用環介導等溫擴增方法檢測河流弧菌的試劑盒及方法

2023-10-24 16:45:52 1

專利名稱：用環介導等溫擴增方法檢測河流弧菌的試劑盒及方法
技術領域：
本發明涉及一種用環介導等溫擴增方法檢測河流弧菌的試劑盒，進一步涉及一種使用該種試劑盒快速檢測河流弧菌的方法。
背景技術：
河流弧菌(Vibrio fluvialis)是廣泛分布在海洋裡的一種革蘭氏陰性致病菌。該菌已引起包括海水養殖貝類(鮑)和牙鮃等多種水產動物的敗血症、膿皰病等疾病，給水產養殖業造成了嚴重的經濟損失。該菌不僅可以感染水產動物，還可以通過食物傳播感染人類，主要是因進食未煮熟的汙染河流弧菌的海產品而導致流行性腹瀉，其症狀與由霍亂弧菌引起的霍亂極為相似，因此，河流弧菌現在被認為是重要的人類食源性疾病和水產養殖動物疾病病原。
以往檢測河流弧菌主要有三種辦法1.生化鑑定法，該法費時，操作繁瑣，不能滿足病害防治的需要；2.螢光抗體檢測法，雖然該法較靈敏，但耗時也較長，且需要昂貴的螢光檢測設備；3.聚合酶鏈式反應法(PCR法)，該法較前兩種方法快速、靈敏，但需要昂貴的PCR儀。目前尚未有用環介導等溫擴增方法檢測河流弧菌的試劑盒及方法的報導。
發明的內容本發明的目的是提供一種快速、特異性強、靈敏度高且成本低的用環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法檢測河流弧菌的試劑盒，並提供一種使用該試劑盒快速檢測河流弧菌的方法，從而為水產養殖和食品安全提供科學的依據和指導作用。
本發明的主要原理為(1)特殊設計一組可識別靶DNA六個不同序列的兩個內引物(上遊內引物和下遊內引物)和兩個外引物(上遊外引物和下遊外引物)，內引物包含靶DNA的正義鏈和反義鏈；(2)其中一個內引物首先與靶DNA雜交，隨後的鏈置換DNA合成在具有高度鏈置換活性的DNA聚合酶的參與下由一個外引物啟動，釋放出單鏈DNA，並作為由雜交到靶的另一端的一個內引物和一個外引物啟動的DNA合成的模板，產生一個原始的莖環DNA；(3)內引物以原始的莖環DNA為模板，啟動鏈置換DNA的合成，產生一個原始的莖環DNA和一個新的有兩倍莖長度的莖環DNA；(4)在等溫條件下，內引物以莖環DNA為模板，通過鏈置換形成多個含有靶DNA反覆重複序列的莖環DNA，在一小時內該循環反應可使靶DNA累積到109拷貝，可通過螢光染料來觀察擴增結果。
本發明涉及的一種用環介導等溫擴增方法檢測河流弧菌的試劑盒，其試劑包括
(1)環介導等溫擴增(LAMP)反應液A含有10×Thermopol反應緩衝液、300-500uM dNTP(四種脫氧核苷酸的混合物)、2-4mM硫酸鎂(MgSO4)、0.8-1.2uM上遊內引物(flu-FIP)、0.8-1.2uM下遊內引物(flu-BIP)、0.2-0.3uM上遊外引物(flu-F3)、0.2-0.3uM下遊外引物(flu-B3)和1-1.5M甜菜鹼；其中10×Thermopol反應緩衝液含有200mM pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)、100mM氯化鉀(KCl)、100mM硫酸銨((NH4)2SO4)、20mM硫酸鎂(MgSO4)和1％曲拉通X-100(Triton X-100)；上遊內引物(flu-FIP)為gtgccttccacatcaccaggattttggtgacctgatcgtcacac；下遊內引物(flu-BIP)為tccgcagtgactggtcgagtcttttgaagccttggctgacttgg；上遊外引物(flu-F3)為 tcctgcaagacgaaatggc；下遊外引物(flu-B3)為 ctcactaaacgtcggtgctc；(2)Bst DNA聚合酶B每微升含8個活性單位(8U/uL)；(3)顯色劑C為10％的螢光染料SYBR GREEN I。
上面所述環介導等溫擴增(LAMP)反應液A每管23uL的最佳組成為2.5uL 10×Thermopol反應緩衝液、1.0uL 10mM dNTP(四種脫氧核苷酸的混合物)、1.0uL 20uM上遊內引物(flu-FIP)、1.0uL 20uM下遊內引物(flu-BIP)、0.25uL 20uM上遊外引物(flu-F3)、0.25uL20uM下遊外引物(flu-B3)、0.5uL 100mM MgSO4、12.5uL 2M甜菜鹼和4uL ddH2O(滅菌雙蒸水)。
使用上述環介導等溫擴增方法檢測河流弧菌的試劑盒檢測河流弧菌的方法，依次包括下列步驟(1)細菌DNA的提取A.取1.0-1.5mL過夜培養的菌液，置於1.5mL離心管中，用臺式離心機10000-12000轉/分離心5-10分鐘，棄上清液；B.加入1.0-1.5mL滅菌雙蒸水，混勻，用臺式離心機10000-12000轉/分離心5-10分鐘，棄上清液；C.加入100-150 uL滅菌雙蒸水，混勻，100℃沸水浴10-15分鐘；D.用臺式離心機10000-12000轉/分離心5-10分鐘，取上清液至一個新的1.5mL離心管中，即為待檢模板DNA；(2)河流弧菌的環介導等溫擴增A.在裝有23uLLAMP反應液A的反應管中加入和1uL待檢模板DNA，於恆溫金屬浴上95℃放置3-5分鐘，立即置於冰上1-3分鐘；B.在反應管中加入1uL下遊內引物(para-BIP)DNA聚合酶B；C.於恆溫金屬浴上60-65℃放置45-90分鐘；
D.將金屬浴調到80-95℃中止反應，3-5分鐘後取出；(3)顯色檢測在反應管中加入1uL顯色劑C，直接用肉眼觀察顏色變化，如果顏色為黃色，說明待檢細菌不是河流弧菌，如顏色變為綠色，則說明樣品為河流弧菌。
本發明的優點本發明建立了河流弧菌的環介導等溫擴增檢測試劑盒及檢測方法，本試劑盒根據河流弧菌的基因保守區的六個序列設計了兩個特異性內引物和兩個特異性外引物，以保證檢測不同來源河流弧菌株的可靠性。本發明採用環介導等溫擴增(LAMP)技術，該技術特異性強，與PCR檢測方法有相同的高靈敏度，但不需昂貴的PCR儀，只需普通的金屬浴或水浴鍋即可，且結果不必用凝膠電泳方法來觀察，使用螢光染料來觀察即可，簡單而快速。可用於河流弧菌的檢測，特別適合於基層醫療機構以及養殖現場應用。
具體實施例方式
下列實例是進一步對本發明的說明，不應該當作對本發明的限制。
按下列配方製作河流弧菌的環介導等溫擴增檢測試劑盒(1)LAMP反應液A2.5uL10×Thermopol反應緩衝液、1.0uL 10mM dNTP(四種脫氧核苷酸的混合物)、1.0uL 20uM上遊內引物(flu-FIP)、1.0uL 20uM下遊內引物(flu-BIP)、0.25uL 20uM上遊外引物(flu-F3)、0.25uL 20uM下遊外引物(flu-B3)、0.5uL 100mM MgSO4、12.5uL 2M甜菜鹼和4uL ddH2O(滅菌雙蒸水)。
(2)Bst DNA聚合酶B濃度為8U/uL。
(3)顯色劑C10％的SYBR GREEN I。
按照以下程序進行檢測(1)細菌DNA的提取A.取1.0mL過夜培養的菌液，置於1.5mL離心管中，用臺式離心機12000轉/分離心5分鐘，棄上清液；B.加入1.0mL滅菌雙蒸水，混勻，用臺式離心機12000轉/分離心5分鐘，棄上清液；C.加入100uL滅菌雙蒸水，混勻，100℃沸水浴10分鐘；D.用臺式離心機12000轉/分離心10分鐘，取上清液至一個新的1.5mL離心管中，即為待檢模板DNA。
(2)河流弧菌的環介導等溫擴增A.在裝有23uLLAMP反應液A的反應管中加入1uL待檢模板DNA，於恆溫金屬浴上95℃放置5分鐘，立即置於冰上1分鐘；B.在反應管中加入1uL Bst DNA聚合酶B；C.於恆溫金屬浴上65℃放置1小時；
D.將金屬浴調到80℃中止反應，3分鐘後取出。
(3)顯色檢測在反應管中加入1uL顯色劑C，直接用肉眼觀察顏色變化，如果顏色為黃色，說明待檢細菌不是河流弧菌，如顏色變為綠色，則說明樣品為河流弧菌。
權利要求
1.一種用環介導等溫擴增方法檢測副溶血弧菌的試劑盒，其試劑包括(1)環介導等溫擴增反應液A含有10×Thermopol反應緩衝液、300-500uM dNTP、2-4mM硫酸鎂、0.8-1.2uM上遊內引物、0.8-1.2uM下遊內引物、0.2-0.3uM上遊外引物、0.2-0.3uM下遊外引物和1-1.5M甜菜鹼；其中10×Thermopol反應緩衝液含有200mM pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100mM氯化鉀、100mM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1％曲拉通X-100；上遊內引物為gtgccttccacatcaccaggattttggtgacctgatcgtcacac；下遊內引物為tccgcagtgactggtcgagtcttttgaagccttggctgacttgg；上遊外引物為tcctgcaagacgaaatggc；下遊外引物為ctcactaaacgtcggtgctc。
2.根據權利要求1中所述的試劑盒，其特徵是，環介導等溫擴增反應液A每管23uL的組成為2.5uL10×Thermopol反應緩衝液、1.0uL 10mM dNTP、1.0uL 20uM上遊內引物、1.0uL 20uM下遊內引物、0.25uL 20uM上遊外引物、0.25uL 20uM下遊外引物、0.5uL 100mM MgSO4、12.5uL 2M甜菜鹼和4uL ddH2O。
3.一種使用權利要求1或2中用環介導等溫擴增方法檢測副溶血弧菌的試劑盒檢測副溶血弧菌的方法，依次包括下列步驟(1)細菌DNA的提取A.取1.0-1.5mL過夜培養的菌液，置於1.5mL離心管中，用臺式離心機10000-12000轉/分離心5-10分鐘，棄上清液；B.加入1.0-1.5mL滅菌雙蒸水，混勻，用臺式離心機10000-12000轉/分離心5-10分鐘，棄上清液；C.加入100-150uL滅菌雙蒸水，混勻，100℃沸水浴10-15分鐘；D.用臺式離心機10000-12000轉/分離心5-10分鐘，取上清液至一個新的1.5mL離心管中，即為待檢模板DNA。(2)副溶血弧菌的環介導等溫擴增A.在裝有23uL環介導等溫擴增反應液A的反應管中加入1uL待檢模板DNA，於恆溫金屬浴上95℃放置3-5分鐘，立即置於冰上1-3分鐘；B.在反應管中加入1uL下遊內引物DNA聚合酶B；C.於恆溫金屬浴上60-65℃放置45-90分鐘；D.將金屬浴調到80-95℃中止反應，3-5分鐘後取出；(3)顯色檢測在反應管中加入1uL顯色劑C，直接用肉眼觀察顏色變化，如果顏色為黃色，說明待檢細菌不是副溶血弧菌，如顏色變為綠色，則說明樣品為副溶血弧菌。
全文摘要
涉及一種用環介導等溫擴增方法檢測河流弧菌的試劑盒及方法，試劑盒包括(1)LAMP反應液A，其中上遊內引物為gtgccttccacatcaccaggattttggtgacctgatcgtcacac；下遊內引物為tccgcagtgactggtcgagtcttttgaagccttggctgacttgg；上遊外引物為tcctgcaagacgaaatggc；下遊外引物為ctcactaaacgtcggtgctc；(2)BstDNA聚合酶B；(3)顯色劑C；檢測方法包括細菌DNA的提取、河流弧菌的環介導等溫擴增、顯色檢測；優點是快速、特異性強、靈敏度高，且成本低。
文檔編號G01N21/25GK101020922SQ20071002639
公開日2007年8月22日 申請日期2007年1月18日 優先權日2007年1月18日
發明者任春華, 胡超群, 羅鵬, 王青柏 申請人:中國科學院南海海洋研究所