一種醉馬草成熟胚愈傷組織誘導及再生體系建立方法與流程
2023-10-06 20:04:24 2
本發明屬於農業栽培中通過組織培養技術的植物再生領域，具體涉及一種醉馬草成熟胚愈傷組織誘導及再生體系建立方法。
背景技術：
醉馬草為禾本科、芨芨草屬的多年生植物，是我國北方草原主要的烈性毒草之一， 廣泛分布在我國甘肅、新疆、內蒙古、青海等省區（史志誠，1997）。醉馬草具有抗高寒、耐乾旱等優勢，加之家畜對其多不食，因此其在退化草地群落種間競爭中具有較大的優勢，面積不斷擴大，特別是在乾旱、退化的草地中蔓延日益嚴重，某些省（區）醉馬草已成為優勢種群（李學森，1996）。
組織培養是指在無菌條件下利用人工培養基對植物組織進行培養，是生物工程研究的基礎，也是進行遺傳轉化和植物改良研究的基本環節。組織培養技術既不受季節限制、也不受地理位置限制，且遺傳背景一致、生長周期短、成本低。醉馬草作為一種頗具開發價值的禾草，有較強的抗逆性，自生繁衍能力強，適應性廣等特點，由於醉馬草根系發達、枝葉茂盛、具有極強的生命力、繁殖力、耐旱耐寒力，可以用作荒漠沙化土地等非放牧地區的防風固沙和水土保持植物，在乾旱半乾旱的惡劣環境條件下，醉馬草在草地群落中具有明顯的生長優勢。目前，以醉馬草成熟胚為外植體進行組織培養的研究還鮮有報導，因此建立以醉馬草成熟胚為外植體的組織培養再生體系很有必要，同時也為今後的轉基因研究奠定了基礎。
技術實現要素：
為了解決現有技術中存在的問題，本發明提供了一種醉馬草成熟胚愈傷組織誘導及再生體系建立方法；通過醉馬草成熟胚為外植體，構建愈傷組織誘導、植株再生獲得再生體系，為進行遺傳轉化和性狀改良提供重要的基礎性材料。
本發明提供一種醉馬草成熟胚愈傷組織誘導及再生體系建立方法，步驟如下：
（1）選擇醉馬草種子並消毒；
（2）誘導培養基、分化增殖培養基和生根培養基的篩選：
誘導培養基：基礎培養基+0.1-0.5 mg·L-1 6-BA +1.0-3.0 mg·L-1 2,4-D；
分化增殖培養基：基礎培養基+0.5-3.0mg/L 6-BA + 0.1-0.3mg/L NAA，
生根培養基：1/2基礎培養基+0.1-0.4 mg/L NAA；
所述基礎培養基為：MS培養基+蔗糖30g·L-1+瓊脂10g·L-1；
（3）成熟胚的處理和誘導分化：取步驟（1）中消毒的醉馬草種子，置於誘導培養基中培養，繼代幾次後轉入分化和增殖培養基中繼續培養，繼代幾次後轉入生根培養基中進行培養，待分化苗的根長4-6cm時，將瓶苗移出，閉瓶煉苗，2d後注入自來水，開瓶煉苗3d，然後洗淨根部，滅菌，用基質培養，獲得完整的再生植株。
作為優選，所述醉馬草為夏河醉馬草、天祝醉馬草或新疆醉馬草。
作為優選，當醉馬草為夏河醉馬草時，
愈傷組織誘導培養基為：基礎培養基+0.3 mg·L-1 6-BA +3.0 mg·L-1 2,4-D；
分化增殖培養基為：基礎培養基+0.5mg/L6-BA + 0.2mg/L NAA；
生根培養基為：1/2基礎培養基+0.1 mg/L NAA。
作為優選，當醉馬草為天祝醉馬草時，
愈傷組織誘導培養基為：基礎培養基+0.5 mg·L-1 6-BA+3.0 mg·L-1 2,4-D；
增殖培養基為：基礎培養基+3.0mg/L6-BA + 0.1mg/L NAA；
生根培養基為：1/2基礎培養基+0.2 mg/L NAA。
作為優選，當醉馬草為新疆醉馬草時，
愈傷組織誘導培養基為：基礎培養基+ 0.5 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 2,4-D；
增殖培養基為：基礎培養基+1.5mg/L6-BA + 0.2mg/L NAA；
生根培養基為：1/2基礎培養基+0.4 mg/L NAA。
作為優選，步驟（3）中所述誘導培養的培養條件為：於恆溫25±2℃條件下黑暗培養30d。
作為優選，步驟（3）中所述分化增殖培養的培養條件為：光照培養，光照強度1500-2000Lux，每天光照16 h·d-1，培養溫度為25℃。
作為優選，步驟（3）中所述生根培養的培養條件為：在 25±2℃、光照強度為2000-3000lx、光照時間16h·d-1條件下培養。
本發明的有益效果如下：
（1）本發明公開了一種醉馬草成熟胚愈傷組織誘導培養及再生體系的構建方法，以採集夏河、新疆和天祝的醉馬草成熟胚為外植體，通過不同生長調節物質對愈傷組織的誘導、分化、生根等步驟的影響，進行各種培養基的篩選，獲得以下最佳培養基以及最佳培養條件，提供了一種有效的適宜於不同生態型的醉馬草組織培養方法。最佳培養基如下：
基礎培養基為MS培養基加蔗糖30g·L-1和瓊脂10g·L-1；
A、出愈率較高的誘導培養基分別為：1）夏河醉馬草：基礎培養基+0.3 mg·L-1 6-BA +3.0 mg·L-1 2,4-D，誘導率為93%；（2）天祝醉馬草：基礎培養基+0.5 mg·L-1 6-BA+3.0 mg·L-1 2,4-D，誘導率為96%；(3)新疆醉馬草：基礎培養基+ 0.5 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 2,4-D誘導率為95%。
B、最佳分化和不定芽增殖培養基為 ：（1）夏河醉馬草：基礎培養基+0.5mg/L 6-BA + 0.2mg/L NAA，增殖率90%；（2）天祝醉馬草：基礎培養基+3.0mg/L 6-BA + 0.1mg/L NAA，增殖率83%； (3)新疆醉馬草 基礎培養基+1.5mg/L 6-BA + 0.2mg/L NAA，增殖率88%。
C、最佳生根成苗培養基為：（1）夏河醉馬草：1/2基礎培養基+0.1 mg/L NAA；（2）天祝醉馬草：1/2基礎培養基+0.2 mg/L NAA；(3)新疆醉馬草：1/2基礎培養基+0.4 mg/L NAA，生根率均達100%。
（2）本發明選用醉馬草成熟胚為外植體，進行組織再生培養，不受取材材料時空限制。本發明為醉馬草愈傷組織誘導的組培方法，操作簡單，成本廉價；建立的醉馬草成熟胚培養植株再生方法體系，為進行遺傳轉化和性狀改良提供重要的基礎性資料。
附圖說明
附圖用來提供對本發明的進一步理解，並且構成說明書的一部分，與本發明的實施例一起用於解釋本發明，並不構成對本發明的限制。在附圖中：
圖1為夏河醉馬草成熟胚誘導愈傷組織；
圖2為夏河醉馬草愈傷組織分化綠苗；
圖3為夏河醉馬草生根的幼苗；
圖4為夏河醉馬草移栽後的再生植株。
具體實施方式
以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市售。
本發明的方法具體步驟如下：
（1）植物材料選取及處理：選擇色澤、大小均勻的醉馬草成熟種子，去除外稃後在流水下衝洗30分鐘，然後用75%酒精處理5min，無菌水衝洗2-3次，用10%次氯酸鈉消毒10min，無菌水衝洗3-5次，將種子置於無菌濾紙，直至種子水分吸乾後待用；所述的醉馬草種子指的是：採集於夏河、新疆和天祝的醉馬草種子。
（2）誘導和分化增殖培養基篩選：基礎培養基為MS培養基加蔗糖30g·L-1和瓊脂10g·L-1；
誘導培養基、分化增殖培養基為基礎培養基附加不同處理激素。
誘導培養基是在基礎培養基的基礎上添加6-BA和2,4-D。設置6-BA濃度為0.1mg·L-1、0.3mg·L-1、0.5mg·L-1；2,4-D的濃度為1.0mg·L-1、2.0mg·L-1、3.0mg·L-1；
分化和增殖培養基是在基礎培養基的基礎上添加6-BA和NAA。設置6-BA濃度為0.5mg·L-1、1.0mg·L-1、1.5mg·L-1、2.0mg·L-1、2.5mg·L-1、3.0mg·L-1；NAA的濃度為0.1mg·L-1、0.2mg·L-1、0.3mg·L-1；
生根培養基是在1/2 基礎培養基的基礎上添加NAA。設置1/2 MS培養基添加NAA濃度為0.1mg·L-1、0.2mg·L-1、0.3mg·L-1、0.4mg·L-1。以上培養基pH均調至5.8～6.0，在121℃下高壓溼熱滅菌20min；
（3）成熟胚的處理和誘導分化：本步驟對各部分的培養條件進行了優化選擇，在以下培養條件時能夠取得最佳的培養效果。具體培養方法如下：取步驟（1）中消毒處理好的種子，置於含有不同濃度的誘導培養基中，於恆溫培養箱(25±2)℃條件下黑暗培養30d，期間將意外染菌重複除去，統計出愈率和生長狀況。並將愈傷組織轉入最優的誘導培養基進行繼代增殖，繼代周期為15d，繼代三次後轉入含有不同濃度的分化和增殖培養基進行光照培養，光照強度1500-2000Lux，每天光照16 h·d-1，培養溫度為25℃，每2周繼代一次，繼代3次，30d後統計愈傷組織分化率及出苗率；
（4）待分化苗長至2-3cm時，將最優分化率和出苗率的分化苗轉入含有不同濃度的NAA生根培養基，在 (25±2)℃、光照強度為2000～3000lx、光照時間16h·d-1條件下培養。待分化苗的根長5cm左右，將瓶苗移出培養室，自然光下閉瓶煉苗，2d後注入自來水，自然光下開瓶煉苗，3d後統計生根率。洗淨根部後，移入高壓蒸汽滅菌後基質（珍珠巖：蛭石：營養土（杭州瑞波園藝資材部）=2:3:1）培養，獲得完整的再生植株。
經試驗，在上述選擇的培養基配方範圍內，均有較好的誘導、分化或生根的效果，採用上述不同的培養基，對夏河醉馬草的誘導率在82%-93%之間，增殖率在80%-90%之間，生根率在95%-100%之間；對天祝醉馬草的誘導率在86%-96%之間，增殖率在76%-83%之間，生根率在94%-100%之間；對新疆醉馬草的誘導率在90%-95%之間，增殖率在80%-88%之間，生根率在95%-100%之間。
其中，最優培養基如下：
A、出愈率較高的誘導培養基分別為：1）夏河醉馬草：基礎培養基+0.3 mg·L-1 6-BA +3.0 mg·L-1 2,4-D，誘導率為93%；（2）天祝醉馬草：基礎培養基+0.5 mg·L-1 6-BA+3.0 mg·L-1 2,4-D，誘導率為96%；(3)新疆醉馬草：基礎培養基+ 0.5 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 2,4-D誘導率為95%。
B、最佳分化和不定芽增殖培養基為 ：（1）夏河醉馬草：基礎培養基+0.5mg/L 6-BA + 0.2mg/L NAA，增殖率90%；（2）天祝醉馬草：基礎培養基+3.0mg/L 6-BA + 0.1mg/L NAA，增殖率83%； (3)新疆醉馬草 基礎培養基+1.5mg/L 6-BA + 0.2mg/L NAA，增殖率88%。
C、最佳生根成苗培養基為：（1）夏河醉馬草：1/2基礎培養基+0.1 mg/L NAA；（2）天祝醉馬草：1/2基礎培養基+0.2 mg/L NAA；(3)新疆醉馬草：1/2基礎培養基+0.4 mg/L NAA，生根率均達100%。
實施例1
本發明的方法具體步驟如下：
（1）植物材料選取及處理：選擇色澤、大小均勻的醉馬草成熟種子，去除外稃後在流水下衝洗30分鐘，然後用45%酒精處理5min，無菌水衝洗2-3次，用10%次氯酸鈉消毒10min，無菌水衝洗3-5次，將種子置於無菌濾紙，直至種子水分吸乾後待用；所述的醉馬草種子指的是：採集於夏河的野生醉馬草種子。
（2）誘導培養基、分化增殖培養基和生根培養基的配方如下：
基礎培養基為MS培養基加蔗糖30 g·L-1和瓊脂10 g·L-1；
誘導培養基和分化增殖培養基為基礎培養基附加不同處理激素。
愈傷組織誘導培養基為：基礎培養基+0.3 mg·L-1 6-BA +3.0 mg·L-1 2,4-D；
分化增殖培養基為：基礎培養基+0.5mg/L6-BA + 0.2mg/L NAA；
生根培養基為：1/2基礎培養基+0.1 mg/L NAA。
以上培養基pH均調至5.8～6.0，在121℃下高壓溼熱滅菌20min；
（3）成熟胚的處理和誘導分化：取步驟（1）中消毒處理好的種子，置於誘導培養基中，於恆溫培養箱(25±2)℃條件下黑暗培養30d，期間將意外染菌重複除去，然後進行繼代增殖，繼代周期為15d，繼代三次後，測得誘導率為93%；轉入分化增殖培養基進行光照培養，光照強度1500-2000Lux，每天光照16 h·d-1，培養溫度為25℃，每2周繼代一次，繼代3次，30d後統計愈傷組織分化率及出苗率，增殖率為90%；
（4）待分化苗長至2-3cm時，轉入生根培養基，在 (25±2)℃、光照強度為2000-3000lx、光照時間16h·d-1條件下培養，生根率為100%。待分化苗的根長5cm左右，將瓶苗移出，閉瓶煉苗2d後注入自來水，開瓶煉苗3d後統計生根率。洗淨根部後，移入高壓蒸汽滅菌後基質（珍珠巖：蛭石：營養土=2:3:1）培養，獲得完整的再生植株。
實施例2
本實施例與實施例1的不同之處在於：
所選的醉馬草種子為採集於天祝的醉馬草種子。
基礎培養基為MS培養基加蔗糖30 g·L-1和瓊脂10 g·L-1；
所述的愈傷組織誘導培養基為：基礎培養基+0.5 mg·L-1 6-BA+3.0 mg·L-1 2,4-D，誘導率為96%；
所述的增殖培養基為：基礎培養基+3.0mg/L6-BA + 0.1mg/L NAA，增殖率83%；
所述的生根培養基為：1/2基礎培養基+0.2 mg/L NAA，生根率為100%。
實施例3
本實施例與實施例1的不同之處在於：
所選的醉馬草種子為採集於新疆的醉馬草種子。
基礎培養基為MS培養基加蔗糖30 g·L-1和瓊脂10 g·L-1；
所述的愈傷組織誘導培養基為：基礎培養基+ 0.5 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 2,4-D，誘導率為95%；
所述的增殖培養基為：基礎培養基+1.5mg/L6-BA + 0.2mg/L NAA，增殖率88%；
生根培養基為：1/2基礎培養基+0.4 mg/L NAA，生根率為100%。
最後應說明的是：以上所述僅為本發明的優選實施例而已，並不用於限制本發明，儘管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對於本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特徵進行等同替換。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。