鮑魚人工免疫物質的製備方法
2023-09-23 16:44:45 1
專利名稱：鮑魚人工免疫物質的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種把微生物培養物作為有效成分製成各種有用產品的方法。
目前在我國人工養殖鮑魚的育苗過程中，鮑苗的死亡率極高，甚至可達95％，為此的們採用抗菌素來控制一般抗菌素的價格都比較高，而且每種抗菌素只對部分細菌有抑制作用，既使對某種細菌有效的抗菌素由於長期的使用也產生了抗藥性，因此必須加大藥量，這不僅大幅度地增加了鮑魚成本，而且又加劇了海水的汙染。陸地養鮑採用流水法，藥浴時間短、用藥次數少、藥效就更不明顯了。特別是由於水溫、水質等變化每年甚至每個月鮑魚的病因都不同這樣用藥治療是很難的。
鑑於上述現有技術中的不足之處本發明的目的在於提供一種能提高鮑魚自身免疫力使它們能抵抗各種疾病的較廉價的人工免疫物質的製備方法。
本發明的目的可通過以下措施來實現鮑魚人工免疫物質的製備方法，其特徵在於死菌苗注射液及菌餌的製備方法是將從病鮑中分離的病原菌接種於肉湯蛋白腖的培養基上，經6～10小時培養用自製的接種棒接種於胰蛋白腖瓊脂培養基中，於20～35℃培養12～26小時，用0.1～1.0％的甲醛洗下菌苔，處理24～120小時，離心，用無菌生理鹽水稀釋成104～1011個/毫升的菌苗注射液，再將這種菌液噴灑到餌料上製成0.5～1.5億個/克的菌餌。活菌苗注射液及菌餌的製備方法是將經過30左右次連續傳代的菌種皮下、腹腔注射進兔子和鮑魚的體內檢查毒性，確認毒性很小後採用上述方法培養，用無菌生理鹽水稀釋成0.1×104～0.1×108個/毫升的菌苗注射液，再將這種菌液噴灑到餌料上製成0.1×106～0.1×1010個/克的菌餌。脂多糖(Lps)的製備方法是，用改良的Wetphal方法提取病原菌的LPS，其注射液用量小於1.5mg/ml，餌料用量小於1.5mg/克。
幾年來經多方面的探索和研究現已基本查明引起鮑魚大批死亡的原因絕大多數是弧菌(Vibriosp.)所致。該弧菌包括有溶藻弧菌(V.alginolyticus)、副溶血弧菌(V.parahaenolyticus)，費尼斯弧菌(V.furnissii)、鱔弧菌(V.anguillarum)、河流弧菌II(V.flavialis)。另外還有假單胞菌屬(psedomonas.sp)和氣單胞菌屬(Aeromonas.sp)。
上述這些細菌在鮑魚體上引起的病症從體徵上來區分有兩種，其一是有明顯體徵的，如膿胞病。患該病的鮑魚足部肌肉上出現微隆起的白色皰，當破裂後流出白色膿汁並留下2～5mm的深孔。它導致鮑的附著力減弱，直至身體翻轉死亡。鏡檢膿汁發現除鮑的組織細胞外只有一種單生鞭毛短桿菌，經鑑定為河流弧菌II。其二是無明顯體徵的，患該病的鮑魚食慾不佳，消化功能減弱，附著力差。該病的發病率和死亡率極高。引起該病症的有弧菌、假單胞菌屬和氣單胞菌屬。
細菌的分離首先對有明顯體徵的病症的鮑魚用70％乙醇擦拭患部及周圍，然後用滅菌的解剖剪切開病灶，即刻用滅菌吸管吸取膿汁進行稀釋。對於無明顯體徵的病症，取剛死亡鮑的足和消化道消毒、滅菌後，放入滅菌的研缽中磨碎，然後放入帶有玻璃珠的瓶中。同樣取生長正常的無病鮑作對比試樣。將所取樣品接入改良肉湯(其中氯化鈉為1.0～2.5％)、改良胰瓊脂(其中水為海水)培養基中，於17～35℃溫箱中培養2～7天後觀察記錄菌落形態並分離優勢菌。
人工感染取分離出的並經純化的細菌置於肉湯瓊脂斜面上，於17～35℃培養24小時。用滅菌的生理鹽水分別洗下菌苔，離心洗滌後分別製成2×106個/ml和4×108個/ml活菌(採用平板稀釋法、血球計數法測定菌數)，然後給不同生長發育期的鮑魚注射和製成菌餌投喂，對照組注射生理鹽水。觀察七天後從有病症和死亡的鮑中分離菌株，此菌作為病原菌，並作為人工免疫的抗原。
通過觀察分析患膿胞病鮑的膿汁和其它病症的病鮑的血淋巴認為鮑魚體內有吞噬功能，能進行免疫。
鮑魚和細菌凝集性的證明(1)體外吞噬取在肉湯瓊脂斜面上經17～35℃培養的病原菌，用生理鹽水洗下菌苔，製成3×108個/ml菌液。取40μl正常鮑魚的血淋巴、20μl肝素、20μl菌液混勻，置37℃溼盒內35分鐘(經常搖動)，取一滴塗片，並進行呂氏染色和顯微拍照見
圖1，從圖片上可見細菌附著在細胞膜上，有的進入細胞，可計算吞噬率和消化指數。
(2)鮑魚抗原性的證明採用上述方法製成1×109個/ml菌液，用0.2％的甲醛滅活48～72小時，給成齡鮑按下述方法進行足肌肉、外套膜注射。第一天0.01ml、第二天0.02ml、第三天0.04ml、第四天0.08ml、第六天0.16ml、第十四天0.4ml、第十六天取鮑魚的血淋也作為凝集素、細菌作為凝集原作環狀沉澱，可見明顯的沉澱環。取同樣的菌液方法給2公斤的兔子皮下、腹腔注射，取兔子的血清為凝集素，細菌為凝集原環狀沉澱證明細菌也有抗原性。
鮑魚人工免疫物質的製備(1)死菌苗注射液及菌餌的製備將從病鮑中分離的弧菌屬(Vibro sp)、假單胞菌屬(psedomonas.sp)和氣單胞菌屬(Aeromonas.sp)的病原菌接種於肉湯蛋白腖的培養基上，經6～10小時培養用自製的接種棒接種於胰蛋白腖、瓊脂培養基中，於20～35℃培養12～26小時。用0.1～1.0％的甲醛洗下菌苔，處理24～120小時，離心，用無菌生理鹽水稀釋成104～1011個/ml的菌苗注射液，再將這種菌液噴灑到餌料上製成0.5～1.5億個/克的菌餌。菌的計數用血球計數法、平皿計數法和改良的Mc Farland比濁法。
(2)活菌苗注射液及菌餌的製備將經過30次連續傳代的菌種，皮下、腹腔注射進兔子和鮑魚的體內檢查毒性。確認毒性很小後採用上述方法培養。用無菌生理鹽水稀釋成0.1×104～108個/ml的菌苗注射液，再將這種菌液噴灑到餌料上，製成0.1×106～1010個/克的菌餌。
(3)脂多糖(Lps)的製備用改良的Wetphal方法提取病原菌的Lps，它在鮑魚體內具有良好的免疫效果，其注射液用量小於1.5mg/ml餌料用量小於1.5mg/g，還必須按個體的差異進行試驗。
本發明的工藝方法不複雜，生產成本低。製備出的各種有用的產品能提高鮑魚的免疫力提高成活率減少死亡率，作用持久。除此之外還能使鮑魚更加健康體重增加二成。它與使用抗菌素相比不僅費用低、不存在耐藥性的問題，而且消除了對海水的汙染。也消除了鮑魚體內殘留的抗菌素對人類的毒害。
圖面說明如下圖1是鏡檢鮑魚淋巴細胞的吞噬情況。
圖2是9301菌株的電鏡照片(×30,000)。
圖3是用9301菌株人工感染鮑魚後分離的菌株的紅外光譜圖。
圖4是9301菌株的紅外光譜圖。
例1先用70％灑精擦拭患膿皰病的鮑足肌肉表面(特別是膿皰部)，然後用滅菌的解剖剪刀剪破病灶，即刻用滅菌吸管吸出膿汁進行稀釋，然後培養在改良牛肉浸湯培養基(其中氯化鈉為2.5％)、改良胰瓊脂培養基(其中水改用海水)置17～19℃溫箱中培養2天後觀察；發現兩種培養基平板上均有一種優勢菌落，挑取純化為9301號。經對菌體的光鏡、電鏡觀察和革蘭氏染色結果證明其結構為革蘭氏陰性、極生單鞭毛的短杆形細菌，(如圖2所示)。該菌株經中國科學院微生物所鑑定為河流弧菌II(Vibr of luvialis)。取該菌株用滅菌的生理鹽水洗下菌苔，並經離心洗滌後製成2×106個/ml和4×108個/ml菌液(平板、血球計數法)、然後給體重10～13克的健康鮑足的肌肉注射2×106個/ml的菌液0.01ml，口服菌液4×108個/ml和創傷感染，對照組用生理鹽水。觀察七天，結果肌肉注射和創傷感染都產生膿皰，而口服由於量不夠僅有少部分感染產生膿皰。從膿胞中按上述方法分離菌株，其形態構造、性質同9301基本相似，其紅外光譜圖(圖3)與9301號的紅外光譜圖(圖4)基本相同，所以可確認鮑魚產生膿皰病是該種細菌所致。將從病鮑分離出的河流弧菌II接種於牛肉湯培養基中，培養6小時，用自製的接種棒接種於瓊脂蛋白腖培養基上，於20～35℃培養12小時。用0.1％的甲醛洗下菌苔處理120小時，離心，用生理鹽水稀釋成1.0×104個/ml菌苗注射液。將這種菌液噴到餌料上製成0.5×109個/克的菌餌。
例2
取剛剛死亡的鮑魚足和消化道放入滅菌的研缽中磨碎，然後放入帶有玻璃珠的瓶中，培養在改良牛肉浸湯培養基(其中氯化鈉為1.5％)，改良胰瓊脂培養基(其中水改為海水)置17～1 9℃溫箱中培養7天後觀察發現兩種培養基平板上均有一種優勢菌落，挑取純化，經鑑定為假單孢菌屬(Psedomonas.sp)重複例1的人工感染操作。再將從病鮑中分離出的假單孢菌接種於牛肉湯培養基中培養10小時，用自製接種棒接種於胰蛋白腖培養基上，於20～35℃培養26小時，用1％甲醛洗下菌苔處理24小時。離心用生理鹽水稀釋成1.0×1011個/ml菌苗注射液，將這種菌液噴到餌料上製成1.5×109個/克的菌餌。
例3將從鮑魚體內分離的病原菌經過29次連續傳代的菌種，給兔子皮下腹腔注射，鮑魚肌肉注射，確認毒性較小時接種於改良的肉湯培養基中，經6小時培養用自製接種棒接種於改良的蛋白腖培養基中於20～35℃培養12小時，用無菌生理鹽水稀釋成0.1×104個/ml的注射菌液和0.1×106個/克的菌餌。
例4取經過26次連續傳代的病原菌菌種，皮下、腹腔、靜脈注射給兔子和肌肉注射給鮑魚，確認毒性較小時接種於牛肉湯培養基中，經10小時培養用自製接種棒接種於胰蛋白腖培養基中於20～35℃培養26小時，用無菌生理鹽水稀釋成0.1×108個/ml注射菌液和0.1×1010個/克菌餌。
例5用改良的Wetphal方法提取從鮑魚體內分離的病原菌的Lps，然後製成1.2mg/g餌料給鮑魚投喂，或製成1。1ml/ml，注射液給鮑魚肌肉注射。
鮑魚人工免疫及其結果分析(1)成鮑免疫取36隻成鮑(♂♀各半)分成三組，第一組為對照組。注射無菌的生理鹽水，第二組為菌苗組，注射死菌苗的量為19。44億/只，分五次注射共21天，第三組為弱毒活菌苗組，注射量為0.3億/只，同樣分五次注射。第25天進行人工感染，注射活菌0.3×108個/只，免疫結果如下 同時將免疫的成鮑♀♂交配，其仔鮑作為母體免疫。
(2)一齡鮑的免疫取一齡鮑(殼長2～4釐米)90隻，分成三組，第一組為對照組，注射同體積的生理鹽水，第二組為菌苗組分五次注射6.4億/只死菌苗。第三組為弱毒菌苗組，用21天分五次注射0.2億/只活菌苗。從第25天開始注射活菌進行人工感染菌量為0.2×104個/只，其免疫結果如下 (3)鮑苗的免疫取剛剝離正常餌料死亡情況屬正常的18塊板鮑苗分三組，第一組為對照組，投餵空白餌料，第二組為菌苗組，第三組為母體免疫組。向第二、三組的鮑苗投餵0.3～6億/克的菌餌30天，海水溫度23～28℃，觀察結果如下 根據對鮑魚養殖的實際考察，病原菌最多的是夏季，其在水中的濃度為102～104個/ml，而本實驗細菌感染數量為2×108個/只，相當於5×109個/ml，這個數字遠遠大於鮑魚病原菌數幾萬到十幾萬倍，在這樣多的病原菌鮑魚都有良好的免疫力，在生產實際中免疫效果會更好。
權利要求
1.鮑魚人工免疫物質的製備方法，其特徵在於死菌苗注射液及菌按的製備方法是將從病鮑中分離的病原菌接種於肉湯蛋白腖的培養基上，經6～10小時培養用自製的接種棒接種於胰蛋白腖瓊脂培養基中，於20～35℃培養12～26小時，用0.1～1.0％的甲醛洗下菌苔，處理24～120小時，離心，用無菌生理鹽水稀釋成104～1011個/毫升的菌苗注射液，再將這種菌液噴灑到餌料上製成0.5～1.5億個/克的菌餌。
2.鮑魚人工免疫物質的製備方法，其特徵在於活菌苗注射液及菌餌的製備方法是將經過30左右次連續傳代的菌種皮下，腹腔注射進兔子和鮑魚的體內檢查毒性，確認毒性很小後採用上述方法培養，用無菌生理鹽水稀釋成0.1×104～0.1×108個/毫升的菌苗注射液，再將這種菌液噴灑到餌料上製成0.1×106～0.1×1010個/克的菌餌。
3.鮑魚人工免疫物質的製備方法，其特徵在於脂多糖(Lps)和製備方法是，用改良的Wetphal方法提取病原菌的LPS，其注射液用量小於1.5mg/ml，餌料用量小於1.5mg/克。
全文摘要
鮑魚人工免疫物質的製備方法，其死菌苗注射液及菌餌的製備方法是，將從病鮑中分離的病原菌接種於培養基上，然後用甲醛處理，稀釋成10
文檔編號A61K39/106GK1123182SQ94112648
公開日1996年5月29日 申請日期1994年11月24日 優先權日1994年11月24日
發明者李太武, 丁明進, 蘇秀榕, 劉金屏, 聶麗萍 申請人:遼寧師範大學