包含人HSP70ATPase結構域與抗原肽的融合蛋白及其應用的製作方法

2023-09-23 20:14:00 6

專利名稱：包含人HSP70 ATPase結構域與抗原肽的融合蛋白及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種包含熱休克蛋白的三磷酸腺苷酶(以下簡稱ATPase)結構域和抗原肽的融合蛋白，更具體地說，本發明涉及包含人HSP70 ATPase結構域與人乳頭瘤病毒E7、E6蛋白或者哺乳動物p53蛋白的融合蛋白。本發明還涉及包含上述融合蛋白的藥物組合物、編碼上述融合蛋白的基因、包含所述基因的表達載體及其在製備用於治療或預防人乳頭瘤病毒相關的腫瘤或p53蛋白過量表達有關的腫瘤的藥物中的用途。
背景技術：
很久以前就發現熱休克蛋白(heat shock protein，Hsp)具有促進蛋白質分子正確摺疊的作用。最近又發現Hsp70、Hsp90及Grp94(也稱gp96)可以將腫瘤抗原肽提交給抗原提呈細胞(antigen presenting cells，APCs)的MHC分子上，並被T細胞識別(綜述見Srivastava and Amato，2001；Srivastava，2003)。Hsps通過肽結合域以非共價形式和腫瘤抗原肽結合，形成Hsp和抗原肽複合物，作用於APCs表面的Hsp受體(CD91)後被內吞入細胞內，然後Hsp和抗原肽複合物進入內質網，抗原肽從Hsp上釋放出來並和MHC分子結合，抗原肽被MHC分子呈遞到APC表面。此外，Hsp分子還可通過促炎細胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α的產生(van Eden et al，2003)，強烈激活先天免疫。因此，Hsp和腫瘤抗原肽複合物可通過先天免疫和後天免疫的加強，抵抗癌症的發生以及病毒和細菌感染。
Hsp分子和抗原肽融合蛋白是通過共價鍵將Hsp分子和抗原肽連接在一起。有證據表明，這種融合蛋白可有效地促進針對抗原肽的免疫反應(Chu etal，2000)。WO2004/098526A2和RU2229307C1中公開了可將HSP70或其C端活性結構域與HPV的E6或E7蛋白融合構建成融合蛋白，用於抗腫瘤或感染性疾病，並且可增強免疫反應。WO0049041A1中提及在抗癌或治療感染的融合蛋白中可用熱休克蛋白的ATPase結構域與抗原肽融合。CN1401778A中公開了可將腺病毒載體與人p53基因構建成重組體用於治療惡性腫瘤。CN1380392A提供了一種新的共表達人p53基因和人細胞因子(如白細胞介素2)基因的重組腺病毒。
但是，全長的Hsp70和腫瘤抗原肽或病原體抗原形成的融合蛋白表達量很低，很難進行工業生產規模的放大。

發明內容
本發明一方面提供了一種融合蛋白，包含人Hsp70的ATPase結構域以及人乳頭瘤病毒的E7蛋白和人乳頭瘤病毒的E6蛋白中的一種。
本發明還提供了一種用於治療或預防人乳頭瘤病毒相關腫瘤的藥物組合物，包含有效量的本發明的融合蛋白。
本發明還提供了一種核酸分子，其編碼本發明的融合蛋白。本發明還提供了包含所述核酸分子以及必要的基因調控元件的表達載體。
本發明還提供了所述融合蛋白、核酸分子以及表達載體在製備用於治療或預防人乳頭瘤病毒相關腫瘤的藥物中的用途。
在本發明的這一方面中，所述人乳頭瘤病毒相關腫瘤選自宮頸癌、肛門上皮內瘤、子宮頸上皮內瘤、肛門生殖器疣、復發呼吸道乳頭狀瘤及陰道上皮內腫瘤。
本發明另一方面提供了一種融合蛋白，包含人Hsp70的ATPase結構域以及哺乳動物的p53蛋白。在一個優選實施方式中，所述的p53蛋白來源於人。
本發明還提供了一種用於治療或預防與突變引起的p53蛋白過量表達有關的腫瘤的藥物組合物，包含有效量的本發明的融合蛋白。
本發明還提供了一種核酸分子，其編碼本發明的融合蛋白。本發明還提供了包含所述核酸分子以及必要的基因調控元件的表達載體。
本發明還提供了所述融合蛋白、核酸分子以及表達載體在製備用於治療或預防與突變引起的p53蛋白過量表達有關的腫瘤的藥物中的用途。
本發明採用Hsp70的ATPase結構域構建融合蛋白，使其在E.coli中的表達水平大幅提高。用Hsp70的ATPase結構域構建的融合蛋白仍然保留了ATPase活性，而且對與之結合的腫瘤抗原或病原體抗原具有強免疫反應。
與現有技術中採用的細菌熱休克蛋白相比，本發明採用人源HSP70的ATPase結構域構建融合蛋白，使機體的不良反應更小，免疫效果更好。
本發明人意外地發現，本發明的融合蛋白取得了特別好的效果，對腫瘤細胞的殺傷活性顯著高於對照組。在小鼠中進行的試驗表明，本發明的融合蛋白作為疫苗免疫動物，既能產生治療性作用，也能產生預防性作用。所以，本發明融合蛋白在抗腫瘤或感染疾病的治療上具有廣闊前景。


附圖不一定是成比例的，其目的僅僅在於更好地解釋本發明，以便於讀者理解。將附圖與具體實施方式
結合在一起，可以更好地理解本發明。
圖1示出了AE7預防性免疫對TC-1荷瘤小鼠的保護作用。第2次免疫後10天，在小鼠右側接種1.3×105TC-1細胞，觀察38天內腫瘤發生率。第44天時(彎箭頭)對無瘤小鼠再次接種(左側)5×105TC-1細胞，同時新取1組未經處理的小鼠也接種同樣劑量的TC-1細胞，作為對照組，繼續觀察40天。
圖2示出了AE7治療性免疫對TC-1荷瘤小鼠的保護作用。在小鼠右側接種1.3×105TC-1細胞後第5和第19天，用135μg AE7或PBS免疫小鼠，觀察腫瘤發生率。第49天時(彎箭頭)對無瘤小鼠再次接種(左側)5×105TC-1細胞，同時新取1組未經處理的小鼠也接種同樣劑量的TC-1細胞，作為對照組，繼續觀察39天。AE7免疫治療可顯著降低腫瘤發生率(A)、提高長期存活(B)、抑制腫瘤生長(C)。
圖3示出了AE7誘導的特異性CTL反應。C57BL/6(n＝3)分別用PBS、AE7或E7免疫，7天後，取脾細胞和絲裂黴素C處理的TC-1細胞孵育5天，分別以TC-1細胞(A)和Lewis肺癌細胞(B)作為靶細胞檢測CTL活性。
圖4示出了AE6預防性免疫對TC-1荷瘤小鼠的保護作用。第2次免疫後10天，在小鼠右側接種1.3×105TC-1細胞，觀察32天內腫瘤發生率。第36天時(彎箭頭)對無瘤小鼠再次接種(左側)5×105TC-1細胞，同時新取1組未經處理的小鼠也接種同樣劑量的TC-1細胞，作為對照組，繼續觀察30天。
圖5示出了AE6治療性免疫對TC-1荷瘤小鼠的保護作用。在小鼠右側接種1.3×105TC-1細胞後第5和第19天，用127μg AE6或PBS免疫小鼠，觀察腫瘤發生率。第42天時(彎箭頭)對無瘤小鼠再次接種(左側)5×105TC-1細胞，同時新取1組未經處理的小鼠也接種同樣劑量的TC-1細胞，作為對照組，繼續觀察39天。AE6免疫治療可顯著降低腫瘤發生率(A)，提高長期存活(B)。
圖6示出了hAP53預防性免疫延長荷瘤小鼠的存活(Kaplan-Meier分析)。
圖7示出了hAP53治療性免疫延長荷瘤小鼠的存活。
圖8示出了hAP53誘導的mp53-p815細胞特異性的CTL反應。其中，Amp53-p815靶細胞，Bp815靶細胞；*P＜0.05，**P＜0.01與PBS組比較。
圖9示出了hAP53免疫對NK細胞殺傷活性的影響。
具體實施例方式
本發明的融合蛋白中，除了人HSP70的三磷酸腺苷酶結構域以及人乳頭瘤病毒的E7/E6蛋白或者哺乳動物p53蛋白之外，還可以含有其它序列，例如親和純化標籤(例如His Tag)等。
本發明還提供了一種藥物組合物，其中包含治療或預防有效量的本發明的融合蛋白。本發明的藥物組合物中還可以含有合適量的藥學上可接受的載體，以便提供適於向病人給藥的形式。在一個具體實施方式
中，術語「藥學上可接受的」是指經國家藥品管理機構批准或列在中國藥典或其它公認的用於哺乳動物尤其是人的外國藥典上。術語「載體」是指與治療劑一同給藥的稀釋劑、佐劑、賦形劑等。這樣的藥物載體可以是無菌液體，如水和油的鹽溶液，包括石油，動物，植物或合成的來源的，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當藥物組合物用於靜脈施用時，鹽溶液是優選的載體。鹽溶液、葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以作為液體載體，特別是作為注射用溶液。合適的藥物賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、凝膠、麥芽、大米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油、滑石、氯化鈉、乾粉脫脂牛奶、甘油、丙二醇、水、乙醇等。
術語「有效量的」是指提供臨床醫師或者其他有資格的觀察人員注意到的客觀上可鑑定的改善的藥物劑量。
編碼本發明融合蛋白的核酸分子可以和必要的基因調控元件可操作地連接，例如啟動子、增強子、篩選標記等。
在本文中，術語「蛋白」、「蛋白質」、「肽」、「多肽」可以互換使用，表示由兩個或更多個胺基酸通過肽鍵連接而形成的聚合物。
本文中所用的術語「人乳頭瘤病毒相關腫瘤」是指與人乳頭瘤病毒有關的腫瘤，包括但不限於宮頸癌(cervical cancer)、肛門上皮內瘤(analintraepithelial neoplasia)、子宮頸上皮內瘤(cervical intraepithelialneoplasia)、肛門生殖器疣(anogenital warts)、復發呼吸道乳頭狀瘤(recurrent respiratory papillomatosis)及陰道上皮內腫瘤(vulvalintraepithelial neoplasia)等。
本文中所用的術語「與突變引起的p53蛋白過量表達有關的腫瘤」是指該腫瘤的發展與突變引起的p53蛋白過量表達有關。該腫瘤可以發生在機體的各個部位，包括肝臟、肺、腎、結腸、子宮等部位。在該類腫瘤中，p53基因發生突變從而導致p53蛋白過量表達，並被提呈至腫瘤細胞的表面。
為了更加詳細地解釋本發明，下面將結合附圖給出本發明的具體實施方式
。這些具體實施方式
僅僅是出於解釋和說明的目的，不應該被理解為是對本發明範圍的限制。在對這些具體實施方式
進行描述時，沒有對公知的實驗方法、儀器、試劑和材料等進行詳細的描述，以避免喧賓奪主、淡化了本發明的主要內容。
實施例1、重組人HSP70 ATPase結構域與HPV E7融合蛋白(AE7)編碼基因的構建及表達人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)的E7和E6蛋白在HPV感染病人的腫瘤發生方面具有重要作用(Fehrmann and Laimins，2003)，因此，HPV感染病人細胞表面的E7和E6蛋白作為腫瘤抗原可以被T細胞識別。Hsp70的ATPase域和E7/E6組成的融合蛋白可以增強人體對HPV病毒及其引發的宮頸癌的免疫反應。我們將Hsp70的ATPase域和E7的融合蛋白稱為AE7，將Hsp70的ATPase域和E6的融合蛋白稱為AE6。
人Hsp70 ATPase域基因(胺基酸殘基1-386)從人Hsp70全長基因通過PCR獲得。HPV病毒16型E7基因從該病毒基因組PCR獲得。Hsp70ATPase域PCR產物用限制性內切酶NdeI和BamH I酶切連接到S28b載體，並命名為S28bA。HPV E7的PCR產物用限制性內切酶BamH I和Xho I酶切連接到S28bA，命名為S28bAE7，對AE7核酸序列進行測序確證。AE7純品的ATPase活性用孔雀綠法檢測，結果表明重組AE7具有水解ATP的全部功能。
將轉化有AE7表達質粒的大腸桿菌菌株BL21(DE3)在含有50μg/ml卡那黴素的LB液體培養基中於37℃高密度發酵，OD600達45-50時，加入500mM IPTG誘導表達5小時，離心收菌。用A液(25mM Tris-HCl，50～100mM NaCl，5mM EDTA，pH7.5)洗滌3次後，再用A液懸浮沉澱，超聲破碎，1200～1800W功率，每次10秒，間隔10秒，共超破60～80次，超破溫度10度；超破結束後離心收集沉澱即為包涵體。包涵體依次用B液(25mM Tris-HCl，50～100mM NaCl，pH7.5)和C液(25mM Tris-HCl，50～100mM NaCl，1.5％TritonX-100，1.5～2.0M(NH2)2CO，pH7.5)各洗滌3次後，再用B液洗滌1次。將沉澱按重量體積比為1∶1的比例加入B液混勻，再按重量體積比為1∶10～1∶20的比例加入D液(25mM Tris-HCl，50～100mMNaCl，5～10mM DDT，6～8M(NH2)2CO，pH7.5)混勻，室溫攪拌2小時以上，10000～18000rpm離心30分鐘，收集上清即為包涵體變性液G。
緩慢將G液滴加入E液(25mM Tris-HCl，0.1～0.3mM NaCl，1mMDDT，1M(NH2)2CO，5mM EDTA，10mM KCl，0.3M Arg，pH8.0)中，至蛋白終濃度為0.2～0.5mg/ml，即為稀釋復性液H，然後，將H液灌透析袋和E液按1∶5的體積比例透析過夜。
用I液(25mM Tris-HCl，pH8.0)平衡DEAE層析柱，取透析後的H液上樣，然後用I液衝洗，再依次用J液(25mM Tris-HCl，0.1mM NaCl，pH8.0)和K液(25mM Tris-HCl，0.5mM NaCl，pH8.0)洗脫，收集洗脫峰，即為AE7 DEAE收集峰S。
用N液(25mM Tris-HC，0.2NaCl pH8.0)平衡層析柱，取S液上樣，上樣結束後依次用N液、O液(25mM Tris-HC，0.2NaCl，25mM咪唑，pH8.0)和P液(25mM Tris-HC，0.2NaCl，0.5％Triton，pH8.0)衝洗，用Q液(25mM Tris-HC，0.2NaCl，500mM咪唑，pH8.0)洗脫收集洗脫峰，即為AE7親和收集峰T。
用R液(10mM檸檬酸鈉，0.2NaCl)平衡層析柱，取T液按柱體積的1～3％上樣，上樣結束後，用R洗脫，收集洗脫峰，即為AE7純化液。用SDS-PAGE檢驗純度＞95％。
實施例2、重組人HSP70 ATPase結構域與HPV E6融合蛋白(AE6)編碼基因的構建及表達HPV病毒16型E6基因從該病毒基因組PCR獲得，PCR產物用限制性內切酶BamH I和Xho I酶切連接到S28bA，命名為S28bAE6，對AE6核酸序列進行測序確證。
S28bAE6質粒轉化入E coli BL21(DE3)菌株進行蛋白表達。AE6蛋白的表達方法與AE7相同。AE6蛋白復性和純化與AE7類似，AE6的ATPase活性用孔雀綠法檢測，結果表明重組AE6具有水解ATP的全部功能。
實施例3、重組人HSP70 ATPase結構域與人p53融合蛋白(hAP53)編碼基因的構建及表達人p53基因以人肝cDNA文庫為模板通過PCR獲得。人p53基因的PCR產物用限制性內切酶酶切後連接到S28bA，命名為S28bhAP53，通過DNA測序確證目的基因的核酸序列。
hAP53的蛋白表達、復性和純化方法與AE7類似，ATPase活性用孔雀綠法檢測，結果表明重組hAP53具有水解ATP的全部功能。
實施例4、本發明藥物AE7和AE6對C57BL/6小鼠TC-1移植瘤的預防和治療作用在本實施例中，所用動物為雌性C57BL/6小鼠，6-8周大小。
瘤株TC-1細胞株(ATCC)，來自C57BL/6小鼠原代肺上皮細胞，攜帶HPV-16(人乳頭瘤病毒)的E6/E7及人c-Ha-ras致癌基因。
TC-1細胞培養以RPMI1640(Gibco)+10％FBS(Hyclone)為培養基，在37℃，5％CO2孵箱中培養。
TC-1細胞接種剪去小鼠右側被毛(或用8％Na2S脫毛)，75％酒精消毒皮膚，取0.2ml TC-1細胞懸液(約含1.3×105個細胞)皮下注射，此後每隔3-4天觀察腫瘤生長情況，並用遊標卡尺測量腫瘤的長寬徑，按公式長×寬2÷2計算腫瘤體積，繪製腫瘤體積生長變化圖。
免疫程序1治療作用研究右側接種1.3×105個TC-1細胞後5天，取0.2ml AE7(135μg)、AE6(127μg)或等體積PBS注射於小鼠頸部皮下(每組10隻)，進行初次免疫；14天後以相同劑量免疫第2次。接種腫瘤後約40天，在AE7或AE6組無瘤小鼠的左側接種5×105個TC-1細胞，繼續觀察約30天。同時另取一批未接受過任何處理的小鼠，左側接種5×105個TC-1細胞作為對照。
2預防作用研究取0.2ml AE7(135μg)、AE6(127μg)或等體積PBS注射於小鼠頸部皮下(每組10隻)，進行初次免疫，14天後以相同劑量免疫第2次。再10天後，給小鼠接種1.3×105個TC-1細胞，約30天後，在AE7或AE6組無瘤小鼠的左側接種5×105個TC-1細胞，繼續觀察約30天。同時另取一批未接受過任何處理的小鼠，左側接種5×105個TC-1細胞作為對照。
免疫小鼠細胞毒性T淋巴細胞(CTL)對TC-1的體外殺傷活性檢測C57BL/6小鼠(每組3-4隻)分別頸部皮下注射AE7(135μg)、E7或PBS，共兩次，間隔7天，末次免疫後7天，將每組分離的小鼠脾細胞合併後，用淋巴細胞分離液分離，2×107個脾細胞和1×106個絲裂黴素C處理的TC-1細胞在6孔板中混合培養5天，然後用淋巴細胞分離液分離出脾細胞，作為效應細胞；以TC-1作為靶細胞，每孔10000個，效應細胞和靶細胞的比例分別為11∶1、33∶1、100∶1(重複3次)，培養4h後，取上清，用非放射性的細胞毒檢測試劑盒(Promega)檢測乳酸脫氫酶的釋放量。按下述公式計算細胞裂解百分率 結果一、AE7免疫對TC-1荷瘤小鼠的保護作用1AE7預防性免疫對接種TC-1腫瘤小鼠的保護作用經兩次AE7免疫後接種TC-1，PBS對照組3-4天後開始形成腫瘤結節，在觀察期內，腫瘤發生率為100％；AE7組僅在觀察後期，發現10隻小鼠中的1隻有腫瘤，AE7的保護率為90％。AE7組的無瘤小鼠再次接種更大劑量的TC-1後，9隻小鼠中仍然有8隻無腫瘤，而同期對照組腫瘤發生率為100％。(Fig1)2AE7治療性免疫對TC-1荷瘤小鼠的保護作用接種TC-1後第5天，AE7和PBS對照組均有30％-40％的小鼠形成腫瘤，此時開始免疫，免疫後第9天，對照組腫瘤發生率達100％，AE7組為60％，隨後AE7組小鼠腫瘤逐漸消失，至第2次免疫前，AE7組腫瘤發生率已降至30％，而對照組仍為100％。第2次免疫後，AE7組腫瘤發生率降至20％。AE7組的8隻無瘤小鼠，再次接種更大劑量的TC-1後，最終也未發現腫瘤(Fig2a)。在88天的觀察期內，AE7組小鼠無死亡，對照組死亡90％(Fig2b)。與對照組比較，AE7組兩隻小鼠的腫瘤生長速度非常緩慢(Fig2c)。
3AE7免疫可增加TC-1特異性的CTL細胞的殺傷活性AE7免疫小鼠的脾細胞中TC-1細胞特異性的CTL的殺傷活性顯著高於E7對照組和PBS對照組(p＜0.01)，而E7免疫小鼠脾細胞對TC-1細胞的的殺傷活性與PBS對照組無明顯差別(p＞0.05)(Fig3)。
二、AE6免疫對TC-1荷瘤小鼠的保護作用1AE6預防性免疫對接種TC-1腫瘤小鼠的保護作用用與AE7相同劑量(按摩爾數)的AE6免疫後，可提供70％的保護率，即70％小鼠不出現腫瘤；PBS組的1隻無瘤小鼠再次接種更大劑量的TC-1後，很快長出腫瘤，而AE6組無瘤小鼠再次接種TC-1後，7隻小鼠中仍然有6隻無腫瘤(Fig4)。
2AE6治療性免疫對TC-1荷瘤小鼠的保護作用先接種TC-1，再用AE6治療，僅50％小鼠不出現腫瘤；該組的無瘤小鼠再次接種更大劑量的TC-1後，有1隻小鼠一過性出現腫瘤，觀察期末，均未有腫瘤(Fig5)。
結論AE6和AE7無論是預防性免疫還是治療性免疫，均對表達E6/E7抗原的腫瘤細胞TC-1有顯著的抑制作用，而且AE7對接種TC-1小鼠的保護作用明顯優於AE6。小鼠CTL細胞對TC-1的特異性裂解實驗表明，細胞免疫的誘導可能是AE7/AE6發揮作用的主要機制。
實施例5、本發明藥物hAP53對Balb/c小鼠mp53-p815移植瘤的預防和治療作用在本實施例中，所用動物為雌性Balb/c小鼠，6-8周大小。
腫瘤細胞系mp53-P815的建立將質粒pRC/CMVp53(含135位Cys→Tyr點突變的人p53基因)，採用lipofectamine共轉染法導入P815小鼠肥大瘤細胞系(mouse mastocytoma cellline，from ATCC)，以含600mg/L G418的培養液選擇抗性克隆，並以免疫細胞化學染色法初檢p53蛋白的表達，所獲陽性克隆進一步用有限稀釋法再克隆化培養，用Westernblot檢測p53蛋白的表達。挑選p53表達高、全陽性的克隆作為表達突變p53蛋白的腫瘤細胞系mp53-P815，置於含600mg/L G418的DMEM培養基中培養。本實施例中構建含135位Cys→Tyr點突變的人p53基因，是因為癌症患者經常伴有該位點基因突變，發生該突變的人p53基因大量異常表達有功能缺陷的p53蛋白，並被MHC I類分子提呈至腫瘤細胞表面。而在正常人體內，人p53基因的表達量很低。
免疫程序1治療作用研究20隻小鼠，分兩組(n＝10)hAP53治療組和PBS對照組。分別於小鼠尾靜脈接種致死劑量1×106的mp53-P815細胞後第3天和第13天，取0.2ml hAP53 200μg或等體積PBS注射於小鼠頸部皮下，進行免疫。觀察各免疫組小鼠的存活時間和存活率。
2預防作用研究20隻小鼠，分兩組(n＝10)hAP53組和PBS對照組。取0.2ml hAP53 200μg或等體積PBS注射於小鼠頸部皮下，進行首次免疫，間隔10天後，行第2次免疫。此後第10天，給小鼠尾靜脈接種致死劑量(1×106)的P815-mp53細胞，觀察各免疫組小鼠的存活時間和存活率。
CTL及NK細胞殺傷活性的測定將合併的各組小鼠的脾細胞(每組3-4隻)，用淋巴細胞分離液分離，2×107個脾細胞和2×106個絲裂黴素C處理的mp53-P815細胞在6孔板中混合培養5天，然後用淋巴細胞分離液分離出脾細胞，作為效應細胞；以mp53-P815細胞作為靶細胞，每孔10000個，效應細胞和靶細胞的比例分別為20∶1、40∶1、80∶1(重複3次)，培養4h後，取上清，用非放射性的細胞毒檢測試劑盒(Promega)檢測乳酸脫氫酶的釋放量。按下述公式計算細胞裂解百分率 小鼠脾細胞分離後可立即進行NK細胞活性檢測，每孔10000個YAC-1靶細胞，效應細胞和靶細胞的比例及檢測方法同上。
結果1hAP53預防性免疫對mp53-P815荷瘤小鼠的保護作用在接種致死劑量的mp53-P815腫瘤細胞13天後，對照組小鼠開始陸續死亡，28天內全部死去，平均存活期為22.4±1.33天。而hAP53組在接種腫瘤25天後開始死亡，70天的觀察期內僅有4隻(40％)小鼠死去，平均存活期為57.1±5.19天，顯著長於對照組(P＜0.001)，表明hAP53的預防免疫可顯著延長荷瘤小鼠的存活期。(圖6)2hAP53治療性免疫對mp53-P815荷瘤小鼠的保護作用對照組小鼠在接種mp53-P815腫瘤後35天內全部死去，平均存活期為25.7±2.27天。而接種腫瘤3天後開始的hAP53免疫治療，仍然使小鼠的存活期大大延長，觀察結束時，只有7隻小鼠死亡，平均存活期為47.9±2.27天，顯著長於對照組(P＜0.01)(圖7)。
3hAP53免疫可增加特異性CTL細胞的殺傷活性hAP53或PBS加強免疫後1周，取兩組各3隻小鼠的脾細胞，進行mp53-p815細胞特異性的CTL的殺傷活性檢測，可見hAP53組mp53-p815細胞特異性的CTL反應顯著高於PBS對照組(p＜0.01，或＜0.05)，而hAP53組對p815細胞的CTL反應與PBS組無明顯差別(p＞0.05，圖8)。對NK細胞的殺傷活性檢測表明，hAP53組和PBS組的NK細胞對YAC-1靶細胞的殺傷活性無明顯差別(p＞0.05，圖9)。以上結果表明，hAP53增強了特異性的T細胞介導的細胞免疫反應。
結論hAP53無論是預防性免疫還是治療性免疫，均可顯著延長接種mp53-p815腫瘤小鼠的生存期，特異性CTL殺傷活性的增強是hAP53發揮抗腫瘤作用的主要機制。
上述實施例中所涉及的具體實驗方法可以參考Molecular CloningALABORATORY MANUAL(3rd Edition)(J.Sambrook，P.MacCallum，D.Russell，Cold Spring Harber Laboratory Press，2001)以及黃培堂等(2002)譯的《分子克隆實驗指南》。
本文中所涉及的參考文獻，包括專利文件、學術論文、出版物等，均以引用的方式將其全部內容包括在本文中。
應當注意，本發明中所涉及的各種實驗操作，均為本領域的常規技術，如果在文中沒有特別說明，則本領域的普通技術人員可以參照本發明申請日之前的各種常用工具書、科技文獻或相關的說明書、手冊等加以實施。
本文中所涉及的各種實驗用品(包括但不限於化學試劑、生物製品、細胞、生物體、儀器等)之中，對於那些特殊的或不易獲得的，文中均已註明了製造商、參考文獻或詳細的製備方法；未經特別說明的，均為常規實驗用品，在本發明申請日之前，可以通過各種方式(例如購買、自行製備等)很方便地獲得。
應當理解，在不偏離本發明的精神和範圍的情況下，本領域的普通技術人員可以在形式和細節上對其做出各種改變和改進，而這些均被認為落入了本發明的保護範圍。例如，根據密碼子簡併原則或鹼基互補原則所獲得的功能基本相同的核酸分子，以及在對蛋白質功能不起主要作用的位點上進行胺基酸替換所得到的功能基本相同的蛋白質或多肽，均被認為落入了本發明的保護範圍。
參考文獻Basu，S.，R.J.Binder，T.Ramalingam，P.K.Srivastava.2001.CD91 is acommon receptor for heat shock proteins gp96，hsp90，hsp70，and calreticulin.Immunity 14303.
Chu NR，Wu HB，Wu T，Boux LJ，Siegel MI，Mizzen LA.Immunotherapyof a human papillomavirus(HPV)type 16 E7-expressing tumour byadministration of fusion protein comprising Mycobacterium bovis bacilleCalmette-Guerin(BCG)hsp65 and HPV16 E7.Clin Exp Immunol.2000Fehrmann F，Laimins LA.Human papillomavirusestargetingdifferentiating epithelial cells for malignant transformation.Oncogene.2003Srivastava，PK.Hypothesiscontrolled necrosis as a tool forimmunotherapy of human cancer.Cancer Immun.2003Srivastava PK，Amato RJ.Heat shock proteinsthe′Swiss Army Knife′vaccines against cancers and infectious agents.Vaccine.2001van Eden W，Koets A，van Kooten P，Prakken B，van der Zee R.Immunopotentiating heat shock proteinsnegotiators between innate dangerand control of autoimmunity.Vaccine.200權利要求
1.一種融合蛋白，包含人HSP70的三磷酸腺苷酶結構域；以及人乳頭瘤病毒的E7蛋白和人乳頭瘤病毒的E6蛋白中的一種。
2.根據權利要求1的融合蛋白，其中所述融合蛋白由如下組分構成人HSP70的三磷酸腺苷酶結構域；以及人乳頭瘤病毒的E7蛋白和人乳頭瘤病毒的E6蛋白中的一種。
3.一種用於治療或預防人乳頭瘤病毒相關腫瘤的藥物組合物，其中包含有效量的權利要求1或2的融合蛋白。
4.一種核酸分子，其編碼權利要求1或2的融合蛋白。
5.一種表達載體，包含權利要求4的核酸分子以及必要的基因調控元件。
6.權利要求1或2的融合蛋白、權利要求4的核酸分子或權利要求5的表達載體在製備用於治療或預防人乳頭瘤病毒相關腫瘤的藥物中的用途。
7.一種融合蛋白，包含人HSP70的三磷酸腺苷酶結構域以及哺乳動物的p53蛋白。
8.根據權利要求7的融合蛋白，其中所述融合蛋白由人HSP70的三磷酸腺苷酶結構域以及哺乳動物的p53蛋白構成。
9.根據權利要求7或8的融合蛋白，其中所述哺乳動物為人。
10.一種用於治療或預防與突變引起的p53蛋白過量表達有關的腫瘤的藥物組合物，包含有效量的權利要求7-9之任一項的融合蛋白。
11.一種核酸分子，其編碼權利要求7-9之任一項的融合蛋白。
12.一種表達載體，包含權利要求11的核酸分子以及必要的基因調控元件。
13.權利要求7-9之任一項的融合蛋白、權利要求11的核酸分子或權利要求12的表達載體在製備用於治療或預防與突變引起的p53蛋白過量表達有關的腫瘤的藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及一種包含熱休克蛋白的三磷酸腺苷酶(以下簡稱ATPase)結構域和抗原肽的融合蛋白，更具體地說，本發明涉及包含人HSP70 ATPase結構域與人乳頭瘤病毒E7、E6蛋白或者哺乳動物p53蛋白的融合蛋白。本發明還涉及包含上述融合蛋白的藥物組合物、編碼上述融合蛋白的基因、包含所述基因的表達載體及其在製備用於治療或預防人乳頭瘤病毒相關的腫瘤或p53蛋白過量表達有關的腫瘤的藥物中的用途。
文檔編號A61K38/43GK1919872SQ200510096588
公開日2007年2月28日 申請日期2005年8月25日 優先權日2005年8月25日
發明者朱冰 申請人:沙東生物藥業(天津)有限公司