應用氟吡氨酯預防和治療與造血細胞系統損傷有關的疾病的製作方法

2023-09-23 02:23:30 2

專利名稱：應用氟吡氨酯預防和治療與造血細胞系統損傷有關的疾病的製作方法
技術領域：
本發明涉及氟吡氨酯(flupirtine)或它的鹽類作為藥物在預防和治療與造血細胞系統(例如淋巴細胞)損傷有關的疾病中的應用。
氟吡氨酯是一種已知的、明確的非阿片類鎮痛劑，通過中樞神經系統發揮作用。
氟吡氨酯表現出的鎮痛作用機制與阿片劑/類阿片鎮痛劑不同〔Nickel，B.，《醫學研究生雜誌》(Postgrad Med J)，63期(增刊第3號)，19頁(1987年)；Szelenyi，I.，Nickel，B.，Borke，H.O.，Brune K.，《英國藥理學雜誌》(Br.J.Pharmacol)，143期，89頁(1989年)〕。電生理研究表明，氟吡氨酯能夠在脊髓和脊髓上水平影響感受傷害活動〔Carisson，K.H.，Jurna，I.，《歐洲藥理學雜誌》(Eur.J.Pharmakol)，143期，89頁(1987年)；Bleyer，H.，Carlsson，K.H.，Erkel，H.J.，Jurna，I.，《歐洲藥理學雜誌》151期，259頁(1988年)；Nickel，B.，Aledter，A.，《醫學研究生雜誌》，63期(增刊第3號)，41頁(1987年)〕。
氟吡氨酯還可以用於運動系統疾病導致的急性疼痛期間的治療。
進一步，氟吡氨酯還成功地治療了變性或風溼性疾病。
除了良好的鎮痛作用，氟吡氨酯還具有松馳肌肉的特性。因此它也用於治療肌肉緊張，或由肌肉緊張導致的疾病(DE 40 22 442)。
在研究氟吡氨酯對大鼠的肌松作用過程中，進一步發現興奮性胺基酸N-甲基-D-天冬氨酸(NMDR)能夠抑制氟吡氨酯的作用。由於這種NMDR拮抗作用，氟吡氨酯也適於治療一些由NMDR介導的中樞神經系統疾病，例如腦缺血、神經變性疾病和癲癇發作(DE 43 27516)。
氟吡氨酯的化學名稱是2-氨基-3-乙氧羰基氨基-6-(對氟苄基氨基)吡啶。氟吡氨酯和其藥學適用鹽類的合成方法已由專利DE 1795 858、DE 31 33 519和DE 34 16 609說明。
令人驚奇地是，現在發現氟吡氨酯能夠抑制造血系統(例如淋巴細胞)細胞的細胞凋亡。
這一發現有希望打開用氟吡氨酯治療一些與造血細胞系統損傷有關的疾病的希望，特別重要之處是治療HIV感染患者/愛滋病人。
本發明將通過藥理學研究闡述氟吡氨酯的新作用。
藥理學研究材料馬來酸氟吡氨酯〔2-氨基-3-乙氧羰氨基-6-(對氟苄基氨基)吡啶馬來酸鹽〕，用HIV-1病毒株HTLVIIIB製備的HIV-1-gp120(Popovic等，1984年)。通過聚丙烯醯胺凝膠電泳顯示，製備的gp120製備物純度大於95％〔Muller等，1988年〕。
抗逆轉錄病毒分析HIV-1病毒的分析方法已有報導〔Sarin等，1987年〕。人T-淋巴母細胞系CEM(接種濃度1×105個細胞/ml)的細胞懸浮在培養基中並用HIV-1病毒(HTLVIIIB株)感染，選擇一個50％細胞培養感染劑量〔CCID50〕的50倍作為實驗中所用的感染量。一個CCID50指懸浮細胞中每毫升細胞的50％被感染所用的感染劑量。1毫升培養液孵育5天。在感染前2小時把不同濃度的氟吡氨酯加至細胞中。通過3-〔4，5-二甲基噻唑-2-基〕-2，5-二苯四唑溴〔MTT〕比色分析法計算活細胞的數目〔Scudiero等，1988年〕，也可以用不久前分布的方法，通過ELISA讀數儀測定〔Muller等，1991年〕。孵育後，未感染的CEM細胞進行2.16個，而感染的細胞則進行0.13個細胞分裂周期。
血液樣本人外周血的樣本採自(i)12個HIV-1感染的男性同性戀者〔平均年齡35歲；年齡範圍22-43歲〕，(ii)8個健康的HIV-1血清學陰性的男性，但與上組患者年齡相近，有同樣患病的危險因素〔平均年齡30歲；年齡範圍23-35歲〕。根據美國疾病控制中心(CDC，1992年)的分類標準將患者分類。用HIV-1血清學陽性的患者與無症狀的病毒攜帶者的血樣進行研究(美國疾病控制中心標準A1，A2意味著CD4細胞數是407個/μl，範圍209-698個/μl)。病史中無一例患者出現過腫瘤、有症狀的感染，或者在採集血樣10周前曾經接受過免疫抑制劑，例如可的松的治療。
細胞製備及其處理用Ficoll-Hypaque密度梯度液離心肝素化的血液，從中分離出單核細胞(MNC)並且濃縮〔Rossol等，1990年〕。0.5×106個細胞置於終容量為500μl的培養基中，所用的培養基是MEM-培養基，內含10mM HEPES緩衝液、2.6％碳酸氫鈉、100單位/L青黴素、100μg/ml鏈黴素、10％胎牛血清(FCS)和1mM穀氨酸。需強調的是，分離之後要用化學物質立刻處理細胞。
用反應活性氧誘導細胞調亡通過次黃嘌呤〔HX〕和黃嘌呤氧化酶〔XOD〕系統產生反應活性氧基〔Bruck等，1994年〕。
單核細胞在總容量為500μl的MEM培養基中懸浮24小時(如上描述)。
0-80mU/ml的黃嘌呤氧化酶和1mM次黃嘌呤加入這份細胞中。黃嘌呤氧化酶(Sigma公司，德國慕尼黑)濃度為90mU/ml時，90％以上的淋巴細胞出現凋亡。
除非特別地指出，下列試驗中用的是10mU/ml黃嘌呤氧化酶和1mM次黃嘌呤。在這樣的孵育條件下，大約50％的細胞出現凋亡。當檢查某種化合物是否是一種潛在的細胞凋亡的抑制劑和/或刺激劑時，最好能保持這個50％的細胞凋亡比率。氟吡氨酯加主細胞中之前6小時加入產生氧基的系統，孵育1天後中止反應。
連續流式細胞儀做細胞分析根據已經發表的方法(Schmid等，1994年)，用FACScan(Becton-Dickinson產品)連續流式細胞儀分析細胞的凋亡，細胞儀以488nm波長的氬雷射激發。通過光學方法，結合前光散射檢查細胞的大小〔FSC〕和垂直散射光檢查細胞表面的成分〔SSC〕，來區分並且確定淋巴細胞。為了染色凋亡的單核細胞，要把這些細胞孵育在含20μg/ml的7-氨基放線菌素D(7-AAD)(Sigma產品)的PBS溶液中，置4℃黑暗中20分鐘。然後，在染液中用連續流式細胞儀分析細胞。用650nm波長的濾過器檢查7-氨基放線菌素D發出的紅色螢光。
由於細胞膜的裂解，7-氨基放線菌素D穿透凋亡的細胞，通過插入過程進-步將DNA染色。用LYSIS II程序分析數據。
均道數轉化成平均螢光強度、細胞大小和表面組成成分。
用TdT法和表面標記進行原位螢光標記為了明確某一細胞亞群正在發生細胞的凋亡，以末端轉移酶系統(TdT)處理細胞，應用Gorczyca等(1993年)的方法並稍做改進。懸浮細胞用PBS(Gibco產品)衝洗二次，然後用1％強度的多聚甲醛(Riedel de Haen產品)4℃下固定10分鐘。用PBS液(已加入5％AB血清和0.5％牛血清白蛋白)衝洗二次後，將細胞沉集，並重新懸浮於加了0.5nM生物素-16-dUTP和25U末端轉移酶系統的50μl的2.5mM氯化鈷溶液中，再加入200mM卡可酸鉀、25mM Tris-HCl和0.25mg/ml牛血清白蛋白成為緩衝液。根據製造商的用戶指南(Boehringer Mannheim，Mannheim，FRG)，37℃下孵育30分鐘。然後用PBS緩衝液(內含5％AB血清和0.5％牛血清白蛋白)衝洗二次，再懸浮於100μl含有5μg/ml螢光異硫氰酸鹽(FITC)標記的生物素(細胞分析試劑純度)的緩衝染液中。細胞另外用20μg/ml藻紅素標記的單克隆抗CD3抗體(Becton-Dickinson產品)處理作同時的表面標記。
通過Halliwell(1987年)介紹的方法，用連續流式細胞儀確定螢光數量。
結果用氟吡氨酯處理HIV-1感染的CEM細胞CEM細胞用氟吡氨酯預處理2小時，然後保持非感染態；或者用HIV-1感染作為平行試驗。
5天後就可以測得相關試驗的細胞數目。圖1顯示，用氟吡氨酯處理後，非感染態細胞與感染培養基中的細胞濃度無顯著性差異(P＞0.1)。
試驗中加入氟吡氨酯的終濃度是0.1-30μg/ml。非感染試驗組中的細胞濃度是446,880±31,020個/ml，而HIV-1感染組的細胞濃度是108,420±6,710個/ml。
該結果說明，氟吡氨酯對細胞無毒性作用，而且在所實施的孵育條件下，體外不影響HIV-1的感染。
次黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶系統的調節要選擇合適的黃嘌呤氧化酶的濃度，使凋亡的細胞比率大約為50％。
凋亡的細胞顯示出的螢光強度大於10個任意均道數。黃嘌呤氧化酶濃度為0時，只有6.6±2.1％的細胞超過這個大於10個任意均道數的界線，即6.6％的細胞出現凋亡。隨著黃嘌呤氧化酶濃度的增加，凋亡細胞的比率也增加。當黃嘌呤氧化酶濃度為80mU時，凋亡的細胞達到93.2±6.8％；當黃嘌呤氧化酶濃度為10mU時，大約有50％(準確說是54.6±6.1％)的細胞出現凋亡。
缺乏黃嘌呤氧化酶時，細胞出現以下細胞大小/表面組成(FSC/SSC)的分布形式細胞大小是349±27(任意均道數)，表面組成是112±15。當黃嘌呤氧化酶濃度是80mU時，細胞變小到256±22，而表面組成則增加至180±29。這種基於細胞形態學的改變表明了一種特徵性的細胞凋亡。當黃嘌呤氧化酶濃度是10mU時，細胞出現的分布形式則介於上述提到的2個極端數值之間。除非特別地指出，一般使用黃嘌呤氧化酶的濃度是10mU。
氟吡氨酯對人淋巴細胞自發凋亡率的影響檢查健康人和HIV-1感染患者的外周血中單核細胞的的自發凋亡。採集血樣一天後進行細胞分析。正如圖2所示，此時對照組非感染者的單核細胞有6.32±0.82％出現凋亡，而HIV-1感染患者的細胞則有28.42±7.84％出現凋亡。兩組的單核細胞均用0.1-30μg/ml濃度的氟吡氨酯處理了24小時。如圖2的總結，對健康人和HIV-1感染患者來說，氟吡氨酯並不能明顯改變淋巴細胞自發凋亡率(p＞0.1)。
氟吡氨酯減少單核細胞的誘導凋亡用次黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶系統(形成氧基)處理健康人和HIV-1感染患者的單核細胞來誘導細胞的凋亡。在誘導之前6小時，把不同濃度的氟吡氨酯加入細胞培養基中。正如圖3所示，0.1-3.0μg/ml濃度的氟吡氨酯明顯減少了細胞的凋亡(p＜0.001)。氟吡氨酯濃度為10μg/ml時，僅僅對HIV-1患者的淋巴細胞有明顯的保護作用。氟吡氨酯濃度為0.3-3.0μg/ml時，藥物的保護作用最顯著，對細胞誘導凋亡的抑制作用也最強。本實驗中，對健康人的淋巴細胞大約減少了40％誘導的凋亡，而對HIV-1感染患者則減少了大約60％。
應用DNA-斷裂法也可以檢測到淋巴細胞的凋亡。細胞與黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶(HX/XOD)系統孵育後，提取細胞中的DNA，根據分子大小在瓊脂糖凝膠中分離並進一步轉移到印跡上。
DNA斷裂為180及其成倍鹼基對的梯形片斷模式，這種片斷模式是細胞凋亡過程中DNA遭到破壞的典型結構(Wyllie，1980年)。相反，用1μg/ml氟吡氨酯處理過的細胞未出現任何DNA片斷。
同樣得到了代表性的斑點印跡，表明了氟吡氨酯對進行自發凋亡和誘導凋亡的細胞的作用效果。
為了完成這一系列的實驗，要使用次黃嘌呤/20mU黃嘌呤氧化酶系統誘導單核細胞凋亡。在沒有經過氟吡氨酯處理時，有64.2±7.9％的細胞出現凋亡。然而，當細胞用氟吡氨酯處理24小時以後，凋亡細胞的比率明顯下降至18.3±5.8％。
這些結果清楚地表明氟吡氨酯是一種很有希望地可用於治療愛滋病患者淋巴細胞誘導凋亡的藥物。
DE-A-43 27 516闡明了氟吡氨酯的神經保護作用，例如在腦缺血、早老性痴呆、帕金森氏病和由於感染如AIDS腦病或Creutzfeld-Jakob症候群導致的神經變性疾病中的作用。
伴有進行性痴呆的AIDS腦病是愛滋病的一種神經系統併發症。認為AIDS腦病的發病原因之一是HIV(gp-120)誘導NMDR激動性神經毒素如喹啉酸從感染的巨噬細胞中釋放，最終導致神經細胞壞死。
AIDS腦病和愛滋病本身(獲得性免疫缺陷症候群)可以累及不同的器官系統。前者已如上所述，是愛滋病的一種神經系統併發症(神經細胞的凋亡)，後者則是基於細胞免疫功能紊亂而出現了T細胞數目的明顯減少(造血細胞系統中一種細胞成分的凋亡)。
本發明的氟吡氨酯的作用，即抑制造血細胞系統如淋巴細胞的誘導凋亡的最引人驚異之處在於，迄今為止尚未報告存在於中樞神經系統之外的NMDA受體。因此，即使是本領域熟練技術人員也不可能由氟吡氨酯對神經細胞的保護作用，而預知到它對造血細胞系統的細胞也有保護作用。
根據本發明中氟吡氨酯的作用，它還可以預防或治療其它疾病，例如-藥物(如細胞生長抑制劑和可的松類)、毒物、射線或其它疾病導致的中性粒細胞減少症/淋巴細胞減少症，-藥物或感染(如HIV感染)導致的血小板減小症。
氟吡氨酯用於預防和治療給藥可以採取已知的下面一些劑型片劑、膜衣片劑、硬膠囊、軟膠囊、丸劑、顆粒劑、糖衣片劑、栓劑、微膠囊、水質或油質懸液、油質溶液、肌肉注射液和靜脈內注射液。
用於製備藥物的適用鹽是所有可與氟吡氨酯生理匹配的鹽類，例如氟吡氨酯的鹽酸鹽、馬來酸鹽、硫酸鹽和葡萄糖酸鹽。
本發明的藥品中氟吡氨酯的含量是0.1mg-3000mg，最好是10mg-500mg。所述藥物的單一劑量可分每日1-5次給藥，最好1-3次。
指定的給藥劑量都是指氟吡氨酯的量，如果使用的是氟吡氨酯的鹽類化合物，則必須考慮到分子量的轉換。
根據本發明的化合物可以通過常規的製藥標準方法製備，例如，氟吡氨酯與賦形劑和/或輔助劑一般在20℃-80℃，最好是20℃-50℃溫度下通過攪拌或均質化完全地混合。


圖1將非感染的〔○表示〕和HIV-1感染的CM細胞〔●表示〕與不同濃度的氟吡氨酯孵育。給出的是10次平行試驗得到的平均值，標準差不超過10％。
圖2氟吡氨酯對未感染者〔空白條形圖表示〕與HIV-1感染患者〔斜線條形圖表示〕的淋巴細胞自發凋亡的影響。採集血樣1天後，通過連續流式細胞儀做細胞分析。檢查的淋巴細胞來自12個HIV-1感染患者和8個未感染者。平均值和標準差已標明。
圖3
用氟吡氨酯處理後的淋巴細胞減少了誘導凋亡。通過次黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶系統誘導未感染者〔空白條形圖表示〕和HIV-1感染患者〔斜線條形圖表示〕的單核細胞凋亡，在加入這一氧基產生系統前6小時把氟吡氨酯加至細胞中，1天後通過連續流式細胞儀分析細胞。先確定總的凋亡細胞比率，從中減去的是自發凋亡的細胞比率。因此圖中所示的數值表明了誘導凋亡的程度。檢查的淋巴細胞來自12個HIV-1感染的患者和8個未感染者，平均值和標準差已標明。
權利要求
1.活性化合物氟吡氨酯或其藥學上適用的鹽在製備一種治療與造血細胞系統損傷有關的疾病的藥物中的應用。
2.根據權利要求1的活性化合物氟吡氨酯或其藥學上適用鹽的應用，所述藥物用於治療HIV-1感染患者/愛滋病患者。
3.根據權利要求1的應用，其特徵在於氟吡氨酯或其鹽與藥學上適宜的賦形劑和/或輔助物結合形成一種合適的給藥形式。
全文摘要
本發明涉及氟吡氨酯或它的鹽作為藥物在預防和治療與造血細胞系統如淋巴細胞損傷有關的疾病中的應用。特別重要的是治療HIV感染患者/愛滋病患者。
文檔編號A61K31/44GK1201391SQ96198131
公開日1998年12月9日 申請日期1996年10月23日 優先權日1995年11月7日
發明者G·伯甘德, W·E·G·米勒 申請人:Asta藥物股份公司