定量目標生物體和產生腎形線蟲抗性棉花植物的方法
2023-09-23 00:41:05
專利名稱：定量目標生物體和產生腎形線蟲抗性棉花植物的方法
技術領域：
本發明公開了對存在於特定位置的植物病原體、尤其是在農作物的根圍中度過其生活周期的至少一部分的植物病原體進行定量的方法。本發明的實施方式包括將對於物質樣品中目標生物體特異性的DNA序列的量與物質樣品中DNA的總量相比較以定量物質樣品中存在的目標生物體的相對量的方法。提供的非限制性例子公開了定量存在於物質樣品如土壤中的腎形線蟲(腎形腎狀線蟲(Rotylenchulus reniformis))和/或根結線蟲((南方根結線蟲)Meloidogyne incognita)的絕對數和相對數的新方法。本發明通過使得使用者能夠快速評估在特定地點種植作物的風險、確定如何最好地處理已在特定地點生長的作物以應對感染、預測和追蹤在地點內或之間感染的發生以及研究植物或植物種群對抗腎形線蟲感染的變異性而幫助疾病控制和研究。本發明的其它實施方式包括可用於檢測棉花植物中與腎形線蟲抗性相關的核苷酸序列的分子標誌物和將這些序列從一種植物滲入另一種植物以產生包含一個或多個腎形線蟲抗性基因座的新種質的方法。
發明內容
這裡公開的本發明包括一種測定物質樣品中目標生物體水平的快速方法。這種感染指數方法包括得出樣品中檢測的DNA總量與通過PCR擴增對目標生物體特異性的序列檢測的樣品中的DNA量的關係，和利用該關係或該關係的任何數學排列來定量樣品中目標生物體的量。本發明也提供了感染指數方法如何可以用來監測一個或多個地點的腎形線蟲感染以便可以對一個或多個生長地點進行更有效種植、腎形線蟲處理和資源分配規劃的描述。本發明進一步提供了一個地點的感染指數如何可以用來評估植物抵抗疾病感染的能力的描述。而且，本發明描述了感染指數方法如何可以用來幫助鑑定棉花基因組DNA中的疾病抗性等位基因、幫助相對於這些等位基因的存在或不存在對棉花植物進行基因分型，幫助育種者在棉花植物從一代遺傳至另一代時在種群中追蹤這些等位基因，並且為決定選擇哪個個體用於推進育種程序提供信息。本發明的某些方面進一步包括作為分子輔助育種計劃的一部分的可用於檢測植物中或植物群體中腎形線蟲抗性等位基因的存在的新的單核苷酸多態性(SNP)標誌物。本發明公開的SNP標誌物允許育種者針對與腎形線蟲抗性相關的核苷酸序列的存在而對植物進行基因分型，從而簡化或者甚至繞過低效的表型分型過程。發明詳沭這裡公開的本發明包括一種確定給定位置的目標生物體的量的新型且高通量的方法。與本領域現在或以前公開的方法相比，本方法高效且準確得多。這種感染指數方法包括通過將用目標生物體特異性的序列檢測的DNA的量與樣品物質中檢測的DNA總量進行比較而對樣品物質中目標生物體數量定量的方法。在感染指數方法的一個實施方式中，對目標生物體特異性的DNA序列是腎形線蟲腎形腎狀線蟲ITSl (內部轉錄間隔子I)區域5.8S rRNA基因。在另一個實施方式中，檢測的害蟲特異性核酸序列是根結線蟲南方根結線蟲的ITSl區域5. 8 S rRNA基因。在其它實施方式中，檢測的害蟲特異性核酸序列對其它生物體是特異性的。公開的本發明的額外實施方式包括基於用感染指數方法在植物的根圍中檢測的線蟲感染水平針對植物對線蟲的易感性或抗性對植物進行表型分型。本領域中描述的先前方法如貝爾曼漏鬥提取技術(Baermann Funnel Extraction Technique) (BFET)通常導致為了收集土壤而將生長地點的植物完全去除。本發明提供了在不在其生長處幹擾植物的情況下測定植物抗特定害蟲感染的能力的新型高通量和準確的方法。因此可以通過連續土壤採樣在生長期內多次測定植物抗感染的能力，且感染的傳播也可以隨時間進行監測。本發明也提供了將感染指數方法整合到常規育種工作中以幫助有利的等位基因從一個植物滲入另一個植物的方法。在一個實施方式中，該方法包括如下步驟1)在親本家系間進行雜交；2)用感染指數方法對從這些雜交產生的後代進行表型分型；和3)基於這些表型分數對親本和/或後代進行選擇。而且，本發明提供了將與疾病抗性相關的等位基因滲入植物家系的方法，包括如下步驟1)提供植物群體；2)相對於選自SEQ ID NO :1-112的至少一種基因組核酸標誌物在群體中對至少一個植物進行基因分型；和3)從群體中選擇至少一個包含至少一種與疾病抗性相關的等位基因的植物。提供的群體可以通過將至少一種疾病抗性植物與至少一種疾病敏感植物雜交以形成群體而獲得。本發明也提供了通過以下步驟產生的優良植物1)提供植物群體；2)相對於選自 SEQ ID NO 1-112的棉花基因組核酸標誌物在群體中對至少一個植物進行基因分型；和3) 從群體中選擇至少一個包含至少一種與疾病抗性相關的等位基因的植物。本發明的優良棉花植物可以表現出轉基因性狀。本發明進一步提供了用於檢測與疾病抗性相關的基因座的基本上純化的核酸分子，其包括選自SEQ ID NO :1-112及其互補序列的核酸分子。本發明進一步提供了用於檢測代表棉花DNA中的多態性的分子標誌物的分尚的核酸分子,其中該核酸分子包含包括或相鄰於多態性的至少15個核苷酸，其中該核酸分子與包括或相鄰於多態性的任一 DNA鏈中相同數目的連續核苷酸的序列至少90%相同，且其中分子標誌物選自於SEQ ID NO :1-112. 在一個方面，分離的核酸進一步包含可檢測標記或可用於引入可檢測標記。在另一個方面， 可檢測標記選自於同位素、螢光團、氧化劑、還原劑、核苷酸和半抗原。
本發明進一步提供了一組寡核苷酸，包括a)寡核苷酸引物對，其中各引物包含至少12個連續核苷酸，且其中引物對允許PCR擴增包含選自SEQ ID NO :1-112的分子標誌物的DNA片段，和b)至少一種允許檢測擴增片段中的多態性的檢測寡核苷酸，其中該檢測寡核苷酸的序列與包括或相鄰於步驟(a)中多態性的棉花DNA片段的任一鏈中相同數目的連續核苷酸的序列至少95%相同。除非另有註明，根據相關領域的本領域普通技術人員的常規用法來理解術語。分子生物學中常用術語的定義也可參見Alberts等人，Molecular Biology of The Cell, 第 5 版，Garland Science Publishing, Inc. New York,2007 ；Rieger 等人，Glossary of Genetics !Classical and Molecular,第 5 版，Springer-Verlag New York,1991 ； King 等人，A Dictionary of Genetics,第 6 版，Oxford University Press New York, 2002 ;和 Lewin, Genes IX, Oxford University Press New York, 2007。本發明使用了如 37CFR § 1.822所述的DNA鹼基命名法。植物的「根圍」是被植物的根部、根分泌物和根相關的土壤微生物影響的土壤區域。本發明所用的「生長區域」是植物有目的地生長的任何區域或設施。非限制性實例包括耕種田地、溫室、生長室、盆或任何其它工業、學術、公共或私人的場所，其中多種植物生長用於研究和/或消耗。本發明所用的「地點」是生長區域內的特定位點。本發明的至少一個實施方式描述了在生長區域內的多個地點採集土壤。這種地點的非限制性實例是特定田地中特定的2 英尺*2英尺的地塊，或者是在生長室中的盆的2英寸*2英寸的地塊中生長的幼苗。本發明所用的RKN是指根結線蟲或南方根結線蟲。「等位基因」是指在特定基因座的可選擇的序列；等位基因的長度可以小到I個核苷酸鹼基，但通常要比這個大。「基因座」是通常通過參照點找到的基因組序列上的位置，例如，作為基因或者基因或基因間區域的部分的DNA序列。本發明的基因座包括在群體中的一種或多種多態性； 即存在於一些個體中的可選擇的等位基因。本發明所用的「多態性」是指在一個或多個個體的群體中一個或多個基因座處存在核酸序列或核酸特徵的兩種或更多種變異。變異可以包括，但不限於，一個或多個鹼基的改變、一個或多個核苷酸的插入或一個或多個核苷酸的缺失。多態性可以來自於作為可動基因組元件的結果通過突變產生的核酸複製中的隨機過程、來自於拷貝數變異和在有絲分裂過程中，如不等交換、基因組重複及染色體斷裂和融合。這種變異可以在群體中常見或者可能以低頻率存在，前者在通常植物育種中具有更大作用而後者可能與稀有但重要的表型變異相關。有用的多態性可以包括單核苷酸多態性(SNP)、DNA序列的插入或缺失 (Indels)、DNA序列的簡單序列重複(SSR)、限制性片段長度多態性和標籤SNP。遺傳標誌物、基因、DNA衍生序列、單倍體型、RNA衍生序列、啟動子、基因的5'非翻譯區、基因的3' 非翻譯區、微RNA、siRNA, QTL、衛星標誌物、轉基因、mRNA、ds mRNA、轉錄譜和甲基化模式也可以包含多態性。此外，前述情況的存在、缺失或拷貝數的變異可以包含多態性。本發明所用的「標誌物」是指可用於生物體間進行區分的可檢測的特徵。這種特徵的實例可以包括遺傳標誌物、蛋白質組成、蛋白質水平、油組成、油水平、碳水化合物組成、碳水化合物水平、脂肪酸組成、脂肪酸水平、胺基酸組成、胺基酸水平、生物聚合物、藥物、澱粉組成、澱粉水平、可發酵澱粉、發酵產量、發酵效率、能量產量、次生化合物、代謝物、形態學特徵和農藝特徵。本發明所用的「遺傳標誌物」是指多態性核酸序列或核酸特徵。遺傳標誌物可以用一種或多種特定的變異序列或通過共有序列代表。在另一種意義中，「遺傳標誌物」是這種序列的分離的變異體或共有序列。本發明所用的「標誌物分析」是用於使用特定方法檢測特定基因座的多態性的方法，例如測定至少一種表型(如種子顏色、花的顏色或其它視覺可檢測的性狀)、限制性片段長度多態性(RFLP)、單鹼基延伸、電泳、序列比對、等位基因特異性寡核苷酸雜交(ASO)、 隨機擴增的多態性DNA(RAPD)、基於微陣列的技術和核酸測序技術等等。本發明所用的「分型」是指用來測定給定棉花基因組多態性的特定等位基因形式的任何方法。例如，單核苷酸多態性(SNP)通過測定存在哪種核苷酸(即A、G、T或C)而分型。插入/缺失(Indel)通過測定是否存在Indel而確定。Indel可以通過多種分析方法而分型，包括，但不限於，標誌物分析。本發明所用的術語「鄰近」當用來描述與含多態性的DNA雜交的核酸分子時，是指與直接鄰近多態性核苷酸鹼基位置的DNA序列雜交的核酸。例如，可在單鹼基延伸分析中使用的核酸分子「鄰近」於多態性。本發明所用的「共有序列」是指鑑別基因座的等位基因中的SNP和Indel多態性的構成性DNA序列。共有序列可以基於該基因座處任一 DNA鏈，且表示基因座中各SNP中任一的核苷酸鹼基和基因座中所有Indel的核苷酸鹼基。因此，儘管共有序列可以不是實際 DNA序列的拷貝，但是共有序列可用於精確設計用於基因座中實際多態性的引物和探針。本發明所用的術語「單核苷酸多態性」也用縮寫「SNP」表示，是指單一位點的多態性，其中該多態性構成單鹼基對改變、一個或多個鹼基對的插入或一個或多個鹼基對的缺失。本發明所用的術語「單倍體型」是指用至少一個多態性分子標誌物限定的單倍體型窗口(haplotype window)內的染色體區域。各個單倍體型窗口中的獨特標誌物指紋組合限定了該窗口的單個單倍體型。而且，單倍體的改變，例如由重組引起的，可以導致單倍體型的改變以至於它僅包含例如，通過與基因、QTL或轉基因的物理連接而可操作地與該性狀連鎖的原始(親本)單倍體型的一部分。只要該基因組區域的功能完整性未改變或得到改善，單倍體型中的任何這種改變都被包括我們關於什麼構成單倍體型的定義中。本發明所用的術語「單倍體型窗口 」是指用本領域技術人員已知的統計學分析方法建立的且處於連鎖不平衡的染色體區域。因此，在位於該區域內的一個或多個分子標誌物基因座處兩個近交個體(或兩個配子)之間的狀態的確認被用作整個區域的來源同一 (identity-by-descent)的證據。各個單倍體型窗口包括至少一個多態性分子標誌物。單倍體型窗口可以沿基因組中各染色體作圖。單倍體型窗口本身不固定，且考慮到持續增加的分子標誌物密度，本發明預計單倍體型窗口的數目和大小將繼續演變，使窗口的數目增加而它們相應的大小減小，因此導致在根據標誌物基因座的狀態的同一性確定來源同一性時持續提高的置信度。本發明所用的「基因型」是與可觀察的性狀(該表型)相對的個體(或個體組)在一個或多個遺傳位點處的遺傳構成。基因型可以，例如，通過使用遺傳標誌物間接表徵，或者，例如，通過核酸測序直接表徵。合適的標誌物包括表型特徵、代謝譜、遺傳標誌物或一些其它類型的標誌物。基因型由個體從其親本遺傳而來或能夠傳遞給其後代的一個或多個已知基因座的等位基因限定。術語基因型可以用於指在單一基因座、多個基因座、染色體的部分、整個染色體、基因組的部分、整個基因組的個體遺傳構成，更通常，術語基因型可用於指其基因組中所有基因的個體遺傳組成。基因型可以構成對於至少一個遺傳標誌物基因座的等位基因或對於至少一個單倍體型窗口的單倍體型。「種質」是指個體(例如植物)、個體組(例如植物家系、品種或科)或源自系、品種、種屬或培養物的克隆的遺傳物質或來自以上的遺傳物質。種質可以是生物體或細胞的部分，或可以從生物體或細胞分離。通常，種質提供了具有特定分子構成的遺傳物質，其為生物體或細胞培養物的一些或所有遺傳品質提供了物理基礎。如本發明所用的，種質包括細胞、種子或組織(新的植物可以由其生長)，或者可以培養為完整植株的植物部分，如葉、 莖、花粉或細胞。本發明所用的「表型」是指可以被基因型影響的細胞或生物體的可檢測的特徵。本發明所用的「連鎖」是指雜交中產生的配子類型的相對頻率。例如，如果基因座 A具有基因」A」或"a"和基因座B具有基因"B"或"b"，且AABB的親本I和aabb的親本B的雜交將產生四種可能的配子，其中基因被分隔成AB、Ab、aB和ab。空預期是獨立平均分隔成4種可能的基因型中的每一種，也就是各種基因型具有無連鎖的1/4的配子。配子分隔進入不等於1/4的基因型是由於連鎖。本發明所用的「連鎖不平衡」在單代中許多個體的群中配子類型的相對頻率的情況中定義。如果等位基因A的頻率為p，等位基因a的頻率為p'，等位基因B的頻率為q和等位基因b的頻率為q'，那麼基因型AB的預期頻率(沒有連鎖不平衡)為pq，Ab為pq'， aB為p' q和ab為p' q'。與預期頻率的任何偏離被稱為連鎖不平衡。當兩個基因座處於連鎖不平衡時，它們被稱為「遺傳連鎖的」。本發明所用的「數量性狀位點(QTL) 」是指在某種程度上控制通常連續分布的可數值表示性狀的基因座。本發明所用的「抗性等位基因」是指包括與對疾病的抗性相關的多態性等位基因的核酸序列。本發明所用的「棉花」是指陸地棉(Gossypium hirsutum),且包括可用棉花育種的所有植物種類，包括野生棉花品種。更具體地，來自陸地棉品種和陸地棉亞種(Gossypium hirsutum L.)的棉花植物可以用這些組合物和方法進行基因分型。在另外的方面，棉花植物來自於亞洲樹棉Gossypium arboreum L.類,另外稱為木棉。另一方面中，棉花植物來自於海島棉(Gossypium barbadense L.)類,另外稱為美洲皮馬棉或埃及棉。另一方面中，棉花植物來自於草本棉(Gossypium herbaceum L.)類，另外稱為草棉。棉屬或棉花植物可以包括雜交種、近交系、部分近交系或者定義的或未定義的種群的成員。本發明所用的術語「包括」是指「包括但不限於」。本發明所用的術語「優良家系」是指由育種和選擇優良農藝性能所得到的任何家系。市場上可得到的優良家系的非限制性例子包括DP 555BG/RR, DP 445BG/ RR, DP 444BG/RR, DP 454BG/RR, DP 161 B2RF, DP 141 B2RF, DP 0924 B2RF, DP 0935 B2RF, DP 121RF, DP 174 RF(岱字棉)！ST5599BR, ST5242BR, ST4554B2RF,ST4498B2RF, ST5458B2RF (Stoneville) ；FM9058F, FM9180B2F, FM1880B2F, FM1740B2F (FiberMax) ；PHY485WRF, PHY375WRF, PHY745WRF(Acala)(PhytoGen)；和 MCS0423B2RF, MCS0508B2RF(Cotton States)。在本發明中，疾病抗性基因座位於染色體All上。用於檢測腎形線蟲抗性存在和監測疾病抗性基因座滲入的SNP標誌物包括選自於SEQ ID NO :1-112的那些標誌物。用於擴增SEQ ID NO :1-68中的SNP的正向引物在序列表中以SEQ ID NO 113-180提供。用於擴增SEQ ID NO :1-68中的SNP的反向引物在序列表中按相同順序以SEQ ID N0181-248 提供。用於檢測SEQ ID NO 1-68中的SNP的探針組也以同樣的順序分別作為SEQ ID NO 249-316 和 SEQ ID NO :317-384 列出。例如，標誌物DNA序列SEQ ID NO 3可以用SEQ ID NO :115和183所示的引物進行擴增並用SEQ ID NO :251和319所示的探針進行檢測。說明性的示例標誌物DNA序列 SEQ ID NO 12可以用SEQ ID NO :124和192所示的引物進行擴增並用SEQ ID NO :260和 328所示的探針進行檢測。說明性示例標誌物DNA序列SEQ ID N0:13可以用SEQ ID NO: 125和193所示的引物進行擴增並用SEQ ID NO :261和329所示的探針進行檢測。此外，SEQ ID NO :69-112是可用於檢測腎形線蟲抗性存在和用於監測疾病抗性基因座滲入的額外SNP標誌物。基於這些序列，本領域普通技術人員可以從專門從事該服務的供應商的一些選項中預訂檢測公開的SNP必需的反應組分，或使用需要本領域普通技術的方法來製備合適的引物和探針。本發明也提供了包含選自SEQ ID NO :1_112其片段及兩者的互補序列的核酸分子、的棉花植物。本發明也提供了包含選自SEQ ID N0:l-112、其片段及兩者的互補序列的核酸分子的優良棉花植物。本發明也提供了包含疾病抗性基因座的植物。這些等位基因可以是純合的或雜合的。如本發明所用的，腎形線蟲是指任何腎形線蟲變異體或分離物。本發明的棉花植物可以對能引起疾病的與腎形線蟲相似的一種或多種線蟲具有抗性。一個方面中，本發明提供了抗腎形線蟲的植物以及用於篩選對腎形屬(Rotylenchulus)導致的腎形線蟲病有抗性或易感性的棉花植物的方法和組合物。在優選的方面中，本發明提供了用於篩選對腎形腎狀線蟲有抗性或易感性的棉花植物的方法和組合物。一個方面，本發明可用於任何植物。另一個方面，植物選自於棉屬。另一個方面，植物選自於陸地棉種。在進一步的方面，植物選自於陸地棉亞種(Gossypium hirsutum L.)。 在另外的方面，植物來自於亞洲樹棉(Gossypium arboreum L)類,另外也稱為木棉。另一個方面，植物來自於海島棉(Gossypium barbadense L)類,另外也稱為美洲皮馬棉或埃及棉。另一個方面，棉花植物來自於草本棉(Gossypium herbaceum L)類,另外也稱為草棉。 棉屬或棉花植物可以包括雜交種、近交系、部分近交系或者定義的或未定義的種群的成員。本發明的植物可以對給定疾病具有非常高的抗性、有抗性、基本上有抗性、有適度抗性、有相對抗性、有部分抗性、的適度易感性或有易感性，或者顯示出在抗性或易感性程度上的其它變異。在優選的方面，本發明提供了被測試對疾病的抗性或易感性的植物，所用測試方法為感染指數方法或者用來確定植物是否對給定疾病有非常高的抗性、有抗性、基本上有抗性、有適度抗性、有相對抗性、有部分抗性、有適度易感性或有易感性或者顯示出在抗性或易感性程度上的其它變異的任何方法。另一個方面中，棉花植物可以顯示出相比於非抗性的對照棉花植物的相對抗性。 在這個方面，對照棉花植物優選是除了所述的一種或多種疾病抗性等位基因之外遺傳相似的棉花植物。這種植物在具有等同或近似的病原體暴露的相似條件下生長。本發明的疾病抗性QTL可以引入優良家系中。「優良家系」是由育種和優良農藝性能的選擇所得到的任何家系。本發明的抗性QTL也可以引入包含賦予除草劑耐受性、產量增加、昆蟲防治、真菌病抗性、病毒抗性、線蟲抗性、細菌病抗性、支原體病抗性、改變的油產量、高油產量、高蛋白產量、發芽或幼苗生長控制、加強的動物和人類營養性、低棉子糖、環境壓力抗性、增強的消化性、工業酶、藥用蛋白、肽和小分子、改善的加工特性、改良的口味、固氮作用、雜交種子產生、減輕的變應原性、生物聚合物和特別地生物柴油的一種或多種轉基因的優良棉花植物。 一個方面中，除草劑耐受性選自草甘膦、麥草畏、草丁膦、磺醯脲、溴苯腈和達草滅除草劑。 這些性狀可以通過如植物中的轉基因的植物生物技術方法提供。一種或多種疾病抗性QTL等位基因可以從包含該等位基因的任何植物(供體)引入任何受體植物中。一個方面中，受體植物可以包含額外的疾病抗性基因座。另一個方面中，受體植物可以包含轉基因。另一個方面中，在維持引入的QTL的同時，提供疾病抗性QTL 的植物遺傳貢獻成分可以通過回交或其它適當方式降低。一個方面中，來自於植物的供體材料的核遺傳物質可以低於或約50%、低於或約25%、低於或約13%、低於或約5%、3%、 2 %或I %，但是該遺傳物質包含感興趣的一個或多個抗性基因座。可以進一步理解，本發明的植物可以表現出任何相對成熟期組的特徵。一個方面， 成熟期組選自早熟品種、中早熟品種(mid season maturing variety)和全季節品種(full season variety)。QTL的等位基因可以包含甚至在連續基因組區域或連鎖群如單倍體型中的多個基因或其它遺傳因子。如本發明所用的，疾病抗性基因座的等位基因因此可以涵蓋超過一種基因或其它遺傳因子，其中各單個基因或遺傳成分也能表現出等位基因變異和其中各基因或遺傳因子也能誘發對所述數量性狀的表型效應。本發明的一個方面中，QTL的等位基因包含也能夠表現出等位基因變異的一種或多種基因或其它遺傳因子。因此，使用術語「QTL 的等位基因」並非有意排除包含超過一種基因或其它遺傳因子的QTL。具體而言，本發明中出現的「QTL的等位基因」可以表示在其中表型可以是疾病抗性的單倍體型窗口內的單倍體型。單倍體型窗口是可以用一個或多個多態性標誌物的組定義或追蹤的連續基因組區域， 其中多態性表示來源同一。該窗口內的單倍體型可以通過各標誌物處的獨特等位基因指紋來定義。本發明所用的等位基因是佔據染色體上的給定基因座的基因的幾種可選形式中的一種。當存在於染色體上給定基因座的所有等位基因是相同的，那麼該植物在該基因座是純合的。如果存在於染色體上給定基因座的等位基因不同，那麼該植物在該基因座是雜合的。本發明的植物在任何特定疾病基因座或對於特定多態性標誌物是純合的或雜合的。本發明也提供了本發明植物的部分。植物的部分非限制性地包括種子、胚乳、胚珠和花粉。在本發明的特別優選的方面中，該植物部分是種子。本文引用了各種專利和非專利文獻，其中各文獻的公開內容都通過引用完整地包含在本文中。由於在不偏離本發明範圍的情況下可以對本文描述和說明的結構和方法進行各種修改，前面說明中包含或附圖
中所示的所有內容應當被解釋為說明性的而非限制性的。 本發明的廣度和範圍不應當被上述任何示例性的實施方式所限制，而應當僅僅根據後面隨附的權利要求及其等同特來限定。
實施例下面包括的實施例展示了本發明的優選實施方式。本領域技術人員應該能理解， 下面的實施例公開的技術代表了發明人在本發明的實踐中發現效果良好的技術，因此可以被認為構成了用於其實施的優選方式。然而，根據本公開內容，本領域技術人員應理解可以在本發明公開的特定實施方式中進行許多變化且在不偏離本發明的概念、精神和範圍的情況下仍然得到相像或類似的結果。更具體地，顯然，化學和生理學相關的特定試劑可以替代當本文所述的試劑而獲得同樣或相似的結果。所有這種對本領域技術人員顯而易見的相似的替代和變化被視為在所附的權利要求定義的本發明的精神、範圍和概念之內。實施例I :確定感染指數土壤採樣及DNA提取 為了確保從特定地點採樣的土壤是該地點的代表性土壤，從該地點的各個不同位置收集了 4份200-300克的土壤樣品，合併，徹底混合以形成「整體樣品」。使用UltraClean Mega Soil DNA分離試劑盒並根據製造商的方案從整體樣品中取出的一份或多份5_7克的土壤分樣品中提取DNA。總DNA定量在從土壤樣品中提取DNA後，使用Quant-iT PicoGreen 試劑盒並根據製造商的方案對土壤樣品中的DNA總量進行定量。使用以各種濃度加入40μ I TE緩衝液和 50 μ I PicoGreen 試劑中的 ο μ I鮭魚精dna獲得四點標準曲線。將土壤樣品中檢測的DNA量映射到標準曲線中以獲得從土壤樣品中分離的DNA的總量(表I)。表IDNA定量分析的內容(μ I)
權利要求
1.一種測定物質樣品中目標生物體的相對量的方法，該方法包括a.測定樣品中DNA的總量；b.分析樣品中針對目標生物體特異性的至少一種DNA序列的存在以定量樣品中目標特異性DNA的量；和c.計算對應於樣品中目標生物體的相對量的目標特異性DNA與總DNA的比例。
2.根據權利要求I的方法，其中所述物質樣品是土壤或植物材料。
3.根據權利要求I的方法，其進一步包括將所述比例與標準比較以確定所述樣品中目標生物體的數量。
4.根據權利要求I的方法，其中所述目標生物體是植物病原體。
5.根據權利要求I的方法，其中所述目標生物體是線蟲。
6.根據權利要求I的方法，其中所述目標生物體是腎形線蟲。
7.根據權利要求I的方法，其中所述目標生物體是根結線蟲。
8.根據權利要求I的方法，其中所述比例用於表示在物質樣品取樣地點的植物抗目標生物體感染的能力。
9.根據權利要求8的方法，其中所述比例用於決定是否在育種程序中使用該植物或其後代。
10.根據權利要求8的方法，其中所述植物是棉花植物。
11.根據權利要求I的方法，其中所述比例用於選擇至少一種處理以應用於生長區域內的至少一個地點。
12.根據權利要求11的方法，其中所述至少一種處理選自化學品、機械、電子設備、探針、裝置、灌溉、人、動物、肥料、其結合和其製劑。
13.根據權利要求12的方法，其中所述化學品是殺線蟲劑。
14.一種用殺蟲劑處理某地點的方法，包括(a)計算該地點的害蟲特異性核酸的量與收集的核酸總量的比例，和(b)與(a)中計算的比例成比例地應用殺蟲劑於該地點。
15.一種檢測棉花植物中腎形線蟲抗性存在或不存在的方法，其通過進行標誌物檢測分析以檢測選自SEQ ID NO 1-112的一種或多種序列的存在或不存在。
16.—種檢測棉花植物中腎形線蟲抗性的存在或不存在的方法，該方法包括檢測棉花植物中至少一種標誌物的等位基因，其中該至少一種標誌物在棉花基因組中CGR6333和 BNL1231 b之間的染色體區間上或之內。
17.一種培育腎形線蟲感染抗性的棉花植物的方法，該方法包括a.提供棉花植物的群體；b.對於在CGR6333和BNL1231b之間的染色體區間上或之內的等位基因對群體中的至少一個棉花植物進行基因分型；c.鑑定包含至少一種與腎形線蟲抗性相關的等位基因的至少一個棉花植物。
18.一種培育能夠抗腎形線蟲感染的棉花植物的方法，該方法包括a.提供棉花植物的群體；b.相對於選自SEQID NO :1-112的棉花基因組核酸標誌物對群體中的至少一個棉花植物進行基因分型；c.鑑定包含至少一種與腎形線蟲抗性相關的等位基因的至少一個棉花植物。
19.根據權利要求18的方法，其中所述群體通過將至少一種腎形線蟲抗性棉花植物與至少一種腎形線蟲敏感植物雜交而形成群體而獲得。
20.一種優良棉花植物，通過如下步驟產生a.提供棉花植物的群體；b.相對於選自SEQID NO :1-112的棉花基因組核酸標誌物對群體中的至少一個棉花植物進行基因分型；c.從群體中挑選包含至少一種與腎形線蟲抗性相關的等位基因的至少一個棉花植物。
21.根據權利要求20的優良棉花植物，其中所述優良棉花植物表現出轉基因性狀。
22.根據權利要求21的優良棉花植物，其中所述轉基因性狀選自除草劑耐受性、產量增加、昆蟲防治、真菌病抗性、病毒抗性、線蟲抗性、細菌病抗性、支原體病抗性、改變的油產量、高油產量、高蛋白產量、發芽和/或幼苗生長控制、加強的動物和人類營養性、低棉子糖、環境壓力抗性、增強的消化性、改進的加工特性、改良的口味、固氮作用、雜交種子產生和降低的變應原性。
23.根據權利要求22的優良棉花植物,其中除草劑耐受性選自草甘膦、麥草畏、草丁膦、磺醯脲、溴苯腈、2，4-二氯苯氧基乙酸和達草滅除草劑。
24.一種用於檢測與腎形線蟲抗性相關的基因座的基本上純化的核酸分子，包括選自 SEQ ID NO :1-112及其互補序列的核酸分子。
25.一種用於檢測代表棉花DNA中的多態性的分子標誌物的分離的核酸分子，其中該核酸分子包含包括或相鄰於該多態性的至少15個核苷酸，其中該核酸分子與包括或相鄰於該多態性的任一 DNA鏈中相同數目連續核苷酸的序列至少90%相同，且其中該分子標誌物選自於 SEQ ID NO :1-112。
26.根據權利要求25的分離的核酸分子，其中所述核酸進一步包含可檢測標記或可用於引入可檢測標記。
27.根據權利要求26的分離的核酸分子，其中所述可檢測標記選自於同位素、螢光團、 氧化劑、還原劑、核苷酸和半抗原。
28.一組寡核苷酸，包含a.寡核苷酸引物對，其中各引物包含至少12個連續核苷酸，且其中引物對允許PCR擴增包含選自SEQ ID NO 1-112的分子標誌物的DNA片段；b.至少一種允許檢測擴增片段中的多態性的檢測寡核苷酸，其中該檢測寡核苷酸的序列與包括或相鄰於步驟(a)中多態性的棉花DNA片段的任一鏈中相同數目的連續核苷酸的序列至少95%相同。
全文摘要
本發明屬於植物育種和疾病抗性領域。更具體地，本發明包括測試地點以確定害蟲感染的量或測試植物的抗感染能力，以及使用該信息作出農業治療和/或育種決定的方法。本發明也提供了培育包含一個或多個與腎形線蟲感染的抗性相關的數量性狀位點的棉花植物的方法。本發明進一步包括種質和使用包含能賦予腎形線蟲抗性的數量性狀位點(QTL)的種質作為育種程序中用於滲入優良種質中的腎形線蟲抗性等位基因的來源，因此產生包含一個或多個腎形線蟲抗性基因座的新型優良種質。
文檔編號C12Q1/68GK102597263SQ201080045355
公開日2012年7月18日 申請日期2010年10月11日 優先權日2009年10月9日
發明者B·L·亨德裡克斯, M·巴蒂, P·L·科爾費爾德, R·G·坎特雷爾, 吳坤生, 肖金華 申請人:孟山都技術公司