在Ti材料表面組裝攜層粘連蛋白和SDF-1α的納米顆粒的方法

2023-10-07 08:06:54

在Ti材料表面組裝攜層粘連蛋白和SDF-1α的納米顆粒的方法
【專利摘要】本發明公開了一種在Ti材料表面組裝攜層粘連蛋白和SDF-1α的納米顆粒的方法。首先製備出載Ln的Hep-PLL納米顆粒。然後在心血管材料表面製備DM塗層，利用DM與氨基可發生麥可加成和西弗鹼反應的特性，將含有氨基的納米顆粒共價固定至樣品表面。最後利用納米顆粒中的肝素能夠特異性結合SDF-1α的特性，將SDF-1α組裝於納米顆粒表面，從而構建具有抗凝、抗增生及誘導內皮再生的多功能生物化修飾表面。本發明在心血管材料表面構建具有抗凝血、抗增生和誘導內皮再生特性的納米顆粒修飾層，顯著改善了材料的血液相容性、內皮及內皮祖細胞相容性，增強了抑制平滑肌增生的能力。
【專利說明】在Ti材料表面組裝攜層粘連蛋白和SDF-1 α的納米顆粒的
方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及納米顆粒製備技術和無機材料表面改性技術，特別涉及心血管植入物材料的表面生物化改性方法。
【背景技術】
[0002]心血管材料植入體內後因直接與血液接觸，因此需要具有優異的抗凝血能力。此夕卜，對於特殊的心血管植入物如血管支架等，在良好的血液相容性的基礎上，還應具有抑制血管內膜組織過度增生、促進內皮層快速修復的能力。
[0003]通過對心血管材料表面進行生物化改性，賦予材料良好的抗凝血能力和血管內皮再生能力是改善其生物相容性的有效方法。而心血管材料往往為無機材料,不具備直接和生物分子發生反應的特性。多巴胺(DM)作為一種生物體內的神經傳導物質，能夠通過配位反應和自聚反應在心血管金屬材料如不鏽鋼、鈦及鈦合金等表面形成牢固的聚DM層，且得到的聚DM層具有與含氨基的生物分子發生西弗鹼反應或麥可加成反應的特性，因而在表面生物改性領域得到了廣泛的關注。但聚DM層仍存在著血液相容性不足的缺點，限制了其在心血管材料領域中的應用。
[0004]肝素(Hep)是一種臨床常見的抗凝血藥物，常用於材料表面的抗凝修飾。此外，肝素可與多種具內皮細胞友好性的生物因子及細胞外基質蛋白結合，延長這些蛋白質在體內的活性和半衰期，促進內皮損傷修復。其中Hep結合性層粘連蛋白(Ln)是血管內皮基底膜中所特有的基質蛋白，能有效促進內皮細胞的粘附、遷移和生長；Hep結合性間質細胞衍生因子-1 a (SDF-1 α )則是一種對骨髓源內皮祖細胞具有強烈趨化作用的趨化因子，可以有效刺激內皮祖細胞向損傷位點處聚集，誘導內皮損傷修復。
[0005]Hep分子結構中幾乎不含氨基，因而不能直接固定在聚DM層表面。利用Hep與Ln的特異性結合作用，以及H印能夠與多聚賴氨酸(PLL)通過靜電交互作用形成具有3D結構的納米顆粒的特性，可製備出載Ln的Hep-PLL納米顆粒。納米顆粒中PLL和Ln均富含氨基，有利於納米顆粒在聚DM層表面的固定。利用SDF-Ια與H印間能發生特異性結合的特性，可進一步將SDF-1 α裝載於納米顆粒表面。
[0006]這種組裝了攜層粘連蛋白和SDF-1 α的納米顆粒的表面可有效改善材料的血液相容性，抑制平滑肌過度增生，同時促進內皮損傷修復。而目前尚無將載層粘連蛋白的Hep-PLL納米顆粒和SDF-1 α組裝於鈦材料表面的相關報導。

【發明內容】

[0007]本發明的目的在於提供一種在心血管材料表面組攜層粘連蛋白和SDF-1 α的納米顆粒的方法，通過該方法對心血管材料表面進行生物化改性可有效提高材料的血液相容性,增強內皮細胞相容性並抑制平滑肌增生。
[0008]本發明實現以上目的採用的技術方案是，一種在心血管材料表面組裝攜層粘連蛋白和SDF-1 α的納米顆粒的方法，其步驟為:
[0009]Α、聚多巴胺沉積在Ti表面沉積聚多巴胺塗層，37°C烘乾；
[0010]B、載層粘連蛋白的納米顆粒的製備將濃度為30_300μ g/ml的層粘連蛋白溶液，等體積滴加至濃度為10-30mg/ml的肝素鈉溶液中，37°C靜置l_3h ;然後在室溫和磁力攪拌條件下，將肝素鈉和層粘連蛋白混合液等體積滴加至濃度為0.3?1.0mg/ml的多聚賴氨酸(PLL, MW150-300KDa)溶液中；
[0011]C、納米顆粒固定將A步驟中沉積有聚多巴胺的樣品浸泡於B步驟獲得的納米顆粒懸液中，在15-50°C振蕩條件下反應6-24小時，分別用磷酸鹽緩衝液(PBS)和雙蒸水漂洗，保存待用；
[0012]D、SDF_1 α組裝將C步驟獲得的樣品浸入50_500ng/ml的SDF-1 α溶液中，在4°C條件下靜置反應8?24小時，PBS漂洗後即得。
[0013]本發明的反應過程與機理主要分為兩個部分。第一部分為載Ln的納米顆粒的製備。利用Ln與H印的相互作用，首先使Ln與Hep充分結合；其次在pH=7.4的PBS體系中，利用Hep與PLL可發生靜電交互作用形成納米顆粒的特性,製備得到載Ln的Hep-PLL納米顆粒。第二部分為納米顆粒和SDF-1 α在材料表面的組裝。首先將樣品浸泡於DM的Tris溶液中，DM中的兒茶酚基團與金屬表面形成配位結合，或與高分子表面形成共價鍵合，並在有氧條件下交聯自聚，從而在材料表面形成一層牢固的DM層。得到的DM聚合層具有二次反應性，其氧化得到的鄰二琨基團可與納米顆粒中的伯氨基發生西弗鹼和麥可加成反應，從而將納米顆粒共價固定在DM表面；其次，利用SDF-1a能與納米顆粒中的肝素發生特異性結合的特性，可將SDF-1 α組裝於納米顆粒表面。
[0014]與現有技術相比，本發明的有益效果是:
[0015]—、倉Il造性地製備出載Ln的Hep-PLL納米顆粒,利用納米顆粒表面暴露的氨基可與聚DM層發生共價反應的特性，以及納米顆粒中的肝素可特異性結合SDF-1 α的特性，可將載Ln的納米顆粒和SDF-1 α組裝於心血管材料表面。通過該種方法，可以有效地將H印和層粘連蛋白固定於聚DM層表面，控制H印的長期有效釋放，同時增強SDF-1 α的活性和釋放時間，促進其內皮損傷修復效果。
[0016]二、組裝了載Ln的納米顆粒和SDF-1 α的表面具有合理的調控血管內應答時序的能力。首先，肝素化的表面能有效抑制血栓形成和平滑肌過度增生；其次，SDF-1 α植入後立即開始持續釋放，有助於誘導骨髓內皮祖細胞和周圍內皮細胞的動員和遷移；最後，納米顆粒中的Ln有助於捕獲這些遷移過來的內皮細胞和內皮祖細胞，促進其粘附和增殖，並誘導內皮修復。
[0017]三、納米顆粒的製備工藝及固定方法均簡單易操作，無需昂貴複雜的設備，工藝成本較低，效果顯著。
[0018]四、納米顆粒和SDF-1 α在材料表面的組裝均採用浸泡方式進行，可保證材料各個部分能均勻地固定上納米顆粒，也有利於實現各種結構複雜的心血管植入器械的表面修飾，適用範圍廣。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]下面結合附圖和實施例對本發明的方法作進一步詳細的說明。[0020]圖1為本發明方法中攜層粘連蛋白和SDF-1 α的納米顆粒在心血管材料表面組裝的各步驟不意圖。
[0021]圖2為(A)攜Ln的納米顆粒粒徑尺寸分布；(B)攜Ln的納米顆粒在DM塗層表面固定後的AFM形貌圖。
[0022]圖3為樣品表面肝素和SDF-1 α累積釋放檢測結果。(A)肝素釋放；(B) SDF-1 α釋放。
[0023]圖4為樣品表面血小板粘附I小時的掃描電鏡圖，不鏽鋼作為陽性對照。
[0024]圖5為樣品表面內皮、內皮祖及平滑肌細胞生長I天后的螢光染色結果，不鏽鋼作為陽性對照。
【具體實施方式】
[0025]實施例一
[0026]參見圖1，本發明的第一種【具體實施方式】是，一種在Ti材料表面組裝載層粘連蛋白的納米顆粒和SDF-1 α的方法，其步驟為:
[0027]Α、聚多巴胺沉積在心血管金屬Ti材料表面沉積聚多巴胺塗層，37°C烘乾；
[0028]B、載層粘連蛋白的納米顆粒的製備將濃度為30 μ g/ml的層粘連蛋白溶液，等體積滴加至濃度為10mg/ml的肝素鈉溶液中，37°C靜置Ih ;然後在室溫和磁力攪拌條件下，將肝素鈉和層粘連蛋白混合液等體積滴加至濃度為0.3mg/ml的多聚賴氨酸(PLL，MW150-300KDa)溶液中；
[0029]C、納米顆粒固定將A步驟中沉積有聚多巴胺的樣品浸泡於B步驟獲得的納米顆粒懸液中，在50°C振蕩條件下反應24小時，分別用磷酸鹽緩衝液(PBS)和雙蒸水漂洗，保存待用；
[0030]D、SDF_1 α組裝將C步驟獲得的樣品浸入50ng/ml的SDF-1 α溶液中，在4°C條件下靜置反應8小時，PBS漂洗後即得。
[0031]實施例二
[0032]一種在Ti材料表面組裝載層粘連蛋白的納米顆粒和SDF-1 α的方法，其步驟為:
[0033]Α、聚多巴胺沉積在金屬Ti材料表面沉積聚多巴胺塗層，37°C烘乾；
[0034]B、載層粘連蛋白的納米顆粒的製備將濃度為300 μ g/ml的層粘連蛋白溶液，等體積滴加至濃度為30mg/ml的肝素鈉溶液中，37°C靜置3h ;然後在室溫和磁力攪拌條件下，將肝素鈉和層粘連蛋白混合液等體積滴加至濃度為1.0mg/ml的多聚賴氨酸(PLL，MW150-300KDa)溶液中；
[0035]C、納米顆粒固定將A步驟中沉積有聚多巴胺的樣品浸泡於B步驟獲得的納米顆粒懸液中，在15°C振蕩條件下反應6小時，分別用磷酸鹽緩衝液(PBS)和雙蒸水漂洗，保存待用；
[0036]D、SDF-1 α組裝將C步驟獲得的樣品浸入500ng/ml的SDF-1 α溶液中，在4°C條件下靜置反應24小時，PBS漂洗後即得。
[0037]實施例三
[0038]一種在Ti材料表面組裝載層粘連蛋白的納米顆粒和SDF-1 α的方法，其步驟為:
[0039]Α、聚多巴胺沉積在金屬Ti材料表面沉積聚多巴胺塗層，37°C烘乾；[0040]B、載層粘連蛋白的納米顆粒的製備將濃度為200 μ g/ml的層粘連蛋白溶液，等體積滴加至濃度為20mg/ml的肝素鈉溶液中，37°C靜置2h ;然後在室溫和磁力攪拌條件下，將肝素鈉和層粘連蛋白混合液等體積滴加至濃度為0.5mg/ml的多聚賴氨酸(PLL，MW150-300KDa)溶液中；
[0041]C、納米顆粒固定將A步驟中沉積有聚多巴胺的樣品浸泡於B步驟獲得的納米顆粒懸液中，在37°C振蕩條件下反應12小時，分別用磷酸鹽緩衝液(PBS)和雙蒸水漂洗，保存待用；
[0042]D、SDF-1 α組裝將C步驟獲得的樣品浸入200ng/ml的SDF-1 α溶液中，在4°C條件下靜置反應12小時，PBS漂洗後即得。
【權利要求】
1.一種在Ti材料表面組裝攜層粘連蛋白和SDF-1 α的納米顆粒的方法，其步驟為: Α、聚多巴胺沉積在心血管金屬材料表面沉積聚多巴胺塗層，37°C烘乾； B、載層粘連蛋白的納米顆粒的製備將濃度為30-300μ g/ml的層粘連蛋白溶液，等體積滴加至濃度為10-30mg/ml的肝素鈉溶液中，37°C靜置l_3h ;然後在室溫和磁力攪拌條件下，將肝素鈉和層粘連蛋白混合液等體積滴加至濃度為0.3~1.0mg/ml的多聚賴氨酸(PLL, MW150-300KDa)溶液中； C、納米顆粒固定將A步驟中沉積有聚多巴胺的樣品浸泡於B步驟獲得的納米顆粒懸液中，在15-50°C振蕩條件下反應6-24小時，分別用磷酸鹽緩衝液PBS和雙蒸水漂洗，保存待用； D、SDF-1α組裝將C步驟獲得的樣品浸入50_500ng/ml的SDF-1 α溶液中，在4°C條件下靜置反應8~24小時，PBS漂洗後即得。
2.根據權利要求1所述的在Ti材料表面組裝攜層粘連蛋白和SDF-Ια的納米顆粒的方法，其特徵在於:所 述C步驟中的保存方法為表面溼潤條件下，4°C冷藏保存。
【文檔編號】B05D7/24GK103894328SQ201410083750
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月7日 優先權日:2014年3月7日
【發明者】陳俊英, 劉濤, 劉陽, 王健, 黃楠, 曾崢, 魏來, 王媛, 劉詩卉, 張琨, 陳佳龍 申請人:西南交通大學