一種快速測定食物中毒樣品中的酵米麵黃桿菌毒素a的方法

2023-09-23 06:04:55 2

一種快速測定食物中毒樣品中的酵米麵黃桿菌毒素a的方法
【專利摘要】本發明公開了一種快速測定食物中毒樣品中的酵米麵黃桿菌毒素A的方法。屬於食品安全生物毒素檢測【技術領域】。主要步驟包括食品中酵米麵黃桿菌毒素A的提取、濃縮。運用串聯質譜，使用ESI源，在負離子模式下，確定了酵米麵黃桿菌毒素A的分子離子峰(M-1離子)為485.4，三個有代表性特徵子離子，分別為441.4、397.3、321.5。將濃縮好的樣品用UPLC經Waters C18 2.1mm×100mm，1.8μm分離，在MRM模式下進行定性定量分析。本發明解決了TLC和HPLC檢測方法的不足，簡化了提取步驟、提高了檢測靈敏度和準確度，重複性好，易於推廣應用。
【專利說明】一種快速測定食物中毒樣品中的酵米麵黃桿菌毒素A的方 法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種快速測定食物中毒樣品中的酵米麵黃桿菌毒素A的方法。屬於食 品安全生物毒素檢測【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 酵米麵黃桿菌是從引起食物中毒的酵米麵中分離出來的一種細菌。目前認為該菌 是引起食物中毒細菌中死亡率較高的一種。流行病學調查，我國近年在廣西、雲南、湖北、廣 東、四川、河北、江蘇等省發生多起酵米麵食物中毒事件。山東、河南、河北等省因進食變質 銀耳也發生同類中毒。中毒多發生在農村，特別是山區、半山區，城鎮偶見。引起中毒的主 要食品是酵米麵（玉米加水浸泡10?30天，用水洗，磨漿過濾，沉澱晾乾成粉，加工後 做成的食品）和變質的銀耳。中毒發病急、病情嚴重、發展迅速，病死率高達30?90%，至 今尚無特效的治療方法。
[0003] 目前檢測酵米麵黃桿菌毒素A(米酵菌酸）的國家標準檢測方法僅有GB/T 5009. 189-2003銀耳中米酵菌酸的測定中規定的薄層色譜法和高效液相色譜法，但該方法， 僅能檢測銀耳中的黃桿菌毒素A(米酵菌酸），且樣品提取複雜，耗時長，檢測靈敏度低，無 法準確定性等問題。


【發明內容】

[0004] 本發明提供了一種快速測定食物中毒樣品中的酵米麵黃桿菌毒素A的方法。
[0005] 本發明採用如下技術方案：
[0006] 本發明的快速測定食物中毒樣品中的酵米麵黃桿菌毒素A的方法包括步驟如下：
[0007] (1)樣品提取步驟；
[0008] (2)酵米麵黃桿菌毒素A的分子離子峰、特徵子離子峰及MM參數的確定；
[0009] (3)樣品定性定量檢測。
[0010] 所述樣品提取具體步驟如下：
[0011] ⑴不含油樣品：
[0012] 準確稱取2.OOOg食物，加IOml純水勻漿，用6mol/LHCL調至pH2?3,8000r/min 離心lOmin，取上清液，加正己烷提取兩次，每次10ml，合併正己烷，40°C旋轉蒸發至幹，用 甲醇定容至lml，待測；
[0013] (2)含油樣品：
[0014] 準確稱取2.OOOg食物，加IOml40g/L碳酸氫鈉勻漿，8000r/min離心lOmin，取上 清液，加石油醚IOml提取，棄去石油醚，用6mol/LHCL調至pH2?3,加正己燒提取兩次，每 次10ml，合併正己烷，40°C旋轉蒸發至幹，用甲醇定容至lml，待測；
[0015] 所述確定酵米麵黃桿菌毒素A分子離子峰、特徵子離子峰及
[0016] MM參數具體的步驟如下：
[0017] (1)把酵米麵黃桿菌毒素A的標準品，配置成lmg/kg的濃度，通過蠕動泵注入串聯 質譜儀，找到酵米麵黃桿菌毒素A分子離子峰（母離子，M-I離子）為485. 4、
[0018] (2)通過調節串聯質譜儀的碰撞氣能量（CE)和去簇電壓（DP)撞擊酵米麵黃杆 菌毒素A分子離子峰（母離子，M-I離子）485. 4,找到三個有代表性特徵子離子，分別為 441. 4,397. 3,321. 5〇
[0019] (3)通過串聯質譜儀把碰撞氣能量（CE)和去簇電壓（DP)調節到最佳狀態。選擇 測定酵米麵黃桿菌毒素A的離子對、碰撞電壓和去簇電壓詳見表1。
[0020] 表1酵米麵黃桿菌毒素MRM監測參數
[0021]

【權利要求】
1. 一種快速測定食物中毒樣品中的酵米麵黃桿菌毒素 A的方法，其特徵在於方法包括 步驟如下： (1) 樣品提取步驟； (2) 酵米麵黃桿菌毒素 A的分子離子峰、特徵子離子峰及MM參數的確定； (3) 樣品定性定量檢測。
2. 如權利要求1所述的快速測定食物中毒樣品中的酵米麵黃桿菌毒素 A的方法，其特 徵在於：所述樣品提取具體步驟如下： (1) 不含油樣品： 準確稱取2. OOOg食物，加 IOml純水勻漿，用6mol/L HCL調至pH2?3,8000r/min離心 lOmin，取上清液，加正己烷提取兩次，每次10ml，合併正己烷，40°C旋轉蒸發至幹，用甲醇定 容至lml，待測； (2) 含油樣品： 準確稱取2. OOOg食物，加 IOml 40g/L碳酸氫鈉勾眾，8000r/min離心lOmin，取上清 液，加石油醚IOml提取，棄去石油醚，用6mol/LHCL調至pH2?3,加正己燒提取兩次，每次 IOml，合併正己烷，40°C旋轉蒸發至幹，用甲醇定容至Iml，待測。
3. 如權利要求1所述的快速測定食物中毒樣品中的酵米麵黃桿菌毒素 A的方法，其特 徵在於：所述確定酵米麵黃桿菌毒素 A分子的離子峰、特徵子離子峰及MM參數具體的步驟 如下： (1) 把酵米麵黃桿菌毒素 A的標準品，配置成lmg/kg的濃度，通過蠕動泵注入串聯質譜 儀，找到酵米麵黃桿菌毒素 A分子離子峰（母離子，M-I離子）為485. 4 ; (2) 通過調節串聯質譜儀的碰撞氣能量CE和去簇電壓DP撞擊酵米麵黃桿菌毒素 A分 子離子峰（母離子，M-I離子）485. 4,找到三個有代表性特徵子離子，分別為441. 4、397. 3、 321. 5 ； (3) 通過串聯質譜儀把碰撞氣能量CE和去簇電壓DP調節到最佳狀態，選擇測定酵米麵 黃桿菌毒素 A的離子對、碰撞電壓和去簇電壓詳見下表；
〇
4. 如權利要求1所述的快速測定食物中毒樣品中的酵米麵黃桿菌毒素 A的方法，其特 徵在於：所述樣品檢測具體步驟如下： (1)對步驟2處理後的樣品使用超高效液相色譜和在ESI負離子模式下用串聯四極杆 質譜進行定性定量分析； ① 色譜條件為！Waters BEH HILIC 1.7 μπι 2. IX IOOmm色譜柱及同種填料不同柱形的 色譜柱；進樣量5?20 μ 1 ;柱溫為30°C;流動相A為水，其中含有0. 1 %甲酸：B為甲醇，流 動相比率A:B = 30% :70%，等梯度洗脫3min，流速300 μ1/π?η ; ② 質譜條件為：離子化方式：電噴霧離子源負離子模式；檢測方式:MRM ;碰撞氣： Midium ;氣簾氣：25psi ;霧化氣：45psi ;加熱氣：55psi ;噴霧電壓：-4500V ;去溶劑溫度： 400°C ;掃描時間：20ms ; (2) 對步驟2處理後的樣品進行定性測定：標準品及樣品溶液按照上述UPLC/MS/MS測 定條件分別進行測定，如果進行樣品測定時，檢出的色譜峰的保留時間與標準樣品相一致， 並且在扣除背景後的樣品質譜圖中，所選擇的3個二級特徵離子均出現，且與標準樣品的3 個特徵離子相一致，則可判斷樣品中存在酵米麵黃桿菌毒素 A ; (3) 對步驟2處理後的樣品進行定量測定：本方法中UPLC/MS/MS採用外標校準曲線法 定量測定，為減少基質對定量的測定的影響，採用不含酵米麵黃桿菌毒素 A的樣品洗脫液 來配製標準系列溶液，繪製標準曲線，並且保證所測樣品中酵米麵黃桿菌毒素 A的響應值 均在儀器的線性範圍內。
【文檔編號】G01N30/88GK104515823SQ201410781469
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2014年12月16日 優先權日:2014年12月16日
【發明者】林佶, 許燕, 趙世文, 徐丹先 申請人:雲南省疾病預防控制中心