添加或分別同時添加。然而，在最終實施分相前添加陽離子去汙劑是至關重要的，其可使陽離子去汙劑在降低含RNA水相中的DNA含量中發揮作用。由於最終分相是關鍵，實施初始相分離然後向水相中添加陽離子去汙劑並最後分離所述相也在本發明的範圍中，例如，通過離心來使陽離子去汙劑和殘留DNA從水相中移除至有機和/或中間相中。然而，尤其為了減少處理步驟，優選在添加不溶於水的有機溶劑的同時或之前添加陽離子去汙劑。根據一個優選實施方式，在樣品與酸性變性組合物混合之後並在添加不溶於水的有機溶劑之前單獨添加陽離子去汙劑。如實施例所示，尤其是在步驟a)之後和步驟b)之前添加至少一種陽離子去汙劑達到良好結果。可通過沉降獲得相分離。根據一個實施方式，通過將樣品離心形成多相混合物。這裡，優選將樣品在較低溫度下和低於室溫的溫度下離心。優選的溫度是<15° C、<10° C，並尤其優選更低的溫度例如< 7° C、<5° C和<4° C。已發現，在較低溫度下離心有助於相分離，因此，在使用陽離子去汙劑時促進含RNA水相中DNA含量降低。為了從所述水相中分離RNA，基本上可使用本領域現有技術中任何從水溶液中分離RNA的任何已知方法。優選的RNA分離方法是通過向所述水相中添加至少一種醇從而沉澱得到RNA。根據一個實施方式，相應經沉澱的RNA可通過將水相離心然後傾析上清液回收。優選地，所述水相與至少一種醇混合，並用所述混合物接觸核酸結合固相以助於核酸純化。關於核酸結合固相，可使用任何能結合核酸的材料，因此其包括各種能在合適條件下結合核酸的材料。適用於本發明的固相示例包括但不限於:包括二氧化矽和矽質固相的化合物(所述矽質固相包括但不限於:矽石顆粒、二氧化矽、硅藻土、玻璃、烷基二氧化矽、矽酸鋁和硼矽酸鹽)、硝酸纖維素、重氮化紙、羥基磷灰石(也稱為羥基磷灰石)、尼龍、金屬氧化物、氧化鋯、氧化鋁、聚合載體、二乙基氨基乙基-和三乙基氨基乙基衍生載體、疏水性層析樹脂(例如苯基-或辛基瓊脂糖)等。術語固相不用於表示其形式和設計的任何限制。因此，術語固相包括多孔或非多孔的、滲透性的或非滲透性的合適材料，包括但不限於膜、濾紙、薄片、顆粒、磁性顆粒、珠子、凝膠、粉、纖維等。根據一個實施方式，固相表面不修飾，例如不用官能團修飾。優選地，使用核酸結合膜。合適的膜包括但不限於親水膜、疏水膜、和通過離子交換結合核酸的膜。示例包括但不限於二氧化矽膜和其它含二氧化矽的膜、尼龍膜、纖維素膜例如硝 酸纖維素膜。優選多孔膜。另外，優選使用含二氧化矽或由二氧化矽組成的膜。關於醇，優選使用短鏈支鏈或非支鏈醇，其中優選I至5個碳原子。示例為甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇和丁醇。也可使用醇的混合物。優選的醇選自異丙醇和乙醇，因為所述醇對沉澱RNA尤其有效。用於分離RNA的醇濃度取決於經分離的總RNA中是否含小RNA。在還需要純化小RNA (例如miRNA)的情況下，推薦使用較高的醇濃度。當經分離的總RNA中不需要包含相應的小RNA的情況下，優選較低的醇。與水相混合時，所述醇濃度在所得混合物中的範圍是10%v/v至90%v/v。為分離含有小RNA的總RNA，使用以下醇濃度很有益處:彡40%v/v,優選彡50%v/v。當不需要包含小RNA時，所述醇濃度優選< 40%v/v。因此，與水相混合時，所述醇濃度可選自下組，至少20%,至少30%v/v,至少40%v/v,至少50%v/v和至少60%v/v。當與水相混合時，優選的醇濃度範圍是20%v/v至90%v/v或30%v/v至85%，優選的範圍是30%v/V 至 70Ψον/ν。本文所用的術語「樣品」從廣義上來講，其意在包括各種含有核酸的來源。所述樣品可以是生物樣品但術語也包括其它樣品，例如含有核酸的人工樣品。樣品示例包括但不限於全血、血製品、紅血細胞、白血細胞、暗黃層、擦拭物(包括但不限於口頰擦拭物、咽喉擦拭物、陰道擦拭物、尿道擦拭物、宮頸擦拭物、咽喉擦拭物、直腸擦拭物、病灶擦拭物、膿腫擦拭物、鼻咽擦拭物等)、尿液、痰液、唾液、精液、淋巴液、羊水、腦脊液、玻璃體液、腹膜滲出液、胸腔積液、囊內積液、滑液、玻璃體液、眼房液、囊液、洗眼液、眼抽出物、血漿、血清、肺灌洗液、肺抽出物；組織，包括但不限於:肝、脾臟、腎、肺、腸、腦、心、肌肉、胰腺；細胞培養物，以及裂解物、提取物、或從上述樣品中獲得的細胞、或可能存在樣品上或樣品中的任何細胞和微生物以及病毒等。從臨床或法醫設置中獲得的含核酸的材料也在術語「樣品」想要表示的含義中。另外，技術人員會明白裂解物、提取物或獲自任何上述示例樣品的經處理的材料或部分也在術語「樣品」的範圍中。優選地，所述樣品是衍生自人、動物、植物、細菌或真菌的生物樣品。優選地，所述樣品選自下組:細胞、組織、細菌、病毒和體液(例如血液、血製品(例如暗黃層、血漿和血清)、尿液、溶液、痰液、糞便、CSF和精液)、上皮擦拭物、活檢標本、骨髓樣品和組織樣品，優選器官組織樣品例如肺、腎或肝。本發明所述方法尤其適合從組織樣品中分離RNA，尤其是器官組織樣品。根據本發明的一個實施方式，所述組織不是血液。根據一個實施方式，所述樣品不是細菌樣品或衍生自細菌的樣品。術語「小核酸」和「各種小核酸」尤其是指長度小於1000nt、500nt、400nt、300nt、IOOnt或小於70nt的核酸，包括但不限於miRNA、siRNA和其它短幹擾核酸，snoRNA、snRNA、tRNA、hnRNA、循環核酸、基因組DNA或RNA片段、降解的核酸、核酶、病毒RNA或DNA、感染源的核酸、擴增產物、修飾的核酸、質粒或細胞器核酸、人工核酸例如寡居苷酸。所述酸性變性組合物包含離液劑和苯酚，該組合物可如現有技術，例如US4, 843，155 或 US5, 346，994 中所述的那樣。任何可用於酸性變性組合物的離液劑導致蛋白質或核酸變性，例如但不限於:雖然保持其初級結構完整性但改變蛋白或核酸的二級、三級或四級結構。優選地，所述離液劑選自下組:鹽酸胍、硫氰酸胍、異 硫氰酸胍、硫氰酸鈉、碘化鈉、高氯酸鈉、三氯乙酸鈉、三氟乙酸鈉和脲。優選地，使用離液鹽。具體地，可使用鹽酸胍和/或硫氰酸胍作為離液劑。所述酸性變性組合物中包含的離液劑的濃度可選自下組:0.1至飽和極限、0.1至6M、0.5 至 4M、0.5 至 3M 以及 0.5 至 2M。優選地，所述酸性變性組合物中包含的苯酚的濃度可選自下組:按酸性變性組合物的總體積計，10%v/v至70%v/v、20%v/v至60%v/v和30%v/v至50%v/v。優選地，所述苯酹濃度的範圍在35% v/v至40% v/v之間。所述變性組合物的pH值為酸性，可以是彡6，優選彡5。優選地，酸性變性組合物的pH值範圍在3至6之間，更優選地在4至5之間。另外，所述酸性變性組合物可包含緩衝液，所述緩衝液的含量可足夠維持所述組合物在酸性pH。所述緩衝液可以是以下物質中的至少一種鹽:醋酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、酒石酸鹽或乳酸鹽，並可例如選自下組:磷酸鈉、醋酸鈉和檸檬酸鈉。優選地，使用醋酸鈉。所述酸性變性組合物可包含增溶劑，所述增溶劑用於，尤其在4° C，維持溶液中的苯酚，並實現或維持作為單相溶液的溶劑。合適的增溶劑是甘油。根據一個實施方式，所述增溶劑的濃度為約2至10%，優選約5%。另外，所述酸性變性組合物可包含硫氰酸鹽組分，優選硫氰酸銨或硫氰酸鈉。可確信，所述附加的硫氰酸組分增強了生物樣品中的RNA提取。所述硫氰酸鹽組分的濃度可以是0.1至1M，優選0.4M。根據一個實施方式，所述酸性變性組合物具有以下特性:-包含苯酚，所述苯酚濃度高於30%，優選高於35 %並最優選35至40 %。-pH 為 4.3 至 6,優選 4.5 至 5。-包含離液鹽，所述離液鹽濃度為0.5至4M，優選0.5至3M ;以及-優選地，包含至少一種選自下組的其它試劑:緩衝液、增溶劑和硫氰酸鹽化合物；優選實施例和濃度如上文所述。優選地，所述酸性變性組合物結合了上述所有優選特性。合適的不溶於水的有機溶劑包括但不限於:己內酯、乙二醇二乙酸酯、聚乙二醇二苯甲酸酯、氯仿、四氯化碳、溴氯丙烷、溴萘、溴苯甲醚、環己基溴、二溴丙烷、二氯苯甲酸或其混合物。優選的不溶於水的有機溶劑為氯仿。根據本發明所述方法也可包含一個或多個附加步驟，以下論述了一些非限制性選擇。如果需要，可用本發明所述方法從有機相和/或中間相中回收蛋白質(若樣品中包含)和/或DNA，例如可通過向有機相中添加較低濃度的醇來沉澱蛋白質並通過沉降回收蛋白質。可從中間相和/或有機相中回收DNA，例如通過以下方法:用預定量的溶劑洗滌、沉降DNA並從DNA中去除任何苯酚和鹽汙染物。從中間相和/或有機相中分離DNA和/或蛋白質的合適方法在現有技術中是已知的，所以這裡不需要進一步敘述。根據本發明實施分離DNA的方法還有提高DNA產率的有益效果，因為DNA更有效地從水相中移除並因此聚集在中間相和/或有機相中，從而分離DNA。另外，在從水相中分離RNA時可實施一個或多個洗滌步驟。優選地，在使用固相的情況下，當RNA結合到核酸結合固相時實施所述洗滌步驟。為所述目的可使用常規洗滌溶液。推薦使用不會導致RNA從核酸結合固相上釋放的洗滌溶液。另外，在不使用結合相的情況下可洗滌含RNA的團塊。根據一個實施方式，用於洗滌的溶液包括至少一種離液劑、至少一種醇、至少一種去汙劑和/或至少一種緩衝組分。適用於洗滌溶液的離液劑包括但不限於鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍和碘化鈉。另外，可用的離液鹽包括離液陰離子，所述離液陰離子選自下組:三氯乙酸鹽、高氯酸鹽和三氟乙酸鹽。所述離液鹽的示例是鹼性鹽，例如高氯酸鈉、三氯乙酸鈉和三氟乙酸鈉。關於用於洗滌的醇，可用於洗滌，在所述的洗滌溶液中的醇是短鏈分支或非分支醇，優選I至5個碳原子的醇。示例為甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇和丁醇。優選使用異丙醇和/或乙醇。優選地，所述洗滌溶液包含至少10%醇和至少900mM離液鹽，優選至少2M離液鹽。另外，所述洗滌溶液可包含去汙劑。本發明還提供了一種適用於本發明所述方法的試劑盒。所述試劑盒包含:a)含離液劑和苯酚的酸性變性組合物；b)降低水相中DNA的溶液，所述溶液包含至少一種離液劑和優選地一種鹽。c)任選的核酸結合固相以及
d)任選的洗滌和洗脫緩衝液。所述酸性變性組合物優選具有上述特性。這裡是指上述公開內容。另外，用於降低DNA的溶液有具有上述特性。這裡也指上述公開內容。
根據本發明的另一方面，本發明提供一種降低含RNA水相中的DNA含量的方法，形成所述含RNA水相的RNA分離方法涉及使用含離液劑和苯酚的酸性變性組合物，其中，將至少一種陽離子去汙劑加入經所述酸性變性組合物勻化的樣品中，之後通過添加不溶於水的有機溶劑將所得相分為水相、任選的中間相和有機相。本發明還涉及使用至少一種離子去汙劑來降低含RNA水相中DNA含量的用途，所述含RNA水相通過以下步驟得到:-將樣品置於含離液劑和苯酚的酸性變性組合物中勻化；-添加不溶於水的有機溶劑並且-將混合物分成水相、任選的中間相和有機相。其中在最終分離所述相前添加離子去汙劑。關於離子去汙劑，可使用陰離子去汙齊U，例如SDS，優選使用陽離子去汙劑。如上文所述，所述去汙劑優選陽離子去汙劑，因為陽離子去汙劑就在含RNA水相中降低DNA含量這點上提供了最好結果。關於酸性變性組合物的其它詳細內容，本發明所述方法就去汙劑和其進一步使用詳情都在上文中進行了敘述。這裡是指上述公開內容。優選地，所述酸性變性組合物結合了上述所有優選特性。本發明涉還及使用至少一種陽離子去汙劑，通過降低含RNA水相中DNA含量，來提高中間相和/或有機中DNA含量的用途，其通過以下步驟得到:-將樣品置於含離液劑和苯酚的酸性變性組合物中勻化；-添加不溶於水的有機溶劑並且-將混合物分成水相、任選的中間相和有機相。其中在最終分離所述相前添加陽離子去汙劑。關於酸性變性組合物和陽離子去汙劑的詳細內容以及相關優點在上文中已詳細描述。這裡是指應用於本文的相關公開內容。
實施例實施例1:不同去汙劑從大鼠肝臟中分離RNA時去除基因組DNA的作用，該作用通過以下方法評估:1.使用TissueRuptor勻眾機,使用27mlQiazol試劑,一種含酸性酹和離液鹽的試齊U，勻化270mg經RNAlater穩定的肝組織。2.將1000 μ I所得勻漿液分裝進2ml的Eppendorf管。因此，每個樣品使用IOmg組織3.相分離前將8μ1 (5 μ g)基因組DNA加入Qiazol試劑。4.在下一步驟中，向所述勻漿液加入100 μ I以下去汙劑(一式兩份):-曲通Χ-100 [100%]-吐溫20 [20%]-十六烷基三甲基溴化銨[1%]，CTAB-四癸基三甲基溴化銨[1%]，TTAB。
不添加去汙劑作為參照(「參照」)。然後加入200 μ I氯仿並渦旋振蕩。
5.將樣品以12.0OOxg在4° C下離心15分鐘,所得水相移入新的Eppendorf管。6.向每份水相中加入1.5倍體積無水乙醇，然後混合。7.將混合物轉至RNeasy小柱(恰根公司(Qiagen))上,然後以8.200xg離心15秒，接著用700 μ IRWT緩衝液(恰根公司(Qiagen))洗滌，再以8.200xg離心15秒。8.用SOOylRPE緩衝液(恰根公司(Qiagen))將上述柱子洗滌兩次，分別以
8.200xg離心15秒和2分鐘，接著以最大速度進行I分鐘的最終離心步驟。9.經8.200xg離心I分鐘，被結合的RNA洗脫至30 μ I的無RNA酶水中。使用NanoDrop (賽默飛世爾公司(ThermoScientific))對RNA濃度進行光譜測定。結果示於表
·1表1:使用曲通Χ-100,、吐溫20、CTAB或TTAB作為去汙劑分離得到的RNA的定量。使用NanoDrop分光儀(賽默飛世爾公司(ThermoScientific))進行核酸定量。
權利要求
1.一種從含RNA和DNA的樣品中至少分離RNA的方法，所述方法包括: a)向樣品中加入包含離液劑和苯酚的酸性變性組合物； b)加入不溶於水的有機溶劑並分離所得相，因此形成包含水相、任選的中間相和有機相的多相混合物，其中RNA聚集於所述水相且DNA和蛋白質聚集於所述有機相和/或中間相；以及 c)從所述水相分離所述RNA， 其中在最終分離所述各相前添加至少一種陽離子去汙劑。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述至少一種陽離子去汙劑具有以下一種或多種特性: a)包含帶有永久性電荷的季銨陽離子； b)包含溴化銨並/或 c)選自下組:CTAB、TTAB和 DTRB。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述至少一種陽離子去汙劑以溶液的形式添加。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述溶液具有一種或多種以下特性: a)所包含的至少一種陽離子去汙劑的濃度選自下組:0.1%至10%、0.1%至5%、0.1%至3% 和 0.l%tol% ;和 / 或 b)包含鹽，所述鹽優選選自下組:氯化鈉、氯化鉀、氯化銨、乙酸鈉、硝酸鈉、氯化鋰、硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鋰、硫酸鉀及其組合。
5.如權利要求1至4中的任一項所述的方法，其特徵在於，在步驟c)中通過將混合物在較低溫度下離心來形成多相混合物，所述溫度選自下組15° C的溫度、<10° C的溫度、彡7C的溫度、彡5° C的溫度和彡4° C的溫度。
6.如權利要求1至5中的任一項所述的方法，其特徵在於，通過向所述水相中添加至少一種醇來分離水相中所述的RNA。
7.如權利要求1至6中的任一項所述的方法，其特徵在於，將所述水相與醇混合併將所述的混合物與核酸結合固定相接觸來結合RNA。
8.如權利要求1至7中的任一項所述的方法，其特徵在於，所述醇選自下組:甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇和丁醇和/或以選自下組的濃度添加:至少20 %、至少30 % v/v、至少40 %v/v、至少 50% v/v 和至少 60% v/vo
9.如權利要求1至7中的任一項所述的方法，其特徵在於，所述包含離液劑和苯酚的酸性變性組合物具有一種或多種以下特性: a)所述離液劑是離液鹽； b)所述離液劑選自下組:鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、硫氰酸鈉、碘化鈉、高氯酸鈉、三氯乙酸鈉、三氟乙酸鈉和脲； c)所包含的離液劑的濃度選自下組:0.1至6M、0.5至4M、0.5至3M ; d)所包含的苯酹的濃度選自下組:10%v/v至70%v/v、20%v/v至60%v/v和30%v/v至50%v/V ； e)包含足夠量的緩衝液以維持所述組合物在酸性pH； f)包含增溶劑來維持苯酚於溶液中；g)包含硫氰酸組分；並/或 h)pH低於6;優選pH ≤5ο
10.如權利要求1至9中的任一項所述的方法，其特徵在於，所述不溶於水的有機溶劑是氯仿。
11.用於權利要求1至10中的任一項所述方法的試劑盒，所述試劑盒包含: a)含離液劑和苯酚的酸性變性組合物； b)用於降低含RNA水相中DNA含量的溶液，其包含至少一種陽離子去汙劑； c)任選的核酸結合固相以及 d)任選的洗滌和洗脫緩衝液。
12.如權利要求11所述的試劑盒，其特徵在於，包含權利要求9中定義的酸性變性組合物和/或具有權利要求4中b)所限定的特性的溶液。
13.一種降低含RNA水相中DNA含量的方法，形成所述含RNA水相的RNA分離方法涉及使用含離液劑和苯酚的酸性變性組合物，其中，將至少一種陽離子去汙劑加入經所述酸性變性組合物勻化的樣品中，之後通過添加不溶於水的有機溶劑將所得相分為水相、任選的中間相和有機相。
14.使用至少一種陽離子去汙劑來降低含RNA水相中DNA含量，所述水相通過以下方法獲得； -將樣品置於含離液劑和苯酚的酸性變性組合物中勻化； -添加不溶於水的有機溶劑並且 -將混合物分成水相、任選的中間相和有機相， 其中在最終分離所述各相前添加陽離子去汙劑。
15.使用至少一種陽離子去汙劑，通過降低含RNA水相中DNA含量，來提高中間相和/或有機中DNA含量，所述含RNA水相通過以下步驟得到: -將樣品置於含離液劑和苯酚的酸性變性組合物中勻化； -添加不溶於水的有機溶劑並且 -將混合物分成水相、任選的中間相和有機相， 其中在最終分離所述各相前添加陽離子去汙劑。
全文摘要
本發明涉及從含RNA和DNA的樣品中分離RNA的方法，所述方法包括a)向樣品中添加包含離液劑和苯酚的酸性變性組合物;b)添加不溶於水的有機溶劑並分離所得相，因此形成包含水相、任選的中間相和有機相的多相混合物，其中RNA聚集於所述水相且DNA和蛋白質聚集於所述有機相和/或中間相。c)從所述水相分離所述RNA。其中在分離所述各相前添加至少一種陽離子去汙劑。已發現，添加至少一種陽離子去汙劑顯著降低所述含RNA的水相中的DNA含量。因此，本發明使得簡便地分離含顯著較少DNA汙染物的純RNA。
文檔編號C12Q1/68GK103080311SQ201180042770
公開日2013年5月1日 申請日期2011年9月6日 優先權日2010年9月6日
發明者G·克裡斯託夫 申請人:恰根有限公司