一種微藻總脂含量的快速測定方法與流程

2023-10-06 16:26:54

本發明屬於能源微藻脂類含量測定技術領域，具體涉及一種微藻總脂含量的快速測定方法。

背景技術：

目前對於微藻脂類含量的測定方法主要有以下兩種：

1、索氏提取法

步驟如下：（1）準確稱取3-4g乾燥的藻粉，裝入已稱重並編號的濾紙包中，封好包口備用。將索氏提取器各部位充分洗滌並用蒸餾水潤洗後烘乾，脂肪燒瓶在103±2℃的烘箱內乾燥至恆重。（2）將濾紙筒放入索氏提取器的抽提筒內，連接已乾燥至恆重的脂肪燒瓶，由抽提器冷凝管上端加入石油醚至瓶內容積的2/3處，通入冷凝水，將燒瓶浸在水浴中加熱，用一小團脫脂棉輕輕塞入冷凝管上口。（3）水浴溫度應控制在使提取液每6-8min回流一次為宜。（4）抽提時間為4-5h，提取完畢，用毛玻璃板接取一滴提取液，如無油斑則表明提取完畢。（5）提取完畢，取下脂肪燒瓶，回收石油醚。待燒瓶內石油醚僅剩下1-2mL時，在水浴上蒸盡殘留的溶劑，於95-105℃乾燥2h，置於乾燥器中冷卻至室溫後稱量。繼續乾燥30min後冷卻稱量，反覆乾燥至恆重（GB/T 5009.6—2003, 食品中脂肪的測定）。

2、有機溶劑抽提-重量法

取100mg藻粉加入2mL質量百分數為10%的二甲亞碸-甲醇溶液，分別於50℃抽提30min、冰浴抽提30min後，離心收集上清液於預先烘乾的玻璃瓶中，藻渣加入乙醚/正己烷4mL（1:1，v/v），冰浴抽提1h，離心收集上清液至同一玻璃瓶中，重複上述過程直到藻渣變白。在合併的抽提液中加入2mL蒸餾水，震蕩分相，移取有機相至另一玻璃瓶中，在通風櫥中用氮氣吹至較小體積，將濃縮液轉移至預先稱重過的1.5mL塑料離心管中，用氮氣吹乾至恆重，即得總脂含量(Khozin-Goldberg I, Shrestha P, Cohen Z. Mobilization of arachidonyl moieties from triacylglycerols into chloroplastic lipids following recovery from nitrogen starvation of the microalga Parietochloris incisa. Biochimica Et Biophysica Acta, 2006, 1738: 63–71)。

以上兩種微藻總脂含量的測定方法都十分耗時費力，對於大規模分析的樣品及需要連續快速監測的樣品測定十分不利。因此，有必要研製一種方便快捷、靈敏度高且成本低廉的微藻總脂含量的測定方法以解決上述技術問題。

技術實現要素：

為克服現有技術中無法實現大規模分析及連續快速監測微藻總脂含量的問題，本發明提供了一種微藻總脂含量的快速測定方法，該方法所用試劑價廉易得，使用常規測試儀器即可完成，並且測定快速準確。

本發明為解決上述技術問題採用如下技術方案，一種微藻總脂含量的快速測定方法，其具體步驟為：

步驟（1）、乙基香草醛試劑的配製，將0.12g乙基香草醛溶解於20mL蒸餾水中，再用質量百分含量為85%的磷酸定容至100mL得到乙基香草醛試劑；

步驟（2）、有機溶劑抽提-重量法測定微藻總脂含量，收集培養結束的藻液，分別取500mL和1000mL藻液，置於離心機中於10000r/min的離心速率離心5min後棄上清，並用蒸餾水清洗，將藻泥置於冷凍乾燥機中乾燥5h，乾燥後稱量藻粉的質量分別為72.5mg和125.2mg，分別取藻粉加入2mL體積百分數為10%的二甲亞碸的甲醇溶液，分別於50℃抽提30min、冰浴抽提30min後，離心收集上清液於預先烘乾的玻璃瓶中，藻渣加入體積比為1:1的乙醇-正己烷溶液，冰浴抽提1h，離心收集上清液至同一玻璃瓶中，重複上述過程直至藻渣變白，在合併的抽提液中加入2mL蒸餾水，震蕩分層，移取有機相至另一玻璃瓶中，氮氣吹乾至恆重，即得總脂含量分別為27.13%和25.12%，取平均值為26.13%對測定樣品進行標定；

步驟（3）、標準曲線的繪製，分別取1mL、2mL、5mL、8mL和10mL步驟（2）收集培養結束的藻液置於離心機中於10000r/min的離心速率離心5min，清洗後反覆離心得到藻泥，分別用蒸餾水定容至1mL，加入到10mL具塞比色管中，再分別加入摩爾濃度為18mol/L的硫酸溶液2mL，於沸水浴中孵化10min，60℃水浴孵化10min，加入步驟（1）得到的乙基香草醛試劑5mL，於37℃保溫15min，再常溫水浴10min，然後在分光光度計中於417nm處測定吸光光度值，最終得到吸光光度值與微藻總脂濃度的標準曲線；

步驟（4）、待測微藻總脂含量的測定，收集工業生產過程中培養結束的藻液，取5mL置於離心機中於10000r/min的離心速率離心5min，清洗後反覆離心得到藻泥，用蒸餾水定容至1mL，加入到10mL具塞比色管中，再加入摩爾濃度為18mol/L的硫酸溶液2mL，於沸水浴中孵化10min，60℃水浴孵化10min，加入步驟（1）得到的乙基香草醛試劑5mL，於37℃保溫15min，再常溫水浴10min，然後在分光光度計中於417nm處測定吸光光度值，根據步驟（3）得到的吸光光度值與微藻總脂濃度的標準曲線最終確定待測微藻總脂的含量。

本發明中微藻可以與乙基香草醛試劑反應生成一種紅色物質，這是乙基香草醛反應可以用於測定脂肪含量的基礎，試劑中的磷酸與乙基香草醛的羥基作用後產生芳香族磷酸酯，並且改變了乙基香草醛分子中的電子分配，使醛基變成酯基；另一方面，不飽和脂類與硫酸作用可以水解生成碳鎓離子，磷酸酯與這種碳鎓離子發生反應，最終生成紅色醌化物，在417nm處存在最大吸收峰，得到的吸光度值需要傳統微藻總脂含量測定方法的標定，最終得到藻類總脂含量。本發明具有方便快捷、靈敏度高和成本低廉等優點。

附圖說明

圖1是四種香草醛類試劑和蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）反應後生成的紅色醌化物在分光光度計上400-1100nm可見光範圍內的連續波長掃描，可以看出四種反應試劑的紅色生成物的最大吸收峰均存在於417nm處，其中乙基香草醛法的吸光度值最大，表明其測定方法最為靈敏；

圖2是在417nm處測定乙基香草醛法與蛋白核小球藻反應液的吸光度值和藻液總脂濃度的線性回歸曲線，由圖可以看出該方法測定的吸光度值與小球藻脂肪酸含量之間存在很好的線性回歸關係（R2=0.997，P 109個/mL）離心收集藻細胞，使用HGZ培養基配方（章宗涉, 黃祥飛．淡水浮遊生物研究方法．北京：科學出版社，1991），按照1.2×106個/mL的初始濃度進行接種，置於培養箱中進行為期14天的培養，光照條件為60μmol/m2•s，培養溫度25℃。

2、香草醛類試劑的配製

香草醛類試劑可能均可與藻類脂肪酸發生反應，顯色反應會因試劑不同有所差異，分別選取了四種試劑：香草醛、丁香草醛、鄰香草醛和乙基香草醛進行對比測試，具體試劑的配製方法為：分別準確稱取0.12g香草醛類試劑（香草醛、丁香草醛、鄰香草醛和乙基香草醛）溶解於20mL蒸餾水中，再用質量濃度為85%的磷酸溶液定容至100mL備用。

3、波長掃描

將處於對數生長期的小球藻藻液取出，分別準確量取體積5mL 4份，在10000r/min條件下進行離心，清洗後復離心，用蒸餾水定容至1mL，加入10mL具塞比色管中，再加入摩爾濃度為18mol/L的硫酸溶液2mL，於沸水浴中孵化10min，60℃水浴孵化10min，分別加入配製好的香草醛類試劑5mL，於37℃保溫15min，再常溫水浴10 min。使用分光光度計在400-1100nm之間進行波長掃描，結果表明四種試劑與小球藻反應後，均在417nm處找到最大吸收峰，其中乙基香草醛試劑在417nm處的吸光度值最高，表明該方法測定微藻的脂肪酸含量最靈敏。

4、微藻總脂含量的測定

（1）、乙基香草醛試劑的配製，將0.12g乙基香草醛溶解於20mL蒸餾水中，再用質量百分含量為85%的磷酸定容至100mL得到乙基香草醛試劑；

（2）、有機溶劑抽提-重量法測定微藻總脂含量，收集培養結束的藻液，分別取500mL和1000mL藻液，置於離心機中於1000r/min的離心速率離心5min後棄上清，並用蒸餾水清洗，將藻泥置於冷凍乾燥機中乾燥5h，乾燥後稱取藻粉的質量分別為72.5mg和125.2mg，分別取藻粉加入2mL體積百分數為10%的二甲亞碸的甲醇溶液，分別於50℃抽提30min、冰浴抽提30min後，離心收集上清液於預先烘乾的玻璃瓶中，藻渣加入體積比為1:1的乙醇-正己烷溶液，冰浴抽提1h，離心收集上清液至同一玻璃瓶中，重複上述過程直至藻渣變白，在合併的抽提液中加入2mL蒸餾水，震蕩分層，移取有機相至另一玻璃瓶中，氮氣吹乾至恆重，即得總脂含量分別為27.13%和25.12%，取平均值為26.13%對測定樣品進行標定；

（3）、標準曲線的繪製，分別取1mL、2mL、5mL、8mL和10mL步驟（2）收集培養結束的藻液置於離心機中於10000r/min的離心速率離心5min，清洗後反覆離心得到藻泥，分別用蒸餾水定容至1mL，加入到10mL具塞比色管中，再分別加入摩爾濃度為18mol/L的硫酸溶液2mL，於沸水浴中孵化10min，60℃水浴孵化10min，加入步驟（1）得到的乙基香草醛試劑5mL，於37℃保溫15min，再常溫水浴10min，然後在分光光度計中於417nm處測定吸光光度值，最終得到吸光光度值與微藻總脂濃度的標準曲線；

（4）、待測微藻總脂含量的測定，收集工業生產過程中培養結束的藻液，取5mL置於離心機中於10000r/min的離心速率離心5min，清洗後反覆離心得到藻泥，用蒸餾水定容至1mL，加入到10mL具塞比色管中，再加入摩爾濃度為18mol/L的硫酸溶液2mL，於沸水浴中孵化10min，60℃水浴孵化10min，加入步驟（1）得到的乙基香草醛試劑5mL，於37℃保溫15min，再常溫水浴10min，然後在分光光度計中於417nm處測定吸光光度值，根據步驟（3）得到的吸光光度值與微藻總脂濃度的標準曲線最終確定待測微藻總脂的含量。

以上實施例描述了本發明的基本原理、主要特徵及優點，本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明原理的範圍下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進均落入本發明保護的範圍內。