一種植物病害接種用帶菌牙籤的繁殖方法與流程

2023-09-23 03:25:10

本發明涉及植物病害研究的農業技術領域，具體涉及到一種玉米穗腐、莖基腐等病害接種用帶菌牙籤的高效繁殖方法。

背景技術：

植物病害病原物、抗病性等鑑定是病害研究的重要內容，而接種菌的繁殖又是其不可缺少的重要環節，簡便快速地獲得優質、足量的接種菌是人們探索重要方面。用帶菌牙籤接種是現有植物病害病原物接種技術常用的方法之一。現有的帶菌牙籤繁殖方法就是先把牙籤、培養基、培養皿或廣口瓶滅菌，然後在無菌條件下將培養基倒入培養皿或廣口瓶中，待培養基凝固後把牙籤插入其中，然後接種培養。這種帶菌牙籤繁殖方法存在一些局限：①種菌與牙籤結合不緊密，接種菌只是附著在牙籤上，菌種容易因摩擦而脫落；②牙籤上沒有營養，不利於菌種在牙籤上持續生長繁殖和不斷地提供菌源；③由於用的是一些培養皿、廣口瓶等器皿，不便於大量繁殖；④菌種往往先從培養基上某一接種點開始生長，然後再慢慢擴展至周圍的培養基和牙籤上，菌種長滿器皿中所有牙籤的速度較慢。

技術實現要素：

針對現有技術存在的缺陷，本發明的目的是提供一種易於大量高效地繁殖接種用帶菌牙籤的新方法。

本發明的植物病害接種用帶菌牙籤的繁殖方法，包括如下步驟：

(1)準備菌種 無菌條件下將植物病原菌接種在PDA平板培養基上，25℃恆溫培養7~8d，菌種長滿平板後冷藏待用；

(2)浸泡麥粒 將麥粒放三角瓶中，用清水衝洗乾淨後，浸泡12~24 h，中間衝洗一次，待麥粒吸足水後，再用清水衝洗2~3次，然後篦去三角瓶中的水，蓋上棉塞，待用；

(3)清洗牙籤 將牙籤在清水中浸泡12~24 h，用清水衝洗後在鍋中用清水煮10~15min，倒掉煮水再用清水衝洗2~3次，待用；

(4)牙籤滲入營養 將（3）處理後的牙籤放在容器中，加足量清水淹過牙籤，根據水量，按(1)中培養基製作的原料成份配比加入相應量的營養成份即去皮馬鈴薯小塊和葡萄糖，一起煮20~30 min，待用；

(5)粘拌麵粉 將小麥麵粉加1%的瓊脂粉放在乾燥的容器中拌勻，然後將（4）處理後表面溼潤的牙籤放入麵粉中攪拌，使牙籤表面均勻地粘滿麵粉，待用；

(6)裝袋滅菌 將（5）準備的牙籤輕放在菌袋中，使牙籤之間保持一定的空隙，裝滿後扎住菌袋口，與（2）準備的麥粒一起高壓滅菌20 min，待用；

(7)麥粒拌菌 無菌條件下，先用接種針或接種環將（1）準備的菌種連同培養基一起劃碎，再將其放入（6）處理後的裝麥粒的三角瓶中，攪拌麥粒，搖動三角瓶，使菌種混勻並粘附在麥粒上，待用；

(8) 牙籤接種 無菌條件下，將經（7）處理的帶菌麥粒倒入經（6）滅菌的牙籤袋中，輕輕扎住袋口，緩緩地轉動並左右上下翻動袋子，以便使麥粒上的菌種充分粘著到牙籤上，使麥粒均勻地分散在牙籤之間的縫隙中，待用；

(9) 培養與保存 將（8）準備的接種後牙籤袋放20~30℃溫度下培養7~10d，待牙籤表面長滿了菌，即完成帶菌牙籤的培養，對暫時不用的帶菌牙籤先將菌袋放4℃條件下冷藏保存，使用時，將帶菌牙籤從菌袋取出，把連成一團的牙籤輕輕分開即可。

所述PDA培養基製作的原料成份配比是：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15~20g，自來水1000ml。

與現有技術相比，本發明的優點在於：（1）可以進行大量繁殖；（2）多點接種，菌種在塑膠袋的牙籤和麥粒上多點同時生長，繁殖速度快；（3）由於牙籤上粘著和滲入營養物質，菌種直接在其上生長，因而菌種不僅生長茂密，而且與牙籤結合緊密，操作時菌種不易從牙籤上因磨蹭而脫落；（4）接種後牙籤上菌種可持續生長繁殖，能不斷地為接種部位提供菌源，保證接種效果；（5）操作方便、高效，易於推廣。

實施例1

採用本發明方法繁殖1000根帶菌接種牙籤，包括如下步驟：

(1)準備菌種 無菌條件下將禾穀鐮刀菌接種在直徑9cm培養皿內製作的PDA平板培養基上，25℃恆溫培養7d，菌種長滿平板後冷藏待用；

(2)浸泡麥粒 稱取麥粒50g放在300ml三角瓶中，用清水衝洗乾淨後，浸泡12 h，中間換一次水，麥粒吸足水後，再用清水衝洗2次，然後篦去三角瓶中的水，蓋上棉塞，待用；

(3)清洗牙籤 取1000根一端尖、另一端鈍圓帶槽、木質疏鬆、表面粗糙的牙籤在清水中浸泡24 h，然後放在鍋中用清水煮10 min，倒掉煮水再用清水衝洗2次，待用；

(4)牙籤滲入營養 將1000根清洗乾淨的牙籤放在容器中，加1000ml清水淹過牙籤，再在水中加入200g去皮馬鈴薯小塊和20g葡萄糖，一起煮30 min，待用；

(5)粘拌麵粉 稱取小麥麵粉50g和瓊脂粉0.5g放在乾燥的容器中拌勻，然後將用營養水煮過的牙籤趁表面溼潤時放入麵粉中攪拌，使牙籤表面均勻地粘滿麵粉，待用；

(6)裝袋滅菌 將粘滿麵粉的牙籤輕放在1個長36 cm、寬10cm的耐高壓菌袋中，使牙籤之間保持一定的空隙，裝完後輕輕扎住菌袋口，與（2）浸泡好的麥粒一起高壓滅菌20 min，待用；

(7)麥粒拌菌 無菌條件下，先用接種針或接種環將（1）準備的禾穀鐮刀菌菌種和培養基一起劃碎，再將其放入滅菌後的麥粒三角瓶中，攪拌麥粒，搖動三角瓶，使菌種混勻並粘附在麥粒上，待用；

(8)牙籤接種 無菌條件下，將三角瓶中粘附有禾穀鐮刀菌菌種的帶菌麥粒倒入滅菌後的牙籤袋中，輕輕扎住袋口，輕輕地轉動並左右上下翻動袋子，以便使麥粒上的菌種充分粘著到牙籤上，使麥粒均勻地分散在牙籤之間的縫隙中，待用；

(9)培養與保存 將接種後牙籤袋放20℃恆溫下培養10d，待牙籤表面長滿了菌，即完成帶菌牙籤的培養。對完成培養但暫時不用的帶菌牙籤先將菌袋放4℃條件下冷藏保存，使用時，將帶菌牙籤從菌袋取出，把連成一團的牙籤輕輕分開即可。

PDA培養基製作的原料成份配比是：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15~20g，自來水1000ml。

實施例2

採用本發明方法繁殖1000根帶菌接種牙籤，包括如下步驟：

(1)準備菌種 無菌條件下將禾穀鐮刀菌接種在直徑9cm培養皿內放置PDA平板培養基上，25℃恆溫培養8d，菌種長滿平板後冷藏待用；

(2)浸泡麥粒 稱取麥粒30g放在300ml三角瓶中，用清水衝洗乾淨後，浸泡24 h，中間換一次水，麥粒吸足水後，再用清水衝洗3次，然後篦去三角瓶中的水，蓋上棉塞，待用；

(3)清洗牙籤 取1000根一端尖、另一端鈍圓帶槽、木質疏鬆、表面粗糙的牙籤在清水中浸泡12 h，然後放在鍋中用清水煮15 min，倒掉煮水再用清水衝洗3次，待用；

(4)牙籤滲入營養 將1000根清洗乾淨的牙籤放在容器中，加1000ml清水淹過牙籤，再在水中加入200g去皮馬鈴薯小塊和20g葡萄糖，一起煮20 min，待用；

(5)粘拌麵粉 稱取小麥麵粉50g和瓊脂粉0.5g放在乾燥的容器中拌勻，然後將用營養水煮過的牙籤、趁表面溼潤時將牙籤放入麵粉中攪拌，使牙籤表面均勻地粘滿麵粉，待用；

(6)裝袋滅菌 將粘滿麵粉的牙籤輕放在1個長36 cm、寬10cm的耐高壓菌袋中，使牙籤之間保持一定的空隙，裝滿後扎住菌袋口，與（2）浸泡好的麥粒一起高壓滅菌20 min，待用；

(7) 麥粒拌菌 無菌條件下，先用接種針或接種環將（1）準備的直徑為9cm的培養皿平板培養基菌種1/2的禾穀鐮刀菌菌種和培養基一起劃碎，再將其放入滅菌後的麥粒三角瓶中，攪拌麥粒，搖動三角瓶，使菌種混勻並粘附在麥粒上，待用；

(8) 牙籤接種 無菌條件下，將三角瓶中粘附有禾穀鐮刀菌菌種的帶菌麥粒倒入滅菌後的牙籤袋中，輕輕扎住袋口，輕輕地轉動並左右上下翻動袋子，以便使麥粒上的菌種充分粘著到牙籤上，使麥粒均勻地分散在牙籤之間的縫隙中，待用；

(9) 培養與保存 將接種後牙籤袋放30℃恆溫下培養7d，待牙籤表面長滿了菌，即完成帶菌牙籤的培養。對完成培養但暫時不用的帶菌牙籤先將菌袋放4℃條件下冷藏保存，使用時，將帶菌牙籤從菌袋取出，把連成一團的牙籤輕輕分開即可。

PDA培養基製作的成份配比實施例1。