β-腎上腺素受體激動劑多簇抗原及寬譜特異性抗體及其製備方法
2023-10-11 03:52:14 1
β-腎上腺素受體激動劑多簇抗原及寬譜特異性抗體及其製備方法
【專利摘要】本發明公開了用於β-腎上腺素受體激動劑多殘留檢測的多簇抗原、抗體及其製備方法。本發明包括八種β-激動劑多簇抗原，分別為克倫特羅-萊克多巴胺-牛血清白蛋白、克倫特羅-沙丁胺醇-牛血清白蛋白、沙丁胺醇-萊克多巴胺-牛血清白蛋白、克倫特羅-沙丁胺醇-萊克多巴胺-牛血清白蛋白、克倫特羅-萊克多巴胺-卵清蛋白、克倫特羅-沙丁胺醇-卵清蛋白、沙丁胺醇-萊克多巴胺-卵清蛋白及克倫特羅-沙丁胺醇-萊克多巴胺-卵清蛋白，並採用所述的多簇抗原通過動物免疫製備了四種可用於β-腎上腺素受體激動劑多殘留檢測的寬譜特異性抗體。
【專利說明】β-腎上腺素受體激動劑多簇抗原及寬譜特異性抗體及其製備
【技術領域】
[0001]本發明屬於免疫化學和分析【技術領域】，具體涉及一種β-腎上腺素受體激動劑(以下簡稱β-激動劑)多簇抗原及寬譜特異性抗體及其製備。
【背景技術】
[0002]β_腎上腺素受體激動劑，簡稱β_激動劑，是動物源性食品中檢出率最高、危害最嚴重的化學性殘留危害物，其中最著名的就是克倫特羅(clenbuterol，CL)，俗稱「瘦肉精」。上世紀80年代，美國脂胺公司的科研人員意外發現，「瘦肉精」能增強動物脂肪分解，促進蛋白質合成，大大縮短肉品上市周期，顯著提高胴體瘦肉率、飼料回報率和經濟效益。隨後在世界各地迅速推廣，80年代後期，傳入我國並在許多地區的飼料加工企業和養殖業推廣使用，很快成為養殖業應用最廣泛的「添加劑」。
[0003]「瘦肉精」除克倫特羅外，還包括沙丁胺醇(salbutamoI，SAL)、萊克多巴胺(ractopamine, RAC)等20多個結構和性質相類似的化合物。這類化合物進入體內後選擇性作用於腺苷酸環化酶，導致人體產生低敏感現象，哮喘發生率和發病程度升高；還可導致內分泌紊亂，誘發染色體畸變及惡性腫瘤，嚴重時可致人死亡。因此我國和世界上大多數國家都明文禁止「瘦肉精」用作飼料添加劑。
[0004]目前，β-激動劑類獸藥殘留的檢測方法主要包括高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)、酶聯免疫法(ELISA)和螢光免疫法(FIA)等。
[0005]色譜法是β_激動劑獸藥殘留的主要檢測方法，但是色譜法檢測成本高、操作複雜、大量的陰性樣品重複檢測；而酶聯免疫法具有特異性強、樣品前處理簡單等優點，但特異性強的特點同時也決定了它的致命缺點:一種酶聯免疫試劑盒或試紙條只能檢測一種獸藥殘留，而無法檢測其它的同類獸藥殘留，這就是容易出現漏檢的原因(如2011年轟動全國的「雙匯瘦肉精」事件)；此外，隨著β_激動劑多種替代品的出現，如果進行完全檢測，一個樣品需要使用多種檢測產品，大大提高了檢測成本和工作時間，失去了快速篩選的意義。
[0006]多殘留免疫分析能同時檢測一類藥物殘留，其低成本、高通量、快速現場的優點是現有的色譜法和特異性免疫方法無法比擬的，是未來食品安全檢測領域的關鍵技術之一，逐漸引起人們的重視。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在於提供一種β -腎上腺素受體激動劑多簇抗原及寬譜特異性抗體及其製備方法。
[0008]本發明採用以下技術方案:
[0009]一種β_腎上腺素受體激動劑多簇抗原，其特徵在於，所述的多簇抗原是兩種以上β_腎上腺素受體激動劑與載體蛋白的偶聯物，所述的載體蛋白為牛血清白蛋白或卵清蛋白，所述的β-腎上腺素受體激動劑選自克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺。
[0010]本發明所述的多簇抗原是在載體蛋白上，依次偶聯兩種以上的β -腎上腺素受體激動劑半抗原得到，半抗原選自克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺，其中克倫特羅半抗原採用重氮法偶聯，沙丁胺醇和萊克多巴胺採用混合酸酐法偶聯。
[0011]本發明所述多簇抗原包括八種β -激動劑多簇抗原，具體為克倫特羅-萊克多巴胺-牛血清白蛋白(CL-RAC-BSA)、克倫特羅-沙丁胺醇-牛血清白蛋白(CL-SAL-BSA)、沙丁胺醇-萊克多巴胺-牛血清白蛋白(SAL-RAC-BSA)、克倫特羅-沙丁胺醇-萊克多巴胺-牛血清白蛋白(CL-SAL-RAC-BSA)、克倫特羅-萊克多巴胺-卵清蛋白(CL-RAC-OVA)、克倫特羅-沙丁胺醇-卵清蛋白(CL-SAL-OVA)、沙丁胺醇-萊克多巴胺-卵清蛋白(SAL-RAC-0VA)及克倫特羅-沙丁胺醇-萊克多巴胺-卵清蛋白(CL-SAL-RAC-0VA)。
[0012]其中，克倫特羅-沙丁胺醇-牛血清白蛋白(CL-SAL-BSA)或克倫特羅-沙丁胺醇-卵清蛋白(CL-SAL-OVA)是以克倫特羅和沙丁胺醇為半抗原，以牛血清白蛋白或卵清蛋白為載體，按以下步驟製備得到:
[0013]I)在牛血清白蛋白或卵清蛋白上以重氮法偶聯克倫特羅半抗原，再進行純化:
[0014]將0.2mmol鹽酸克倫特羅於溶於I?5ml稀鹽酸中，緩慢加入0.2?2mol/L的亞硝酸鈉溶液至澱粉碘化鉀試紙變為紫色，繼續反應I?3h後將反應液緩慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml載體蛋白的碳酸鈉緩衝溶液中，再繼續反應3?5h。將上述反應液用磷酸緩衝溶液透析3?6次，冷凍乾燥即可得到克倫特羅-載體蛋白偶聯物凍乾粉。
[0015]2)在步驟I)的產物上以混合酸酐法偶聯沙丁胺醇半抗原，再進行純化:
[0016]將0.2mmol硫酸沙丁胺醇溶於5?1ml無水乙醇中，加入0.2mmol戍二酸酐,室溫下反應3?5h,離心。將下層固體溶於5?1ml N, N-二甲基甲醯胺,加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯,繼續反應I?3h。將上述反應液緩慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml克倫特羅-載體蛋白偶聯物的磷酸緩衝溶液中，室溫反應過夜。將上述反應液用磷酸緩衝溶液透析3?6次，冷凍乾燥即可得到克倫特羅-沙丁胺醇-載體蛋白偶聯物凍乾粉。
[0017]克倫特羅-萊克多巴胺-牛血清白蛋白(CL-RAC-BSA)或克倫特羅-萊克多巴胺-卵清蛋白(CL-RAC-OVA)是以克倫特羅和萊克多巴胺為半抗原，以牛血清白蛋白或卵清蛋白為載體，按以下步驟製備得到:
[0018]I)在牛血清白蛋白或卵清蛋白上以混合酸酐法偶聯萊克多巴胺半抗原，再進行純化:
[0019]將0.2mmol戊二酸酐溶於5ml吡啶中，加入0.2mmol鹽酸萊克多巴胺，室溫反應10?20h，蒸乾溶劑，將所得油狀物溶於5?1ml N, N- 二甲基甲醯胺，加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯，繼續反應I?3h。將上述反應液緩慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml載體蛋白的磷酸緩衝溶液中，室溫反應過夜。將上述反應液用磷酸緩衝溶液透析3?6次，冷凍乾燥即可得到萊克多巴胺-載體蛋白偶聯物凍乾粉。
[0020]2)在步驟I)的產物上以重氮法偶聯克倫特羅半抗原，再進行純化:
[0021]將0.2mmol鹽酸克倫特羅於溶於I?5ml稀鹽酸中，緩慢加入0.2?2mol/L的亞硝酸鈉溶液至澱粉碘化鉀試紙變為紫色，繼續反應I?3h後將反應液緩慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml萊克多巴胺-載體蛋白偶聯物的碳酸鈉緩衝溶液中，再繼續反應3?5h。將上述反應液用磷酸緩衝溶液透析3?6次，冷凍乾燥即可得克倫特羅-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯物凍乾粉。
[0022]沙丁胺醇-萊克多巴胺-牛血清白蛋白(SAL-RAC-BSA)或沙丁胺醇-萊克多巴胺-卵清蛋白(SAL-RAC-0VA)是以沙丁胺醇和萊克多巴胺為半抗原，以牛血清白蛋白或卵清蛋白為載體，按以下步驟製備得到:
[0023]I)在牛血清白蛋白或卵清蛋白上以混合酸酐法偶聯沙丁胺醇半抗原，再進行純化:
[0024]將0.2mmol硫酸沙丁胺醇溶於5?1ml無水乙醇中，加入0.2 mmol戍二酸酐,室溫下反應3?5h,離心。將下層固體溶於5?1ml N, N-二甲基甲醯胺,加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯,繼續反應I?3h。將上述反應液緩慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml載體蛋白的磷酸緩衝溶液中，室溫反應過夜。將上述反應液用磷酸緩衝溶液透析3?6次，冷凍乾燥即可得到沙丁胺醇-載體蛋白偶聯物凍乾粉。
[0025]2)在步驟I)的產物上繼續以混合酸酐法偶聯萊克多巴胺半抗原，再進行純化:
[0026]將0.2mmol戊二酸酐溶於5ml吡啶中，加入0.2 mmol鹽酸萊克多巴胺，室溫反應10?20h，蒸乾溶劑，將所得油狀物溶於5?1ml N, N-二甲基甲醯胺，加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯，繼續反應I?3h。將上述反應液緩慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml沙丁胺醇-載體蛋白偶聯物的磷酸緩衝溶液中，室溫反應過夜。將上述反應液用磷酸緩衝溶液透析3?6次，冷凍乾燥即可得到沙丁胺醇-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯物凍乾粉。
[0027]克倫特羅-沙丁胺醇-萊克多巴胺-牛血清白蛋白(CL-SAL-RAC-BSA)或克倫特羅-沙丁胺醇-萊克多巴胺-卵清蛋白(CL-SAL-RAC-OVA)是以克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺為半抗原，以牛血清白蛋白或卵清蛋白為載體，可按以下步驟中任意一種製備得到:
[0028]I)在克倫特羅-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯物上以混合酸酐法偶聯沙丁胺醇，再進行純化:
[0029]將0.2mmol硫酸沙丁胺醇溶於5?1ml無水乙醇中，加入0.2mmol戍二酸酐,室溫下反應3?5h,離心。將下層固體溶於5?1ml N, N-二甲基甲醯胺,加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯，繼續反應I?3h。將上述反應液緩慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml克倫特羅-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯物的磷酸緩衝溶液中，室溫反應過夜。將上述反應液用磷酸緩衝溶液透析3?6次，冷凍乾燥即可得到克倫特羅-沙丁胺醇-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯物凍乾粉。
[0030]2)在克倫特羅-沙丁胺醇-載體蛋白偶聯物上以混合酸酐法偶聯萊克多巴胺，再進行純化:
[0031]將0.2mmol戊二酸酐溶於5ml吡啶中，加入0.2mmol鹽酸萊克多巴胺，室溫反應10?20h，蒸乾溶劑，將所得油狀物溶於5?1ml N, N- 二甲基甲醯胺，加入0.2mmol三正丁胺和0.2 mmol氯甲酸異丁酯，繼續反應I?3h。將上述反應液緩慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml克倫特羅-沙丁胺醇-載體蛋白偶聯物的磷酸緩衝溶液中，室溫反應過夜。將上述反應液用磷酸緩衝溶液透析3?6次，冷凍乾燥即可得到克倫特羅-沙丁胺醇-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯物凍乾粉。
[0032]3)在沙丁胺醇-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯物上以重氮法偶聯克倫特羅，再進行純化:
[0033]將0.2mmol鹽酸克倫特羅於溶於I?5ml稀鹽酸中，緩慢加入0.2?2mol/L的亞硝酸鈉溶液至澱粉碘化鉀試紙變為紫色，繼續反應I?3h,將反應液緩慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml沙丁胺醇-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯物的磷酸緩衝溶液中，室溫反應過夜。將上述反應液用磷酸緩衝溶液透析3?6次，冷凍乾燥即可得到克倫特羅-沙丁胺醇-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯物凍乾粉。
[0034]本發明還提供了所述的多簇抗原製得的β -腎上腺素受體激動劑寬譜特異性抗體；特別是四種β_激動劑寬譜特異性抗體，所述寬譜特異性抗體分別為由β_腎上腺素受體激動劑多簇抗原 CL-RAC-BSA、CL-SAL-BSA, SAL-RAC-BSA 或 CL-SAL-RAC-BSA 通過動物免疫獲得的。
[0035]本發明的有益效果:本發明成功地合成了八種β_激動劑多簇抗原，並基於動物免疫方法製備得到β_激動劑寬譜特異性抗體。所述的β_激動劑多簇抗原可用於構造免疫電化學傳感器，基於β_激動劑寬譜特異性抗體對β_激動劑的交叉免疫反應，能實現對包括克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、特步他林、馬布特羅及妥布特羅在內的多種β_激動劑的檢測。由於採用的β_激動劑寬譜特異性抗體對多種β_激動劑都具有較高交叉反應率，因而能實現對β_激動劑的共同檢測，且多殘留免疫分析具有快速、高效、靈敏度高的優點。
[0036]下面結合具體實施例對本發明進行詳細描述。本發明的保護範圍並不以【具體實施方式】為限，而是由權利要求加以限定。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0037]圖1為CL、BSA以及CL-BSA偶聯物的紫外可見光譜圖。
[0038]圖2為SAL、CL-BSA偶聯物以及CL-SAL-BSA偶聯物的紫外可見光譜圖。
[0039]圖3為SAL、BSA以及SAL-BSA偶聯物的紫外可見光譜圖。
[0040]圖4為RAC、SAL-BSA偶聯物以及SAL-RAC-BSA偶聯物的紫外可見光譜圖。
[0041]圖5為RAC、OVA以及RAC-OVA偶聯物的紫外可見吸收光譜圖。
[0042]圖6為CL、RAC-OVA偶聯物以及CL-RAC-OVA偶聯物的紫外可見吸收光譜圖。
[0043]圖7為SAL、CL-RAC-OVA偶聯物以及CL-SAL-RAC-OVA偶聯物的紫外可見吸收光譜圖。
【具體實施方式】
[0044]實施例1CL-SAL-BSA偶聯物的製備
[0045]I)在BSA上以重氮法偶聯CL半抗原，再進行純化:
[0046]將0.2mmol鹽酸克倫特羅於溶於I?5ml稀鹽酸中，緩慢加入0.2?2mol/L的亞硝酸鈉溶液至澱粉碘化鉀試紙變為紫色，繼續反應I?3h後將反應液緩慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml BSA的碳酸鈉緩衝溶液中，再繼續反應3?5h。將上述反應液用磷酸緩衝溶液透析3?6次，冷凍乾燥即可得到CL-BSA偶聯物凍乾粉。根據CL、BSA以及CL-BSA偶聯物的紫外可見吸收光譜圖(見附圖1)計算可得偶聯比，BSA: CL=1: 28。
[0047]2)在步驟I)的產物上以混合酸酐法偶聯SAL半抗原，再進行純化:
[0048]將0.2mmol硫酸沙丁胺醇溶於5?1ml無水乙醇中，加入0.2mmol戍二酸酐,室溫下反應3?5h,離心。將下層固體溶於5?1ml N, N-二甲基甲醯胺,加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯，繼續反應I?3h。將上述反應液緩慢加入到5?1ml含有5?10mg/mlCL-BSA偶聯物的磷酸緩衝溶液中，室溫反應過夜。將上述反應液用磷酸緩衝溶液透析3?6次，冷凍乾燥即可得到CL-SAL-BSA偶聯物凍乾粉。根據SAL、CL_BSA偶聯物以及CL-SAL-BSA偶聯物的紫外可見吸收光譜圖(見附圖2)計算可得偶聯比，BSA: CL: SAL=1: 28: 17。
[0049]實施例2SAL-RAC-BSA偶聯物的製備
[0050]I)在BSA上以混合酸酐法偶聯SAL半抗原，再進行純化:
[0051]將0.2 mmol硫酸沙丁胺醇溶於5?1ml無水乙醇中，加入0.2mmol戍二酸酐,室溫下反應3?5h,離心。將下層固體溶於5?1ml N, N-二甲基甲醯胺,加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯,繼續反應I?3h。將上述反應液緩慢加入到5?1ml含有5?10mg/mlBSA的磷酸緩衝溶液中，室溫反應過夜。將上述反應液用磷酸緩衝溶液透析3?6次，冷凍乾燥即可得到SAL-BSA偶聯物凍乾粉。根據SAL、BSA以及SAL-BSA偶聯物的紫外可見吸收光譜圖(見附圖3)計算可得偶聯比，BSA: SAL = I: 8.5。
[0052]2)在步驟I)的產物上繼續以混合酸酐法偶聯RAC半抗原，再進行純化:
[0053]將0.2mmol戊二酸酐溶於5ml吡啶中，加入0.2mmol鹽酸萊克多巴胺，室溫反應10?20h，蒸乾溶劑，將所得油狀物溶於5?1ml N, N- 二甲基甲醯胺，加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯，繼續反應I?3h。將上述反應液緩慢加入到5?1ml含有5?1mg/mlSAL-BSA偶聯物的磷酸緩衝溶液中，室溫反應過夜。將上述反應液用磷酸緩衝溶液透析3?6次，冷凍乾燥即可得到SAL-RAC-BSA偶聯物凍乾粉。根據RAC、SAL-BSA偶聯物以及SAL-RAC-BSA偶聯物的紫外可見吸收光譜圖(見附圖4)計算可得偶聯比，BSA: SAL:RAC = 1: 8.5: 30。
[0054]實施例3CL-RAC-0VA偶聯物的製備
[0055]I)在OVA上以混合酸酐法偶聯RAC半抗原，再進行純化:
[0056]將0.2mmol戊二酸酐溶於5ml吡啶中，加入0.2mmol鹽酸萊克多巴胺，室溫反應10?20h，蒸乾溶劑，將所得油狀物溶於5?1ml N, N- 二甲基甲醯胺，加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯，繼續反應I?3h。將上述反應液緩慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml0VA的磷酸緩衝溶液中，室溫反應過夜。將上述反應液用磷酸緩衝溶液透析3?6次，冷凍乾燥即可得到RAC-OVA偶聯物凍乾粉。根據RAC、OVA以及RAC-OVA偶聯物的紫外可見吸收光譜圖(見附圖5)計算可得偶聯比，OVA =RAC= I: 20。
[0057]2)在步驟I)的產物上以重氮法偶聯CL半抗原，再進行純化:
[0058]將0.2mmol鹽酸克倫特羅於溶於I?5ml稀鹽酸中，緩慢加入0.2?2mol/L的亞硝酸鈉溶液至澱粉碘化鉀試紙變為紫色，繼續反應I?3h後將反應液緩慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml RAC-OVA偶聯物的碳酸鈉緩衝溶液中，再繼續反應3?5h。將上述反應液用磷酸緩衝溶液透析3?6次，冷凍乾燥即可得CL-RAC-OVA偶聯物凍乾粉。根據CL、RAC-OVA偶聯物以及CL-RAC-OVA偶聯物的紫外可見吸收光譜圖(見附圖6)計算可得偶聯比，OVA: RAC: CL = I: 20: 16。
[0059]實施例4CL-SAL-RAC-0VA偶聯物的製備
[0060]將0.2mmol硫酸沙丁胺醇溶於5?1ml無水乙醇中，加入0.2mmol戍二酸酐,室溫下反應3?5h,離心。將下層固體溶於5?1ml N, N-二甲基甲醯胺,加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯，繼續反應I?3h。將反應液緩慢加入到5?1ml含有5?I Omg/ml CL-RAC-OVA偶聯物的磷酸緩衝溶液中，室溫反應過夜。將上述反應液用磷酸緩衝溶液透析3?6次，冷凍乾燥即可得到CL-SAL-RAC-OVA偶聯物凍乾粉。根據SAL、CL-RAC-OVA偶聯物以及CL-SAL-RAC-OVA偶聯物的紫外可見吸收光譜圖(見附圖7)計算可得偶聯比，OVA:RAC: CL: SAL = I: 20: 16: 21。
[0061]按照與實施例1-4相似的方法可分別製備CL-RAC-BSA、CL-SAL-OVA、SAL-RAC-0VA和 CL-SAL-RAC-BSA 偶聯物。
[0062]實施例5 抗 CL-RAC-BSA、抗 CL-SAL-BSA、抗 SAL-RAC-BSA 以及抗 CL-SAL-RAC-BSA抗體的製備
[0063]用合成的偶聯物(CL-RAC-BSA、CL-SAL-BSA、SAL-RAC-BSA或 CL-SAL-RAC-BSA 中的一種)作為免疫原免疫體重約2kg的健康大白兔。首次免疫時將0.25mg免疫原與等量弗氏完全佐劑混合併充分乳化，背部皮下多點注射。兩周後用同樣劑量免疫原與等量弗氏不完全佐劑進行乳化並進行加強免疫，每兩周加強免疫一次，共加強三次。最後一次免疫10天後對大白兔進行頸靜脈採血，放在4°C環境下靜置30min，再用硫酸銨多級沉澱法進行純化，即可得到抗 CL-RAC-BSA、抗 CL-SAL-BSA、抗 SAL-RAC-BSA 以及抗 CL-SAL-RAC-BSA 多克隆抗體。
[0064]實施例6抗體效價測定
[0065]將純化後的的血清稀釋不同的倍數，用間接ELISA法分別對抗CL-RAC-BSA、抗CL-SAL-BSA、抗SAL-RAC-BSA以及抗CL-SAL-RAC-BSA抗體進行效價測定，結果如下:
[0066]CL-SAL-BSA抗血清的效價為1: 1600，CL-SAL-RAC-BSA的抗血清效價為I: 6400，CL-RAC-BSA 抗血清的效價為 I: 12800，SAL-RAC-BSA 的抗血清效價為 I: 3200。
【權利要求】
1.一種β-腎上腺素受體激動劑多簇抗原，其特徵在於，所述的多簇抗原是兩種以上β-腎上腺素受體激動劑與載體蛋白的偶聯物，所述的載體蛋白為牛血清白蛋白或卵清蛋白，所述的β -腎上腺素受體激動劑選自克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺。
2.根據權利要求1所述的β_腎上腺素受體激動劑多簇抗原，其特徵在於:系克倫特羅-沙丁胺醇-牛血清白蛋白或克倫特羅-沙丁胺醇-卵清蛋白偶聯物，以克倫特羅和沙丁胺醇為半抗原，以牛血清白蛋白或卵清蛋白為載體，按以下步驟製備得到: 1)在牛血清白蛋白或卵清蛋白上以重氮法偶聯克倫特羅半抗原，再進行純化: 將0.2mmol鹽酸克倫特羅於溶於I?5ml稀鹽酸中，加入0.2?2mol/L的亞硝酸鈉溶液至澱粉碘化鉀試紙變為紫色，繼續反應I?3h後將反應液加入到5?1ml含有5?10mg/ml載體蛋白的碳酸鈉緩衝溶液中，再繼續反應3?5h ;將上述反應液用磷酸緩衝溶液透析3?6次，冷凍乾燥即可得到克倫特羅-載體蛋白偶聯物凍乾粉； 2)在步驟I)的產物上以混合酸酐法偶聯沙丁胺醇半抗原，再進行純化: 將0.2mmol硫酸沙丁胺醇溶於5?1ml無水乙醇中，加入0.2mmol戍二酸酐,室溫下反應3?5h,離心,將下層固體溶於5?1ml N,N- 二甲基甲醯胺,加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯，繼續反應I?3h ;將上述反應液加入到5?1ml含有5?1mg/ml克倫特羅-載體蛋白偶聯物的磷酸緩衝溶液中，室溫反應過夜；將上述反應液用磷酸緩衝溶液透析3?6次，冷凍乾燥即可得到克倫特羅-沙丁胺醇-載體蛋白偶聯物凍乾粉。
3.根據權利要求1所述的β_腎上腺素受體激動劑多簇抗原，其特徵在於:系克倫特羅-萊克多巴胺-牛血清白蛋白或克倫特羅-萊克多巴胺-卵清蛋白偶聯物，以克倫特羅和萊克多巴胺為半抗原，以牛血清白蛋白或卵清蛋白為載體，按以下步驟製備得到: 1)在牛血清白蛋白或卵清蛋白上以混合酸酐法偶聯萊克多巴胺半抗原，再進行純化: 將0.2mmol戊二酸酐溶於5ml吡啶中，加入0.2mmol鹽酸萊克多巴胺，室溫反應10?20h，蒸乾溶劑，將所得油狀物溶於5?1ml N，N-二甲基甲醯胺，加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯，繼續反應I?3h ;將上述反應液加入到5?1ml含有5?10mg/ml載體蛋白的磷酸緩衝溶液中，室溫反應過夜；將上述反應液用磷酸緩衝溶液透析3?6次，冷凍乾燥即可得到萊克多巴胺-載體蛋白偶聯物凍乾粉； 2)在步驟I)的產物上以重氮法偶聯克倫特羅半抗原，再進行純化: 將0.2mmol鹽酸克倫特羅於溶於I?5ml稀鹽酸中，加入0.2?2mol/L的亞硝酸鈉溶液至澱粉碘化鉀試紙變為紫色，繼續反應I?3h後將反應液加入到5?1ml含有5?10mg/ml萊克多巴胺-載體蛋白偶聯物的碳酸鈉緩衝溶液中，再繼續反應3?5h ;將上述反應液用磷酸緩衝溶液透析3?6次，冷凍乾燥即可得克倫特羅-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯物凍乾粉。
4.根據權利要求1所述的β_腎上腺素受體激動劑多簇抗原，其特徵在於:系沙丁胺醇-萊克多巴胺-牛血清白蛋白或沙丁胺醇-萊克多巴胺-卵清蛋白偶聯物，以沙丁胺醇和萊克多巴胺為半抗原，以牛血清白蛋白或卵清蛋白為載體，按以下步驟製備得到: I)在牛血清白蛋白或卵清蛋白上以混合酸酐法偶聯沙丁胺醇半抗原，再進行純化: 將0.2mmol硫酸沙丁胺醇溶於5?1ml無水乙醇中，加入0.2mmol戍二酸酐,室溫下反應3?5h,離心,將下層固體溶於5?1ml N,N- 二甲基甲醯胺,加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯，繼續反應I?3h ;將上述反應液加入到5?1ml含有5?10mg/ml載體蛋白的磷酸緩衝溶液中，室溫反應過夜；將上述反應液用磷酸緩衝溶液透析3?6次，冷凍乾燥即可得到沙丁胺醇-載體蛋白偶聯物凍乾粉； 2)在步驟I)的產物上繼續以混合酸酐法偶聯萊克多巴胺半抗原，再進行純化: 將0.2mmol戊二酸酐溶於5ml吡啶中，加入0.2mmol鹽酸萊克多巴胺，室溫反應10?20h，蒸乾溶劑，將所得油狀物溶於5?1ml N，N-二甲基甲醯胺，加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯，繼續反應I?3h ;將上述反應液加入到5?1ml含有5?1mg/ml沙丁胺醇-載體蛋白偶聯物的磷酸緩衝溶液中，室溫反應過夜；將上述反應液用磷酸緩衝溶液透析3?6次，冷凍乾燥即可得到沙丁胺醇-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯物凍乾粉。
5.根據權利要求1所述的β-腎上腺素受體激動劑多簇抗原，其特徵在於:系克倫特羅-沙丁胺醇-萊克多巴胺-牛血清白蛋白或克倫特羅-沙丁胺醇-萊克多巴胺-卵清蛋白偶聯物，以克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺為半抗原，以牛血清白蛋白或卵清蛋白為載體，按以下任意一種方法製備得到: 1)在克倫特羅-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯物上以混合酸酐法偶聯沙丁胺醇，再進行純化: 將0.2mmol硫酸沙丁胺醇溶於5?1ml無水乙醇中，加入0.2mmol戍二酸酐,室溫下反應3?5h,離心,將下層固體溶於5?1ml N,N- 二甲基甲醯胺,加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯，繼續反應I?3h ;將上述反應液加入到5?1ml含有5?10mg/ml克倫特羅-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯物的磷酸緩衝溶液中，室溫反應過夜；將上述反應液用磷酸緩衝溶液透析3?6次，冷凍乾燥即可得到克倫特羅-沙丁胺醇-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯物凍乾粉； 2)在克倫特羅-沙丁胺醇-載體蛋白偶聯物上以混合酸酐法偶聯萊克多巴胺，再進行純化: 將0.2mmol戊二酸酐溶於5ml吡啶中，加入0.2mmol鹽酸萊克多巴胺，室溫反應10?20h，蒸乾溶劑，將所得油狀物溶於5?1ml N，N-二甲基甲醯胺，加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯，繼續反應I?3h ;將上述反應液加入到5?1ml含有5?10mg/ml克倫特羅-沙丁胺醇-載體蛋白偶聯物的磷酸緩衝溶液中，室溫反應過夜；將上述反應液用磷酸緩衝溶液透析3?6次，冷凍乾燥即可得到克倫特羅-沙丁胺醇-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯物凍乾粉； 3)在沙丁胺醇-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯物上以重氮法偶聯克倫特羅，再進行純化: 將0.2mmol鹽酸克倫特羅於溶於I?5ml稀鹽酸中，緩慢加入0.2?2mol/L的亞硝酸鈉溶液至澱粉碘化鉀試紙變為紫色，繼續反應I?3h，將反應液加入到5?1ml含有5?10mg/ml沙丁胺醇-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯物的磷酸緩衝溶液中，室溫反應過夜；將上述反應液用磷酸緩衝溶液透析3?6次，冷凍乾燥即可得到克倫特羅-沙丁胺醇-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯物凍乾粉。
6.根據權利要求1所述的多簇抗原製得的β_腎上腺素受體激動劑寬譜特異性抗體。
7.根據權利要求6所述的β_腎上腺素受體激動劑寬譜特異性抗體，其特徵在於，所述的寬譜特異性抗體由β -腎上腺素受體激動劑多簇抗原CL-RAC-BSA、CL-SAL-BSA、SAL-RAC-BSA或CL-SAL-RAC-BSA通過動物免疫獲得。
【文檔編號】G01N33/531GK104280541SQ201410563668
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年10月21日 優先權日:2014年10月21日
【發明者】邵科峰, 趙波, 張紅琳, 任鵬飛, 常其沛 申請人:南京師範大學