改造層粘連蛋白及其利用的製作方法
2023-10-07 08:00:44 1
改造層粘連蛋白及其利用的製作方法
【專利摘要】本發明提供改造層粘連蛋白、在該改造層粘連蛋白存在下培養細胞的培養方法、在該改造層粘連蛋白存在下建立iPS細胞的方法以及包被有該改造層粘連蛋白的培養基質，該改造層粘連蛋白的特徵在於，在層粘連蛋白或形成了異三聚體的層粘連蛋白片段的α鏈的N末端、α鏈的C末端、β鏈的N末端以及γ鏈的N末端的至少1處結合有細胞增殖控制分子。通過使用本發明的改造層粘連蛋白，在無異源成分環境下培養人幹細胞，從而能夠提供可應用於再生醫療的安全性高的人幹細胞。
【專利說明】改造層粘連蛋白及其利用
【技術領域】
[0001]本發明涉及改造人層粘連蛋白及其利用，具體而言，涉及在層粘連蛋白或其片段上結合有細胞增殖控制分子的改造人層粘連蛋白、使用該改造人層粘連蛋白的細胞培養方法和iPS細胞的建立方法以及包被有該改造人層粘連蛋白的培養基質。
【背景技術】
[0002]幹細胞特別是ES細胞、iPS細胞等多能幹細胞在再生醫療中的應用正受到全世界的關注。但是，為了在保持多能性的狀態下培養、維持幹細胞，通常將細胞在與作為飼養細胞的用放射線、抗生素進行處理使細胞分裂停止的來源於小鼠胚胎的成纖維細胞(MEF)共存下進行培養。作為MEF，通常，經常使用STO細胞等，但在iPS細胞的誘導中，經常使用SNL細胞(McMahon, A.P.&Bradley, A.Cell62, 1073-1085 (1990))等。然而，在臨床應用幹細胞的階段，這些飼養細胞的使用成為很大的制約。為了解決該問題，迄今為止正在嘗試以各種細胞粘附分子作為幹細胞的胞外基質來代替飼養細胞，其中，報導了從過量產生基底膜成分的小鼠EHS腫瘤中製備得到的粗提物(以商品名Matrigel (7卜U Y >)進行市售)的多能性維持活性最高。但是，雖然已知Matrigel富含層粘連蛋白、IV型膠原蛋白等基底膜成分，但其組成並未被完全闡明，而且，由於其來源於小鼠，因此並不適合再生醫療中的人幹細胞的培養。
[0003]為了將人幹細胞應用於再生醫療，優選滿足不使用飼養細胞的無飼養細胞條件以及從培養體系中排除異源成分的無異源成分(Xeno-Free)條件的培養環境。因此，作為來源於人的胞外基質，正嘗試使用 人玻連蛋白、人纖連蛋白，但它們與Matrigel相比，人幹細胞的未分化維持效果、粘附效率差，在質量、材料來源的確保、安全性等方面存在問題。由此可見，現狀是適於維持培養用於應用於再生醫療的人幹細胞的胞外基質的開發沒有進展，迫切要求開發使用化學組成均一的人源性胞外基質的新的人幹細胞培養技術。
[0004]層粘連蛋白是基底膜的主要的細胞粘附分子，是由α鏈、β鏈以及Y鏈這3條亞基鏈構成的異三聚體，是分子量為80萬Da的巨大糖蛋白。3條亞基鏈在C末端側締合而形成捲曲螺旋結構並通過二硫鍵形成穩定的異三聚體分子。本發明人報導了人層粘連蛋白(特別是由α3β3y2構成的層粘連蛋白332以及由α 5 β I Y I構成的層粘連蛋白511)的重組蛋白對於維持人ES細胞的多能性有效(參照非專利文獻I)。然而，在人幹細胞的表面還發現了層粘連蛋白受體以外的粘附受體(位於細胞表面且介導細胞向胞外基質的粘附的膜結合分子)，單獨依靠層粘連蛋白分子不能有效利用這些粘附受體。因此，迫切期望開發具有更接近天然粘附活性且能夠在無飼養細胞條件下培養人幹細胞的新的來源於人的胞外基質。
[0005]現有技術文獻
[0006]非專利文獻
[0007]非專利文獻1:Miyazaki T, Futaki S, Hasegawa K, Kawasaki M, Sanzen N, HayashiMj Kawase E，Sekiguchi K，Nakatsuji N，Suemori H.Recombinant human laminin isoformscan support the undifferentiated growth of human embryonic stem cells.Biochem.Biophys.Res.Commun.375:27-35，2008.
【發明內容】
[0008]發明所要解決的問題[0009]本發明的課題在於，提供能夠在無飼養細胞的培養環境中以保持多能性的狀態維持培養幹細胞的培養基質、使用該培養基質的細胞培養方法和iPS細胞建立方法以及包被有該胞外基質的培養基質。
[0010]用於解決問題的方法
[0011]本發明為了解決上述課題而包含下述發明。
[0012][I] 一種改造層粘連蛋白，其特徵在於，在層粘連蛋白或形成了異三聚體的層粘連蛋白片段的α鏈的N末端、α鏈的C末端、β鏈的N末端以及Y鏈的N末端的至少I處結合有細胞增殖控制分子。
[0013][2]根據上述[I]所述的改造層粘連蛋白，其中，細胞增殖控制分子是細胞粘附分子。
[0014][3]根據上述[I]所述的改造層粘連蛋白，其中，細胞增殖控制分子是增殖因子結合分子。
[0015][4]根據上述[I]~[3]中任一項所述的改造層粘連蛋白，其中，層粘連蛋白片段具有整合蛋白結合活性。
[0016][5]根據上述[4]所述的改造層粘連蛋白，其中，層粘連蛋白片段是層粘連蛋白ES片段。
[0017][6]根據上述[I]~[5]中任一項所述的改造層粘連蛋白，其中,層粘連蛋白由選自α I~α 5的I種α鏈、選自β I~β 3的I種β鏈、選自Y I~Y 3的I種Y鏈構成。
[0018][7]根據上述[6]所述的改造層粘連蛋白，其中，層粘連蛋白是層粘連蛋白α5β IYl或層粘連蛋白α3β3Y2。
[0019][8]根據上述[2]所述的改造層粘連蛋白，其中，細胞粘附分子是選自以下(a)~Ce)中的至少I種以上，
[0020](a)與整合蛋白結合的細胞粘附分子、
[0021](b)與膜結合型蛋白聚糖結合的細胞粘附分子、
[0022](C)與盤狀結構域受體結合的細胞粘附分子、
[0023](d)與肌營養不良蛋白聚糖結合的細胞粘附分子、
[0024](e)與細胞表面的糖鏈結合的細胞粘附分子。
[0025][9]根據上述[2]所述的改造層粘連蛋白，其中，細胞粘附分子是選自以下(a)~(k)的至少I種以上，
[0026](a)纖連蛋白或其包含細胞粘附活性位點的片段、
[0027](b)膠原蛋白或其包含細胞粘附活性位點的片段、
[0028](c)玻連蛋白或其包含細胞粘附活性位點的片段、
[0029](d)腎連蛋白或其包含細胞粘附活性位點的片段、[0030](e)骨橋蛋白或其包含細胞粘附活性位點的片段、
[0031](f) MAEG或其包含細胞粘附活性位點的片段、
[0032](g)肌腱蛋白或其包含細胞粘附活性位點的片段、
[0033](h) SVEPl或其包含細胞粘附活性位點的片段、
[0034](i) TGF-β I 潛在相關肽(TGF-β llatency associated peptide)或其包含細胞粘附活性位點的片段、
[0035](j) TGF-β 3潛在相關肽或其包含細胞粘附活性位點的片段、
[0036](k)層粘連蛋白α鏈的球形結構域4和/或球形結構域5。[0037][10]根據上述[3]所述的改造層粘連蛋白，其中，增殖因子結合分子是選自以下Ca)~(f)的至少I種以上，
[0038](a)基底膜蛋白聚糖或其包含增殖因子結合位點的片段、
[0039](b)聚集蛋白或其包含增殖因子結合位點的片段、
[0040](C)XVIII型膠原蛋白或其包含增殖因子結合位點的片段、
[0041](d)多配體蛋白聚糖或其包含增殖因子結合位點的片段、
[0042](e)磷脂醯肌醇蛋白聚糖或其包含增殖因子結合位點的片段、
[0043](f)潛在TGF-β結合蛋白(latent TGF-β binding protein)或其包含增殖因子結合位點的片段。
[0044][11]根據上述[I]~[10]中任一項所述的改造層粘連蛋白，其中，改造層粘連蛋白來源於人。
[0045][12] 一種哺乳動物細胞的培養方法，其特徵在於，在上述[I]~[11]中任一項所述的改造人層粘連蛋白的存在下進行培養。
[0046][13]根據上述[12]所述的的培養方法，其中，哺乳動物細胞是ES細胞、iPS細胞或成體幹細胞。
[0047][14]根據上述[12]或[13]所述的的培養方法，其中，不使用飼養細胞。
[0048][15] 一種培養基質，其特徵在於，包被有上述[I]~[11]中任一項所述的改造人層粘連蛋白。
[0049][16]根據上述[15]所述的培養基質，其中，以0.03~25 μ g/cm2的濃度包被有改造人層粘連蛋白。
[0050][17] 一種iPS細胞的建立方法，其特徵在於，包括:在上述[I]~[11]中任一項所述的改造層粘連蛋白的存在下使核重編程物質(核初期化物質)與體細胞接觸的步驟。
[0051][18]根據上述[17]所述的iPS細胞的建立方法，其中，所述核重編程物質包含選自由Oct家族、Sox家族、Klf家族、Lin家族和Glis家族以及編碼它們的核酸組成的組中的I種以上的物質。
[0052]發明效果
[0053]根據本發明，能夠提供作為可在無飼養細胞的培養環境中以保持多能性的狀態維持培養幹細胞的胞外基質的改造人層粘連蛋白、使用該改造人層粘連蛋白的細胞培養方法和iPS細胞建立方法以及包被有該改造人層粘連蛋白的培養基質。通過使用來源於人的改造人層粘連蛋白，以無異源成分的培養基建立iPS細胞、培養人幹細胞，能夠提供可應用於再生醫療的安全性高的人幹細胞。【專利附圖】
【附圖說明】
[0054]圖1是示出使人層粘連蛋白α 5β I Y I的E8片段與人層粘連蛋白α I鏈第4~5個球形結構域融合後得到的改造人層粘連蛋白(以下記作「Plus # I層粘連蛋白ES」)以及使人層粘連蛋白α 5β I Y I的ES片段與人纖連蛋白的細胞粘附位點融合後得到的改造人層粘連蛋白(以下記作「Plus # 2層粘連蛋白E8」)的SDS-PAGE分析結果的圖。
[0055]圖2是示出對人iPS細胞對Plus # I層粘連蛋白E8、Plus # 2層粘連蛋白E8或Matrigel的濃度依賴性粘附效率進行比較的結果的圖。
[0056]圖3是示出使用包被有Plus # I層粘連蛋白E8、Plus # 2層粘連蛋白E8或Matrigel的培養基質對人iPS細胞進行I代或3代傳代培養後的結果的圖。 [0057]圖4是示出確認Plus # 2層粘連蛋白E8對重組人α5β I整合蛋白或重組人α6β I整合蛋白的結合活性的結果的圖。
[0058]圖5是示出使用包被有Plus # I層粘連蛋白E8、Plus # 2層粘連蛋白E8、全長層粘連蛋白511或Matrigel的培養基質對人ES細胞進行單個分散培養後的結果的圖。
[0059]圖6是示出使用包被有Plus # I層粘連蛋白E8、Plus # 2層粘連蛋白E8、使人層粘連蛋白α 5β I Y I的E8片段與人基底膜蛋白聚糖的結構域I~III融合後得到的改造人層粘連蛋白(以下記作「Plus # 3層粘連蛋白E8」)或人層粘連蛋白α5β I Yl的E8片段、或Matrigel的培養基質對人iPS細胞進行7天的培養後確認存活的結果的圖。
[0060]圖7是示出使用包被有Plus # I層粘連蛋白E8或Plus # 2層粘連蛋白E8的培養基質對人iPS細胞進行10代傳代培養後對未分化標記0ct3/4、SSEA-4以及TRA-1-60進行免疫染色的結果的圖。
[0061]圖8是示出使用包被有Plus # I層粘連蛋白E8、Plus # 2層粘連蛋白E8、全長層粘連蛋白511或Matrigel的培養基質對人iPS細胞進行單個分散培養後的結果的圖。
[0062]圖9是示出對使用未包被皿、包被Plus # I層粘連蛋白E8的皿以及包被Plus # 2粘連蛋白ES的皿從來源於成人皮膚的成纖維細胞建立人iPS細胞進行研究的結果的圖。
[0063]圖10是示出附加體(episomal)質粒載體的結構的圖，(I)是pCEB-hSK-O, (II)是pCEB-hUL-G。
【具體實施方式】
[0064]〔改造人層粘連蛋白〕
[0065]本發明提供一種改造層粘連蛋白，其特徵在於，在層粘連蛋白或形成了異三聚體的層粘連蛋白片段的α鏈的N末端、α鏈的C末端、β鏈的N末端以及Y鏈的N末端的至少I處結合有細胞增殖控制分子。
[0066]層粘連蛋白是由α鏈、β鏈以及Υ鏈這3條亞基鏈構成的異三聚體分子。已知α鏈為α?~α5這5種，β鏈為β?~β3這3種，Y鏈為Y I~Y 3這3種,並且它們的組合至少存在12種以上的異構體(參照表1)。構成本發明的改造層粘連蛋白的層粘連蛋白可以是任一種異構體。也就是說，構成本發明的改造層粘連蛋白的層粘連蛋白只要由選自α I~α 5的I種α鏈、選自β?~β3中的I種β鏈、選自Y I~Y 3中的I種Y鏈構成即可。具體而言，可以優選使用表1中記載的12種以及除此之外的全部異構體。優選的是層粘連蛋白α3β3gamma2、層粘連蛋白α5β1gamma1。
[0067]表1
【權利要求】
1.一種改造層粘連蛋白，其特徵在於，在層粘連蛋白或形成了異三聚體的層粘連蛋白片段的α鏈的N末端、α鏈的C末端、β鏈的N末端以及Y鏈的N末端的至少I處結合有細胞增殖控制分子。
2.根據權利要求1所述的改造層粘連蛋白，其中，細胞增殖控制分子是細胞粘附分子。
3.根據權利要求1所述的改造層粘連蛋白，其中，細胞增殖控制分子是增殖因子結合分子。
4.根據權利要求1~3中任一項所述的改造層粘連蛋白，其中，層粘連蛋白片段具有整合蛋白結合活性。
5.根據權利要求4所述的改造層粘連蛋白，其中，層粘連蛋白片段是層粘連蛋白ES片段。
6.根據權利要求1~5中任一項所述的改造層粘連蛋白，其中，層粘連蛋白由選自α I~α 5的I種 α鏈、選自β I~β 3的I種β鏈、選自Y I~Y 3的I種Y鏈構成。
7.根據權利要求6所述的改造層粘連蛋白，其中，層粘連蛋白是層粘連蛋白αδβ?gamma?或層粘連蛋白α3β3gamma2。
8.根據權利要求2所述的改造層粘連蛋白，其中，細胞粘附分子是選自以下(a)~(e)中的至少I種以上， Ca)與整合蛋白結合的細胞粘附分子、 (b)與膜結合型蛋白聚糖結合的細胞粘附分子、 (c)與盤狀結構域受體結合的細胞粘附分子、 Cd)與肌營養不良蛋白聚糖結合的細胞粘附分子、 Ce)與細胞表面的糖鏈結合的細胞粘附分子。
9.根據權利要求2所述的改造層粘連蛋白，其中，細胞粘附分子是選自以下(a)~(k)的至少I種以上， Ca)纖連蛋白或其包含細胞粘附活性位點的片段、 (b)膠原蛋白或其包含細胞粘附活性位點的片段、 (c)玻連蛋白或其包含細胞粘附活性位點的片段、 Cd)腎連蛋白或其包含細胞粘附活性位點的片段、 Ce)骨橋蛋白或其包含細胞粘附活性位點的片段、 (f)MAEG或其包含細胞粘附活性位點的片段、 (g)肌腱蛋白或其包含細胞粘附活性位點的片段、 (h)SVEPl或其包含細胞粘附活性位點的片段、 (i)TGF-β I潛在相關肽或其包含細胞粘附活性位點的片段、 (j) TGF-β 3潛在相關肽或其包含細胞粘附活性位點的片段、 (k)層粘連蛋白α鏈的球形結構域4和/或球形結構域5。
10.根據權利要求3所述的改造層粘連蛋白，其中，增殖因子結合分子是選自以下Ca)~(f)的至少I種以上， Ca)基底膜蛋白聚糖或其包含增殖因子結合位點的片段、 (b)聚集蛋白或其包含增殖因子結合位點的片段、 (C)XVIII型膠原蛋白或其包含增殖因子結合位點的片段、(d)多配體蛋白聚糖或其包含增殖因子結合位點的片段、 (e)磷脂醯肌醇蛋白聚糖或其包含增殖因子結合位點的片段、 Cf)潛在TGF-β結合蛋白或其包含增殖因子結合位點的片段。
11.根據權利要求1~10中任一項所述的改造層粘連蛋白，其中，改造層粘連蛋白來源於人。
12.—種哺乳動物細胞的培養方法,其特徵在於,在權利要求1~11中任一項所述的改造人層粘連蛋白的存在下進行培養。
13.根據權利要求12所述的的培養方法，其中，哺乳動物細胞是ES細胞、iPS細胞或成體幹細胞。
14.根據權利要求12或13所述的培養方法，其中，不使用飼養細胞。
15.—種培養基質，其特徵在於，包被有權利要求1~11中任一項所述的改造人層粘連蛋白。
16.根據權利要求15所述的培養基質，其中，以0.03~25 μ g/cm2的濃度包被有改造人層粘連蛋白。
17.—種iPS細胞的建立方法，其特徵在於，包括:在權利要求1~11中任一項所述的改造層粘連蛋白的存在下使 核重編程物質與體細胞接觸的步驟。
18.根據權利要求17所述的iPS細胞的建立方法，其中，所述核重編程物質包含選自由Oct家族、Sox家族、Klf家族、Lin家族和Glis家族以及編碼它們的核酸組成的組中的I種以上的物質。
【文檔編號】C07K14/78GK103649112SQ201280017315
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2012年4月9日 優先權日:2011年4月8日
【發明者】關口清俊, 谷口徵雅, 中川誠人 申請人:國立大學法人大阪大學, 國立大學法人京都大學