人甲、乙型流感及新甲型h1n1流感病毒一管多檢方法及試劑盒的製作方法

2023-06-11 17:28:21 2

專利名稱：人甲、乙型流感及新甲型h1n1流感病毒一管多檢方法及試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學檢測技術領域，具體是人甲型流感、乙型流感及新甲型 HlNl流感病毒一管多檢方法及試劑盒。
背景技術：
人流感病毒是一種造成人類患流行性感冒的RNA病毒，在分類學上，流感病毒屬 於正黏液病毒科，它會造成急性上呼吸道感染，並藉由空氣迅速的傳播，在世界各地常會有 周期性的大流行。人流感病毒以其核蛋白的抗原性分為A型、B型和C型流感病毒(又稱甲、乙和丙 型流感病毒)。在感染人類的三種流感病毒中，甲型流感病毒有著極強的變異性，乙型次之， 而丙型流感病毒的抗原性非常穩定。所以造成大規模流行的一般都為前兩種。流行性感冒病毒在免疫力較弱的老人或兒童及一些免疫失調的病人會引起較嚴 重的症狀，如肺炎或是心肺衰竭等。從流行病學的角度來說，流感引起世界性大流行是流感 病毒抗原變異與人群免疫屏障相互作用的結果。20世紀全球共出現四次流感大流行，都是 由變異的甲型流感病毒引起，造成重大的人員和財產損失。2009年最先由墨西哥發現的新 甲型Hmi流感病毒就含有豬流感、禽流感和人流感三種流感病毒的基因片段，在全球迅速 傳播開來，造成大規模的流行。目前全世界各國為防控新甲流H1N1，都在做積極的努力，同 時取得了顯著的效果。鑑於甲乙型流感病毒及目前甲型流感中的新甲型Hmi流感病毒對人類所造成的 嚴重呼吸道疾病，特別是在兒童中，為診治及防控需要，這就需要醫療機構提供準確快速靈 敏的檢測方法，快速診斷，快速治療。就目前情況，對甲乙型及新甲型Hmi流感病毒的診斷 主要以下幾種方法(1)病毒的培養分離；(2)血清學檢測特異IgG及IgM ； (3) RT-PCR方法 及螢光定量PCR方法。相比較幾種方法，前兩種方法都是早期開發的經典方法，PCR方法是 針對病原體核酸的檢測方法，克服了前面兩種方法中存在的周期長、靈敏度不高的問題，特 別是螢光定量PCR方法的引進，解決了 PCR方法容易產生假陽性的問題，使其得到了快速的 發展，該方法具有高特異性、高靈敏度、周期短、操作簡單、成本較低等多種優點。但目前開發的流感病毒分型試劑基本都為單重螢光定量PCR檢測試劑，不能對這 三種流感病毒進行同時檢測；如要同時檢測，則需要分別在三管中進行，其操作繁瑣、費時 耗力。

發明內容
為了克服上述技術缺陷，本發明的目的之一是提供一種人甲型流感、乙型流感及 新甲型Hmi流感病毒一管多重螢光PCR檢測方法，以改進目前現有方法，從而使檢測達到 靈敏、快速、準確、節約材料和試劑的目的。本發明的人甲型流感、乙型流感及新甲型Hmi流感病毒一管多重螢光PCR檢測方法包括樣品核酸的製備和多重PCR擴增步驟，其中，多重PCR擴增步驟中採用了序列如下所 示的引物(見序列表SEQ ID NO 1-6)IFAF GAGGTCGAAACGTATGTTCTCTCTATC ；IFAR TCTTCAAGTCTCTGCGCGATT ；
IFBF CCCTGCTTGCTCGTAGTATGG ；IFBR GCTTATGGGAAGCACCACTTTG ；AHlF GGTTTGAGATATTCCCCAAGACA ；AHlR :GAGGACATGCTGCCGTTACA。其中，引物IFAF和IFAR用來檢測人甲型流感病毒，我們稱之為InfA組引物；引物 IFBF和IFBR用來檢測乙型流感病毒，本發明中稱之為InfB組引物；引物AHlF和AHlR用 來檢測新甲型Hmi流感病毒，我們稱之為A(HlNl)組引物。上述方法中，還採用了序列如下所示的探針(見序列表SEQ ID NO :7_10)IFAP CATCAGGCCCCCTCAAAGCCG ；IFBP CGTTGTTAGGCCCTCTGTGGCGA ；AHlP :TTCATGGCCCAATCATGACTCGAACA。優選的，採用Taqman探針檢測的螢光定量PCR的反應模式，上述探針的螢光標記 具體如下IFA-TAMRA :TAMRA-CATCAGGCCCCCTCAAAGCCG-BHQ2 ；IFB-FAM FAM-CGTTGTTAGGCCCTCTGTGGCGA-BHQ1 ；AHl-JOE J0E-TTCATGGCCCAATCATGACTCGAACA-BHQ1。其中，IFA-TAMRA是用來檢測甲型流感病毒的探針，IFB-FAM是用來檢測乙型流感 病毒的探針，AHl-JOE是用來檢測新甲型Hmi流感病毒的探針。上述三種螢光標記的探針 在本發明中被稱之為FAM/J0E/TAMRA多重螢光素標記探針。本發明採用一管多重方式檢測甲型流感病毒、乙型流感病毒和新甲型Hmi流感 病毒時，將上述InfA、InfB和A(HlNl)三組引物和三條Taqman探針混合在一個反應管中， 使用 『PrimeScript—步法RT-PCR試劑盒(Ver. 2)，(TAKARAiPrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver. 2')的RT-PCR緩衝液進行試劑配製，其中引物使用量為7-15pmol，探針使用量為 0. 5-5pmoL·反應總體積為25 μ 1 ；配製試劑體積18 μ 1/反應(預留2 μ 1用於添加酶混合 物；預留5 μ 1用於模板)，該方法的反應條件為50°C 30分鐘，94°C 2分鐘，熱循環為94°C 10 秒，55°C 35秒，共40個循環。需要說明的是，本發明所說的一管多重方式包括在同一反應 管內同時檢測甲型流感病毒、乙型流感病毒和新甲型Hmi流感病毒中的任意兩種病毒或 三種病毒。本發明的目的之二是提供了用於檢測甲型流感病毒、乙型流感病毒和新甲型Hmi 流感病毒的引物和探針。引物序列選自與如下序列中的至少一種相同、相似或互補的序列 (見序列表 SEQ ID NO 1-6)IFAF GAGGTCGAAACGTATGTTCTCTCTATC ；IFAR TCTTCAAGTCTCTGCGCGATT ；IFBF CCCTGCTTGCTCGTAGTATGG ；IFBR GCTTATGGGAAGCACCACTTTG ；
AHlF GGTTTGAGATATTCCCCAAGACA ；AHlR :GAGGACATGCTGCCGTTACA。本發明所提供的用於檢測甲型流感病毒、乙型流感病毒和新甲型Hmi流感病毒 的探針是能與用上述引物擴增得到的核酸序列雜交的序列。優選的，所述探針選自與如序列SEQ ID NO :7_10中的至少一種相同、相似或互補 的序列。所述相似序列是指與上述序列存在個別不同的鹼基，比如1-5個鹼基，只要不影響 擴增效果；不同的鹼基表現可以為在原有序列基礎上插入、缺失、替換等方式。本發明還提供了一種人甲型流感，乙型流感及新甲型Hmi流感病毒一管多重熒 光PCR檢測試劑盒，該試劑盒包含序列如SEQ ID NO :1_6所示的引物。該試劑盒還包含如下的螢光標記探針RSV-FAM :FAM-TATGAATGCCTATGGTGCAGGGCAAG_BHQ ；ADV-TAMRA :TAMRA-AAGAGGCCACTCTTGAGTGCCAGCG_BHQ2 ；HMPl-JOE JOE-AGAGATGTAGGCACCACAAC-MGB ；HMP2-J0E JOE-TGGCCAATTGCCCCAATTTTGC-BHQ1 ；HMP3-J0E JOE-CTAGCCAACTGTCCCAACTTTGCA-BHQl。與現有技術相比，本方法採用自身設計的InfA/InfB/A (HlNl)特異引物及Taqman 探針，使用FAM/J0E/TAMRA多重螢光素標記，實現對infA、infB、A(HlNl)(簡稱為M-ABH1) 的多重檢測，具有特異性高、靈敏度高、快速、操作簡單方便、成本低廉等多種優點，可作為 人甲型流感，乙型流感及新甲型Hmi流感病毒檢測的試劑，用於科研及臨床應用。
具體實施例方式為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這 些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍，下列實施例中未提及的具體實驗 方法，通常按照常規實驗方法進行。實施例1 引物、探針的特異性實驗運用生物信息學和設計引物探針的生物軟體對甲、乙型流感病毒及新甲型Hmi 流感病毒序列資料，分別對甲、乙型流感病毒的保守區進行引物探針設計，對新甲型Hmi 流感病毒的Hl基因的保守區進行引物探針設計，其中探針分別採用TAMRA、FAM、JOE標記。 詳細序列見表1所示，表1為人甲型流感、乙型流感及新甲型Hmi流感病毒引物及探針序 列。表 1InfAIFAFGAGGTCGAAACGTATGTTCTCTCTATCIFARTCTTCAAGTCTCTGCGCGATT[FA-TAMRATAMRA-CATCAGGCCCCCTCAAAGCCG-BHQ2InfBIFBFCCCTGCTTGCTCGTAGTATGGIFBRGCTTATGGGAAGCACCACTTTGIFB-FAMFAM-CGTTGTTAGGCCCTCTGTGGCGA-BHQ1A(HlNl)AHlFGGTTTGAGATATTCCCCAAGACAAHlRGAGGACATGCTGCCGTTACAAHl-JOEJOE-TTCATGGCCCAATCATGACTCGAACA-BHQ1為驗證所設計的引物和探針的特異性，首先設計單重螢光PCR反應，對引物和探 針進行評估，即分別檢測InfA、InfB和A(HlNl)三組引物及相應探針單獨反應的特異性。 實驗採用培養分離的陽性株進行，陽性株來源於廣州呼吸疾病研究所、呼吸疾病國家重點 實驗，分別選擇流感A、流感B，另外用副流感1、副流感2、副流感3、呼吸道合胞病毒RSV、 腺病毒ADV、鼻病毒HRV、偏肺病毒HMP、冠狀病毒229E、0C43、肺炎支原體MP、肺炎衣原體 CP作為陰性對照。實驗分別取100μ 1培養物標本，通過常規RNA/DNA提取方法提取，得 到50 μ 1核酸產物，使用DEPC水對核酸提取產物100倍稀釋後作為模板(其中H5W不進 行稀釋，冠狀病毒及偏肺病毒產物稀釋10倍)。使用『PrimeScript —步法RT-PCR試劑盒 (Ver. 2) 』 (TAKARA iPrimeScript One Step RT-PCR KitVer. 2')中的 RT-PCR 緩衝液進行 試劑配製，其中引物使用量為7-15pmol，探針使用量為0. 5-5pmol。反應總體積為25 μ 1 ； 配製試劑體積18 μ 1/反應(預留2 μ 1用於添加酶混合物；預留5 μ 1用於添加模板)，在 八排管中分別加入18 μ L流感Α、流感B、新甲流Hmi的單重反應液，最後放置於螢光定量 PCR儀中反應，反應條件如下50°C 30分鐘，94°C 2分鐘，熱循環為94°C 10秒，55°C 35秒， 共40個循環，表2為單重infA、infB、A(HlNl)試劑檢測80株陽性病毒株的情況，其中流 感A(H3N213株、普通HmilO株、新甲流Hmill株、H5N1滅活標本1株、H9亞型株1株)、 流感B 20株，另外有副流感1、副流感2、副流感3、呼吸道合胞病毒RSV、腺病毒ADV、鼻病毒 HRV、偏肺病毒HMP、冠狀病毒229E、0C43、肺炎支原體MP、肺炎衣原體CP各2株作為陰性對 照。表2
單重試劑檢測結果InfAInfBA(HlNl)陽性362011陰性446069總計808080 實驗結果中，陽性結果與預期完全符合，與其他常見呼吸道病原體副流感1、副流 感2、副流感3、呼吸道合胞病毒RSV、腺病毒ADV、鼻病毒HRV、偏肺病毒HMP、冠狀病毒229E、 0C43、肺炎支原體MP、肺炎衣原體CP等無交叉反應，infA-infB、A (HlNl)-infB之間亦無交 叉反應，infA-A (HlNl)在普通流感A時無交叉反應，特異性高。
實施例2 =M-ABHl多重檢測試劑的特異性實驗多重檢測試劑使用TAKARA iPrimeScript 一步法RT-PCR試劑盒 (Ver. 2) 『 (TAKARA iPrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver. 2')的 RT-PCR 緩衝液進行 試劑配製，其中引物的使用量為7-15pmol，探針的使用量為0. 5-5pmol。將表1中的InfA/ InfBA(HlNl)引物及各條探針配製為一管反應液(M-ABHl)。反應總體積為25 μ 1/反應， 配製試劑體積18 μ 1/反應，預留2 μ 1用於添加酶混合物；預留5 μ 1用於添加模板。分別 使用單陽性模板(普通流感A ；流感B或新甲流Hmi)；雙陽性模板(普通流感A-流感B; 普通流感A-新甲流Hmi ；流感B-新甲流Hmi)；三陽性模板(普通流感A-流感B-新甲流 Η1Ν1)對多重檢測試劑進行實驗，同時使用單重螢光PCR試劑進行對比。實驗結果見表3， 表3是各種模板情況下多重M-ABHl流感病毒檢測試劑與單重檢測的對比。表權利要求
人甲、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒一管多檢方法，包括樣品核酸的製備和多重PCR擴增步驟，其特徵在於，所述多重PCR擴增步驟中採用了序列如SEQ ID NO1 6所示的引物。
2.根據權利要求1所述的多檢方法，其特徵在於，所述多重PCR擴增步驟中還採用了序 列如SEQ ID N0:7-9所示的探針。
3.根據權利要求1所述的多檢方法，其特徵在於，所述多重PCR擴增步驟中還採用了如 下螢光標記的探針IFA-TAMRA :TAMRA-CATCAGGCCCCCTCAAAGCCG-BHQ2 ；IFB-FAM :FAM-CGTTGTTAGGCCCTCTGTGGCGA-BHQ1 ；AHl-JOE JOE-TTCATGGCCCAATCATGACTCGAACA-BHQ1。
4.用於人甲、乙型流感及新甲型Hmi流感病毒一管多檢的引物，其特徵在於，所述引 物序列選自與如SEQ ID NO :1-6序列中的至少一種相同、相似或互補的序列。
5.用於人甲、乙型流感及新甲型Hmi流感病毒一管多檢的探針，其特徵在於，所述探 針能與用權利要求4所述的引物擴增的核酸序列雜交的序列。
6.根據權利要求5所述的探針，其特徵在於，所述探針選自與如SEQIDN0:7-9序列中 的至少一種相同、相似或互補的序列。
7.一種人甲、乙型流感及新甲型Hmi流感病毒一管多檢試劑盒，其特徵在於，所述試 劑盒包含如權利要求1所述的引物。
8.根據權利要求7所述的多檢試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒還包含如權利要求3所 述的螢光標記探針。
全文摘要
本發明提供了一種人甲型流感、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒的一管多重螢光PCR檢測方法，該方法採用了序列如SEQ ID NO1-6所示的引物，還採用了序列如SEQ ID NO7-9所示的探針。本發明還提供了一種人甲型流感、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒一管多重螢光PCR檢測試劑盒，該試劑盒包含上述引物和探針。本發明採用InfA/InfB/A(H1N1)特異引物及Taqman探針，使用FAM/JOE/TAMRA多重螢光素標記，實現對人甲型流感、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒的多重檢測，具有特異性高、靈敏度高、快速、操作簡單方便、成本低廉等優點，可作為多重檢測試劑，用於科研及臨床應用。
文檔編號C12Q1/70GK101942525SQ20101017135
公開日2011年1月12日 申請日期2010年5月6日 優先權日2010年5月6日
發明者劉文寬, 周榮, 蘇曉波, 高文娟 申請人:廣州市華南醫學病毒學研究所;廣州呼吸疾病研究所