一種新的酯酶及其編碼基因和應用的製作方法

2023-10-11 20:03:44

一種新的酯酶及其編碼基因和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種新的酯酶及其編碼基因和應用。酯酶EST04211，其胺基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。酯酶EST04211的基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發明從來源於印度洋深海的芽孢桿菌SCSIO15121中克隆到一個新的酯酶，該酯酶的最大特點是，在30℃條件下催化異丁酸乙酯合成的酯化率為97％，並且在相似條件下還可以催化丙酸、丁酸、戊酸、己酸與乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇合成丙酸乙酯、丙酸丙酯、丙酸丁酯等相應的短鏈芳香酯類香料，酯化率大部分達到85％～95％。該酯酶可應用於異丁酸乙酯等短鏈芳香酯類香料的工業化生物製造，這些酯類香料品質高，屬於天然產物，可應用於食品、香菸、日化產品等生產行業。
【專利說明】一種新的酯酶及其編碼基因和應用

【技術領域】：
[0001] 本發明屬於基因工程和生物催化【技術領域】，具體涉及一種來自印度洋深海芽孢杆 菌屬的酯酶基因，該基因表達的酯酶，以及該酯酶可以用於異丁酸乙酯的生物製造。

【背景技術】：
[0002] 異丁酸乙酯作為《食品添加劑使用標準》規定允許使用的食用香料，主要用於配製 奶油及草莓、櫻桃等所有水果型香精，也可用於香菸、日化產品或其它產品的香原料，同時 也是一種優良的有機溶劑。工業上生產異丁酸乙酯的方法主要是使異丁酸和乙醇直接酯 化，一直沿用強酸（如濃硫酸、對甲苯磺酸等）作催化劑。儘管強酸作為酯化合成催化劑具 有理想的催化活性且價格低廉，但強酸易使有機物碳化和氧化，且具有選擇性差、產品色澤 深、能耗高、副反應多、對設備腐蝕嚴重和汙染環境等缺點。因此，國內外都在探索代替強酸 的新型催化劑，其中生物催化劑（酶）是人們最為關注的類型之一。酶在工業生產中具有 很大的優勢，能在常溫常壓下反應，反應速率快，催化作用專一，無汙染，價格較低等。
[0003] 酯酶（Esterase)是一種能催化酯鍵水解和合成的酶的總稱，在催化酯鍵水解時 產生甘油和脂肪酸；在催化酸的羧基與醇的羥基進行脫水縮合反應時則產生酯類等香味物 質。酯酶廣泛的存在於動物、植物和微生物中，其中動物胰臟酯酶和微生物酯酶是酯酶的主 要來源。目前酯酶已經被廣泛的應用於食品釀造、農業、醫藥化學、製漿造紙工業、汙水處理 和生物修復等領域。另一方面，酯酶不僅在異相系統（油-水界面）中發生作用，而且有些 酯酶在有機相中也能起催化作用，被廣泛應用於酯類合成。目前，在有機介質中酯酶催化相 應的酸和醇合成辛酸乙酯、丁酸乙酯、丁酸丁酯和戊酸乙酯已有相關的報導。在食品加工方 面，固定化的酯酶現在已被用於芳香酯的合成，比如利用酯酶製備的呈天然水果味的低分 子量芳香酯。
[0004] 目前有關異丁酸乙酯的合成報導主要涉及傳統的強酸催化法，對生物催化法暫未 見報導。


【發明內容】
：
[0005] 本發明的第一個目的是提供一種來源於印度洋深海的芽孢桿菌（Bacillus sp.) SCSI015121的新的酯酶。
[0006] 本發明的新的酯酶，其特徵在於，其胺基酸序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0007] 本發明的第二個目的是提供一種編碼上述酯酶的基因，其特徵在於，其核苷酸序 列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 本發明的第三個目的是提供上述酯酶在催化酸的羧基與醇的羥基進行脫水縮合 反應產生酯類中的應用。
[0009] 優選，是催化乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸分別與乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己 醇合成相應的脂類中的應用。
[0010] 在合成反應體系中，所述的乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸或庚酸，與乙醇、丙醇、丁 醇、戊醇或己醇的物質的量之比為1:1. 5,所述的底物酸的濃度為200mM，合成反應溫度為 30°C，酯酶EST04211的使用量為30g/L的條件下，合成相應的短鏈芳香酯類香料，酯化率大 部分達到85 %?95%。
[0011] 進一步優選，是催化異丁酸和乙醇合成異丁酸乙酯中的應用。
[0012] 本發明的第四個目的是提供一種異丁酸乙酯的合成方法，其特徵在於，以上述酯 酶為催化酶，以異丁酸和乙醇作為底物，以正己烷為介質，催化生成異丁酸乙酯。
[0013] 在反應體系中，所述的異丁酸和乙醇的最佳物質的量之比為1:1. 5,所述的底物異 丁酸的最適濃度為200mM，合成反應最適溫度為30°C，酯酶的最佳使用量為30g/L。
[0014] 本發明的酯酶EST04211，水解活性最高的底物為對硝基苯基丁酸酯（P-NP C4)，其 次為對硝基苯基己酸酯（P-NP C6)與對硝基苯基乙酸酯（p-NP C2)。反應的最適pH值為 8. 0,在pH = 8. 0?10. 0之間具有較高的水解活性。反應的最適溫度為40°C，30?55°C之 間保留有較高的水解活性。
[0015] 本發明的酯酶EST04211經冷凍乾燥製成酶粉後，在有機介質中可應用於異丁酸 乙酯的合成，合成反應以正己烷為介質；底物異丁酸和乙醇的最佳摩爾比為1:1. 5 ;在確定 底物摩爾比後，底物異丁酸的最適濃度為200mM ;合成反應的最適溫度為30°C ;合成反應中 催化劑EST04211的最佳使用量為30g/L ;在最適合成條件下，獲得的最高酯化率為97%，初 始合成速率為31mmol L^T1。
[0016] 本發明從來源於印度洋深海的芽孢桿菌（Bacillus sp.)SCSI015121中克隆到一 個新的酯酶，該酯酶能夠催化異丁酸和乙醇合成異丁酸乙酯，與傳統的化學合成相比具有 反應條件溫和、生產能耗低、產品質量好和無汙染的優點，因此可將其用於異丁酸乙酯的合 成，通過酶催化在溫和的條件下合成、製備異丁酸乙酯，對產品的純度、產品的質量、生產能 耗和環境保護等均具有明顯的優勢，這種異丁酸乙酯品質高，屬於天然產物，可應用於食 品、香菸和日化產品等生產行業，因此具有廣泛的應用前景。本發明提供的酯酶經冷凍幹 燥製成酶粉後，可用於催化乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸分別與乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇 合成丙酸乙酯、丙酸丙酯、丙酸丁酯等相應的短鏈芳香酯類香料，酯化率大部分達到80%? 95%，其餘特徵與應用於異丁酸乙酯的合成相似。同樣該酯酶可應用於相應的短鏈芳香酯 類香料的工業化生物製造，這些酯類香料品質高，屬於天然產物，可應用於食品、香菸、日化 產品等生產行業。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0017] 圖1是酯酶對不同底物P-NP(C2-C12)進行水解分析的圖；
[0018] 圖2是以p-NP C4為底物，在不同pH的緩衝液下分析酯酶EST04211的水解活性 圖；
[0019] 圖3是以P-NP C4為底物，在pH = 8. 0的磷酸鹽緩衝液下分析不同反應溫度對酯 酶EST04211水解活性的影響圖；
[0020] 圖4是在30°C、20g/L EST04211、200mM濃度的異丁酸條件下，分析不同底物摩爾 比對酯酶EST04211酯化率的影響圖；
[0021] 圖5是在3(rC、20g/LEST04211、異丁酸/乙醇=l:1.5條件下，分析不同底物含 量對酯酶EST04211的酯化率的影響圖；
[0022] 圖6是在20g/L EST04211、異丁酸/乙醇=1:1. 5、異丁酸濃度為200mM的條件下， 分析不同反應溫度對酯酶EST04211的酯化率的影響圖；
[0023] 圖7是在異丁酸/乙醇=1:1. 5、異丁酸濃度為200mM、30°C的條件下，分析不同酯 酶EST04211用量對初始反應速率的影響圖。

【具體實施方式】：
[0024] 以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
[0025] 實施例1 :
[0026] 1、芽孢桿菌的分離與鑑定
[0027] 芽孢桿菌（Bacillus sp. )SCSI015121 分離自印度洋（89。29. 22 ' E， 10° 00. C N)-3400米深海泥，培養好的菌體用於總DNA的提取。
[0028] 2、酯酶EST04211基因的克隆、表達及酶粉製備
[0029] 根據全基因組中EST04211基因序列的分析，設計相應引物擴增該基因並連接到 表達載體pET-28a(+)上，然後導入大腸桿菌BL21(DE3)進行高效表達。
[0030] 設計引物如下：上遊引物為 5' ~TGCTAGCCATATGTATGAAACGACTGTCCAAACGTG~3,； 下遊引物為Y ~CGAATTCCTAAACCTGCAGGTTTGAGGCTG~3,，上下遊引物的Y端分別設計了 Ndel和EcoRI酶切位點（下劃線標記部分），以芽孢桿菌（Bacillus sp.) SCSI015121的基 因組DNA為模板，進行PCR擴增，對PCR產物進行測序，上述引物擴增得到的PCR產物的核 苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其含有1476bp的鹼基，命名為酯酶EST04211基因，將其在 ncbi中進行blastx比對分析，表明其與來源Bacillus licheniformis9945A的硝基節基 酯酶（para-nitrobenzyl esterase, GI: 511061542)具有 99 % 的一致性，但是硝基節基酯 酶（para-nitrobenzyl esterase, GI: 511061542)(連結 http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/ protein/511061542)酯酶只是提交的Bacillus licheniformis9945A全基因組序列中的 一個基因的編碼序列，他們根據這株菌中的DNA序列，根據生物信息學知識推測的這個orf 編碼一個酯酶，但是並沒有對這個酯酶的功能進行相應的鑑定，特別是鑑定這個酯酶在催 化製備異丁酸丙酯香料中的應用。酯酶EST04211基因編碼的胺基酸序列如SEQ ID N0. 2 所示，含有491個胺基酸，命名為酯酶EST04211，與GenBank資料庫中GI號為511061542 的硝基節基酯酶（由上述硝基節基酯酶（para-nitrobenzyl esterase, GI :511061542)編 碼的酯酶）具有99%的一致性，不同之處在於酯酶EST04211中第435位胺基酸為A，而 B. licheniformis9945A的硝基苄基酯酶為V。
[0031] 對上述含有酯酶EST04211基因的PCR產物用試劑盒純化回收目的擴增片段，分別 用Ndel和EcoRI酶切含有酯酶EST04211基因的PCR產物（目的擴增片段）和表達質粒 pET-28a (+)，然後將酶切產物進行連接，使酯酶EST04211基因插入到表達質粒pET-28a (+) 中，經測序驗證，確認酯酶EST04211基因插入到表達質粒pET-28a (+)的Ndel和EcoRI位 點之間，由此得到重組表達質粒pET-28a(+)-EST04211。
[0032] 把重組表達質粒pET-28a(+)-EST04211轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)菌株的感受態 細胞中，挑取轉化子於LB液體培養基中，在37°C搖床中培養，當0D_達到0. 8左右時，力口 入IPTG使其終濃度達到0. 5mmol/L，轉置20°C繼續培養20h進行誘導表達。誘導表達培養 好的發酵液離心收集菌體，利用破胞緩衝液洗滌菌體一次，再利用破胞緩衝液重懸菌體後 在冰浴條件下利用超聲波進行破胞，破胞至菌液澄清，llOOOrpm/min離心20分鐘離心收集 上清，所收集的上清液即為粗酶液，可用於純酶與酶粉的製備。粗酶液通過鎳離子親和層析 柱純化後得到純酶（由酯酶EST04211基因編碼的酯酶EST04211，其胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所示）。酶粉直接用粗酶液凍結後，在冷凍乾燥機中製備。
[0033] 3、酯酶EST04211的水解活性分析
[0034] 標準反應體系為lmL，包含0. 5 μ g純酶（酯酶EST04211)，100mM的p-NP酯底物， 100mM的pH = 7. 0的磷酸鹽緩衝液，30°C反應10分鐘，然後利用酶標儀在405nm處檢測底 物的水解情況，並以相對酶活性進行表徵。
[0035] (1)底物特異性分析
[0036] 按照標準反應體系，對不同底物p-NP (C2-C12)進行水解分析，結果如圖1所示。
[0037] 酯酶EST04211水解活性最高的底物為對硝基苯基丁酸酯（p-NP C4)，其次為對硝 基苯基己酸酯（P-NP C6)與對硝基苯基乙酸酯（p-NP C2)。
[0038] (2)最適反應pH值的分析
[0039] 按照標準反應體系，以p-NP C4為底物，在不同pH的緩衝液下分析酯酶EST04211 的水解活性，結果見圖2。
[0040] 酯酶EST04211的最適pH值為8.0,在pH = 8.0?10.0之間具有較高的水解活 性。
[0041] (3)最適反應溫度的分析
[0042] 按照標準反應體系，以p-NP C4為底物，在pH = 8. 0的磷酸鹽緩衝液下分析不同 反應溫度對酯酶EST04211水解活性的影響，結果見圖3。
[0043] 酯酶EST04211的最適溫度為40°C，30?55°C之間保留有較高的水解活性。
[0044] 4、酯酶EST04211催化異丁酸和乙醇生成異丁酸乙酯
[0045] 標準反應體系為10ml，以正己燒為反應介質，在200rpm/min的搖床中，分別試驗 了不同的底物摩爾比（異丁酸/乙醇=1:1-1:2)、不同底物含量（100-400mM)、不同反應溫 度（20-40°C )和酶用量（20-40g/L)對酯化率和反應速率的影響。產物通過GC/MS進行結 構鑑定，酯化率通過酸鹼滴定法測定底物酸的消耗量間接計算得出。
[0046] (1)底物摩爾比對酯化率的分析
[0047] 按照標準反應體系，在30°C、20g/L酯酶EST04211、200mM濃度的異丁酸條件下，分 析不同底物摩爾比對酯化率的影響，結果見圖4,由圖4可以看出，底物異丁酸和乙醇的最 佳摩爾比為1:1. 5。
[0048] (2)底物含量對酯化率的分析
[0049] 按照標準反應體系，在30°C、20g/L酯酶EST04211、摩爾比異丁酸/乙醇=1:1.5 條件下，分析不同底物含量對酯化率的影響，結果見圖5。底物異丁酸的最適濃度為200mM。
[0050] (3)溫度對酯化率的分析
[0051] 按照標準反應體系，在20g/L酯酶EST04211、摩爾比異丁酸/乙醇=l:1.5、異丁 酸濃度為200mM的條件下，分析不同反應溫度對酯化率的影響，結果見圖6,從圖6可以看出 合成反應的最適溫度為30°C。
[0052] (4)酶用量對酯化率的分析
[0053] 按照標準反應體系，在摩爾比異丁酸/乙醇=1:1.5、異丁酸濃度為200禮、301： 的條件下，分析不同酶用量對初始反應速率的影響，結果見圖7。從圖7中可以看出，當酶 用量達到30g/L時，初始反應速率達到最大值，獲得的最高酯化率為97%，初始合成速率為 31mmol L-lh_l〇
[0054] 5、酯酶EST04211催化合成其他短鏈芳香酯類香料
[0055] 標準反應體系為10ml，以正己燒為反應介質，在200rpm/min的搖床中，分別試驗 了不同的底物（乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸分別與乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇），在 摩爾比酸/醇=1:5,酸的含量200mM、30°C和酶用量30g/L的條件下，合成丙酸乙酯、丙酸 丙酯、丙酸丁酯等相應的短鏈芳香酯類香料，酯化率大部分達到80%?95%，結果見表1。
[0056] 表 1
[0057] 乙醇 丙醇 丁醇 戊醇 己醇 乙酸 0 0 5.41 32.5 40,81 丙酸 22.22 47 82 91.30 89.58 66.66 丁酸 95.3 丨 92.09 95.92 92.6H 94.11 戊酸 89.36 86.36 93.62 13.04 8.56 己酸 93.85.10 93.02 26.66 14.89 庚酸 83.33 16.27 27.90
[0058] 以上所述實施方式是為了更好的解釋本發明，而不應該被解釋為限制本發明，所 述內容屬於本發明的主要內容，但並不僅僅限於這些內容。有些可以顯而易見地擴展的內 容雖然並未在說明書中出現，但也應屬於本發明的專利請求範圍。
【權利要求】
1. 一種酯酶EST04211，其特徵在於，其胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. -種編碼權利要求1所述的酯酶EST04211的基因，其特徵在於，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
3. 權利要求1所述的酯酶EST04211在催化酸的羧基與醇的羥基進行脫水縮合反應產 生酯類中的應用。
4. 根據權利要求3所述的應用，其特徵在於，酯酶EST04211在催化乙酸、丙酸、丁酸、戊 酸、己酸、庚酸分別與乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇合成相應的脂類中的應用。
5. 根據權利要求4所述的應用，其特徵在於，在合成反應體系中，所述的乙酸、丙酸、丁 酸、戊酸、己酸或庚酸，與乙醇、丙醇、丁醇、戊醇或己醇的物質的量之比為1:1. 5,所述的底 物酸的濃度為200mM，合成反應溫度為30°C，酯酶EST04211的使用量為30g/L。
6. 根據權利要求5所述的應用，其特徵在於，酯酶EST04211在催化異丁酸和乙醇合成 異丁酸乙酯中的應用。
7. -種異丁酸乙酯的合成方法，其特徵在於，以權利要求1所述的酯酶EST04211為催 化酶，以異丁酸和乙醇作為底物，以正己烷為介質，催化生成異丁酸乙酯。
8. 根據權利要求7所述的合成方法，其特徵在於，在反應體系中，所述的異丁酸和乙醇 的物質的量之比為1:1. 5,所述的底物異丁酸的濃度為200mM，合成反應溫度為30°C，酯酶 EST04211的使用量為30g/L。
【文檔編號】C12R1/07GK104140959SQ201410333182
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年7月14日 優先權日:2014年7月14日
【發明者】胡云峰, 梁甲元, 孫愛君, 張雲, 吳正超, 鄧盾, 李潔, 田新朋 申請人:中國科學院南海海洋研究所