通過體細胞胚胎誘導四合木再生植株的方法
2023-10-06 20:05:04 1
專利名稱：通過體細胞胚胎誘導四合木再生植株的方法
技術領域：
本發明涉及通過體細胞胚胎誘導四合木再生植株的方法，屬於生物技術領域。
背景技術：
四合木(Tetraena mongolica Maxim)，落葉小灌木，強旱生植物，是1. 4億年前古 地中海孑遺種，屬蒺藜科，四合木屬，單一種。主要分布於我國內蒙古自治區西部巴彥高勒 至寧夏回族自治區賀蘭山東麓的石嘴山之間，多生於石質低山，沙礫質高平原及山前洪積 扇等地，目前僅存有1萬公頃左右。四合木以有性生殖為主，但僅有11%的植株能正常開 花，結實率低、胚胎敗育率高。而且由於其種子對萌發條件要求苛刻，僅的種子能順利成 熟、實現繁殖。四合木的生殖特徵決定了它繁殖更新速度非常緩慢。此外，近年來，由於過 度放牧和工廠建設中濫墾濫伐，嚴重破壞了四合木的生存環境，使這一物種種群的面積和 現存數量越來越少、日漸瀕危。有專家認為，四合木具有極高的保護和科學研究的價值它的葉和嫩枝中能富集 Fe、Mn、Cu、Zn等多種微量元素；含有生物鹼、黃酮類、有機酸類、酚性化合物，可作藥用；其 莖中能積累大量油脂，可用作生物能源的原料；研究其莖中大量積累三脂醯甘油的生理生 化基礎和分子機理對利用營養器官儲存油脂的生物工程具有重要的科學意義。綜上所述，研究四合木的快速繁殖技術，擴大其種群、挽救這一瀕危植物，已迫在 眉睫。賈玉華等已對扦插繁殖做了研究，5-lOcm的枝條，用ABT處理後，插穗成活率較高。 何麗君等曾對四合木愈傷組織培養、誘導體細胞胚胎等進行過一些研究，初步建立了組織 培養體系，分析了組織培養過程中的一些基本規律。但目前尚未見報導適用於四合木大規 模快速擴繁、通過體細胞胚胎途徑誘導再生出完整植株的技術體系。體細胞胚胎的概念源於20世紀初德國植物學家Haberlandt提出的「細胞全能 性」的概念。他預言每個細胞都有在合適的條件下都能形成完整植株的潛力。後來，為了證 實這一論斷，許多科學家做了大量實驗。經過50餘年的不斷探索，至1958年，Steward等 將離體培養的胡蘿蔔脫分化細胞通過體細胞胚胎途徑形成完整的再生植株。此後，組織培 養技術迅速發展，通過體細胞胚胎發生途徑形成再生植株在金花茶、枸杞、木瓜、丁香、刺五 加、沙棘等多種灌木中均多有報導，而四合木中則尚未有成熟的體細胞胚胎發生、再生植株 的體系。
發明內容
本發明的目的在於提供一種四合木的胚性愈傷組織誘導培養基。本發明提供的胚性愈傷組織誘導培養基是在1/2MS培養基的基礎上添加2-(N_嗎 啡啉)乙磺酸(MES)、水解酪蛋白、肌醇、活性炭、CuSO4, AgN03、6-BA、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆 醇、煙酸、肌醇、碳源和凝膠劑，得到的固體培養基；所述添加的物質在所述胚性愈傷組織誘導培養基中的終濃度是:MES 0. 4-1. Og/ L、水解酪蛋白 450-550mg/L、肌醇 80_120mg/L、活性炭 0. 3-0. 7g/L、CuSO4 20_30mg/L、AgNO3 3-8mg/L、6-BA 0. 5-1. 5mg/L、鹽酸硫胺素 0. 5_12mg/L、鹽酸吡哆醇 0. 5-1. 5mg/L、煙 酸 0. 5-1. 5mg/L、肌醇 90-110mg/L ；所述1/2MS培養基的溶劑是水，溶質如表2所示。表2、1/2MS培養基的溶質
權利要求
四合木的胚性愈傷組織誘導培養基，是在1/2MS培養基的基礎上添加MES、水解酪蛋白、肌醇、活性炭、CuSO4、AgNO3、6 BA、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸、肌醇、碳源和凝膠劑，得到的固體培養基；所述添加的物質在所述胚性愈傷組織誘導培養基中的終濃度是MES 0.4 1.0g/L、水解酪蛋白450 550mg/L、肌醇80 120mg/L、活性炭0.3 0.7g/L、CuSO4 20 30mg/L、AgNO3 3 8mg/L、6 BA 0.5 1.5mg/L、鹽酸硫胺素0.5 12mg/L、鹽酸吡哆醇0.5 1.5mg/L、煙酸0.5 1.5mg/L、肌醇90 110mg/L；所述1/2MS培養基的溶劑是水，溶質如表2所示。
2.如權利要求1所述的胚性愈傷組織誘導培養基，其特徵在於所述添加的物質在所 述胚性愈傷組織誘導培養基中的終濃度是MES 0. 6g/L、水解酪蛋白500mg/L、肌醇IOOmg/ L、活性炭 0. 5g/L,CuSO4 25. 025mg/L、AgN03 5mg/L、鹽酸硫胺素 10mg/L、鹽酸吡哆醇 lmg/L、 煙酸 lmg/L、肌醇 100mg/L、6-BA 1. Omg/L。
3.如權利要求1或2所述的胚性愈傷組織誘導培養基，其特徵在於所述凝膠劑是瓊 脂、卡拉膠或植物凝膠，優選是植物凝膠；所述植物凝膠的終濃度是2-5g/L，優選為3. Og/ L ；所述碳源是葡萄糖、麥芽糖或蔗糖，優選為蔗糖；所述蔗糖的終濃度是25-40g/L，優選 為 30g/L。
4.一種生產四合木再生植株的方法，包括如下步驟1)將切下的四合木的莖誘導，形成愈傷組織；2)將步驟1)得到的愈傷組織接入權利要求1-3中任一所述的胚性愈傷組織誘導培養 基中，形成胚性愈傷組織；3)將步驟2)得到的胚性愈傷組織進行成熟和萌發培養，形成芽，得到所述再生植株。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於步驟1)中，所述誘導是將所述切下的四 合木的莖接入愈傷培養基中進行培養的；所述愈傷培養基是在MS培養基的基礎上添加2，4-D、6-BA、碳源和凝膠劑得到的固體培養基；所述2，4-D和6-BA在所述愈傷培養基中的終 濃度是如下a)或b)a)2，4-D0. 15-1. 35mg/L 和 6-BA 0. 05-1. 5mg/L ；b)2,4-D0. 25mg/L 和 6-BA 0. lmg/L ；所述MS培養基的溶劑是水，溶質如表1所示。
6.如權利要求4或5所述的方法，其特徵在於所述方法還包括步驟1)和步驟2)之 間的繼代培養，所述繼代培養是將所述步驟1)得到的愈傷組織接入繼代培養基中進行繼 代培養；所述繼代培養基與所述愈傷培養基相同。
7.如權利要求4-6中任一所述的方法，其特徵在於步驟3)中，所述成熟和萌發培養 包括如下步驟將所述步驟2)得到的胚性愈傷組織接入成熟和萌發培養基中培養得到芽； 所述成熟和萌發培養基是在權利要求1-3中任一所述的胚性愈傷組織誘導培養基的基礎 上去掉所述活性炭、所述6-BA濃度減半並且添加NAA得到的培養基；所述成熟和萌發培養 基中的NAA終濃度是0. 1-0. 5mg/L，優選是0. 5mg/L。
8.如權利要求4-7中任一所述的方法，其特徵在於所述方法還包括步驟3)之後的芽 伸長；所述芽伸長包括如下步驟將步驟3)得到的芽插入伸長培養基中進行培養，得到小苗；所述伸長培養基在權利要求1-3中任一所述的胚性愈傷組織誘導培養基的基礎上添加 GA3得到的培養基；所述伸長培養基中的GA3終濃度是0. 1-0. 2mg/L，優選是0. lmg/L。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於所述方法還包括芽伸長之後的生根培養， 所述生根培養包括如下步驟將所述小苗插入生根培養基中進行生根培養，得到帶根的植 株；所述生根培養基是1/2MS培養基的基礎上添加MES、水解酪蛋白、肌醇、活性炭、CuSO4, AgN03、6-BA、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸、肌醇、碳源和凝膠劑，得到的固體培養基；所述添加的物質在生根培養基中的終濃度是MES 0. 4-1. Og/L、肌醇80-120mg/L、IBA 0. 2-0. 5mg/L、鹽酸硫胺素10mg/L、鹽酸吡哆醇lmg/L、煙酸lmg/L、肌醇100mg/L ；所述1/2MS培養基的溶劑是水，溶質如表2所示。
10.如權利要求4-9中任一所述的方法，其特徵在於所述愈傷培養基、所述繼代培養 基和所述生根培養基中的凝膠劑均是瓊脂、卡拉膠或植物凝膠，均優選是瓊脂；所述瓊脂的 終濃度均是5-10g/L，均優選為8. Og/L ；所述愈傷培養基、所述繼代培養基和所述生根培養基中的碳源均是葡萄糖、麥芽糖或 蔗糖，均優選為蔗糖；所述蔗糖的終濃度均是25-40g/L，均優選為30g/L。
全文摘要
本發明公開了一種通過體細胞胚胎誘導四合木再生植株的方法。該方法，包括如下步驟1)將切下的四合木的莖誘導，形成愈傷組織；2)將步驟1得到的愈傷組織接入胚性愈傷組織誘導培養基中，形成胚性愈傷組織；3)將步驟2得到的胚性愈傷組織進行成熟和萌發培養，形成芽；4)將步驟3的芽接入伸長、生根培養基中，得到所述完整的再生植株。本研究旨在以四合木愈傷組織為外植體誘導出體細胞胚胎、進而形成再生植株，為建立高效穩定的體細胞胚胎發生系統奠定基礎，這對於四合木的快速繁殖、基因工程、遺傳轉化、遺傳改良等方面的研究，都有十分重要的意義。
文檔編號A01H4/00GK101953306SQ201010511430
公開日2011年1月26日 申請日期2010年10月19日 優先權日2010年10月19日
發明者吳韓英, 平文麗, 李敏春, 許亦農 申請人:中國科學院植物研究所